利用X射线晶体学与生物物理技术对具有免疫球蛋白折叠结构的糖蛋白进行表征

该方法有助于解答糖蛋白研究领域中的关键问题，包括蛋白质功能、N-连接聚糖的作用，以及靶向糖蛋白的抗生素的作用机制。该技术的主要优势在于可应用于任何感兴趣的糖蛋白。

促进多种糖蛋白靶标的结构与生物物理表征。本实验操作由本实验室的研究项目协调员 Hong Cui 演示。首先，按照文本方案中所述步骤准备并转染细胞。

在4℃条件下，以6,371 × g离心20分钟收集细胞。保留上清液，然后使用0.22微米滤膜过滤。在台式层析系统中，以每分钟4毫升的流速将过滤后的上清液上样至Ni-NTA柱。

用三到四个柱体积的洗涤缓冲液洗涤层析柱。使用洗脱缓冲液梯度稀释柱中纯化的糖蛋白，同时收集洗脱组分。将含有洗脱峰的组分收集到截留分子量为10千道尔顿的离心过滤装置中。

然后在4,000 × g、4 °C条件下离心15分钟，或直至样品体积浓缩至500 µL。将浓缩后的糖蛋白注入500 µL的样品环中。在4 °C条件下，将糖蛋白上样至预先平衡的FPLC系统中的高效尺寸排阻色谱柱，并同时收集组分。

运行 SDS-PAGE 凝胶以鉴定哪些洗脱组分含有糖蛋白，并收集阳性组分。使用截留分子量为 10 千道尔顿的离心过滤装置，在 4,000 × g 和 4 °C 条件下浓缩纯化的去糖基化 ECD，直至达到所需浓度。测定蛋白浓度后，在 12,000 × g 和 4 °C 条件下离心样品 5 分钟，以去除灰尘及其他污染物。

接下来，从商业化的结晶筛选试剂盒中取出80微升结晶溶液，加入96孔坐滴结晶板的每个储液池孔中。使用结晶机器人将蛋白质溶液分配到结晶板的各孔中，总液滴体积为200纳升，纯化蛋白质与结晶溶液按1:1的比例混合。

此后，用封板膜密封微孔板。将密封好的微孔板转移至平板成像仪中，通过可见光和紫外光进行检测。确定能够产生初始糖蛋白晶体晶核的条件，并按照文本方案中所述进一步优化这些晶体。

将晶体浸入含有20%甘油的母液溶液中进行冷冻保护。然后将晶体装入CryoLoops中。在收集数据前，使用液氮快速冷冻装好的晶体。

在24孔结晶板中获得良好衍射晶体后，配制含有50毫摩尔配体和20毫摩尔Tris（pH 9.0）、150毫摩尔氯化钠的储备溶液。将该配体溶液以不同浓度加入先前制备的含有ECD晶体的液滴中。密封液滴，孵育时间从5分钟至5天不等。

使用光学显微镜观察晶体，以识别其形态上可能发生的任何变化。孵育结束后，使用 CryoLoops 支撑晶体，并在添加了 20% 甘油的母液溶液中进行冷冻保护。开始生物层干涉技术实验前，按照文本方案中的说明，将 10X 动力学缓冲液稀释制备 50 毫米的 1X 动力学缓冲液。

向预润洗板中加入 200 微升该缓冲液。将六根 Ni-NTA 生物传感器转移至该板中，并在缓冲液中水合 10 分钟。接着，将 His 标签 ECD 溶于 1 毫升 1× 动力学缓冲液中，稀释至终浓度为 25 纳克/微升。

然后对纯化的FAB进行系列稀释。现在如图所示，在96孔微孔板中加入试剂，其中B代表1×动力学缓冲液，L代表带His标签的糖蛋白上样，数字表示稀释后的FAB浓度，R代表再生缓冲液。

将水合后的生物传感器转移至含有1X动力学缓冲液的孔中，孵育60秒以进行基线平衡。随后，在1,000 RPM转速下，加入浓度为25纳克/微升的糖蛋白，孵育240秒。最后，将生物传感器重新放回含有1X动力学缓冲液的孔中，再次孵育60秒，以获取第二次基线。

将传感器转移至含有FAB系列稀释液的孔中，孵育180秒。此结合阶段结束后，将生物传感器重新转移回1X动力学缓冲液中，进行180秒的解离步骤。随后，打开分析软件。

在第一个标签页中，导入并选择数据。在第二个标签页的步骤一“数据选择”中，选择传感器。选中参比孔，然后单击右键设置参比孔。

在第二步减法中，选择参比孔。然后，在第三步“对齐Y轴”中，选择基线，并将时间范围设置为从0.1秒到59.8秒。在第四步中，选择步间校正，并对齐至解离相。

然后在第五步中，进行Savitzky-Golay滤波处理，并点击处理数据。切换到第三个选项卡。在第二步中，使用1:1模型进行分析，选择结合与解离，选择全局拟合，并按颜色分组。

右键单击曲线，点击“设置颜色”并将所有曲线设置为所需的颜色。之后，选择拟合曲线。如果数据拟合良好，通过点击“保存报告”导出结果。

针对所有期望的条件重复该实验。在本研究中，CD22 胞外域的多个结构成功克隆至 pHL-sec 表达载体中。随后，这些结构在哺乳动物 HEK293-F 和 HEK293-S 细胞系中过表达。

当每毫升含有约一百万至一百五十万个细胞的培养物中，糖蛋白的表达水平非常相似；而每毫升仅五十万个细胞的培养物中，糖蛋白表达量则明显较低。此后，收集培养物，并通过亲和层析和尺寸排阻层析分离ECD糖蛋白，以纯化所有构建体，使其达到分子大小的均一性。

获得高纯度样品，用于结晶和生物物理研究。在完成这些操作步骤后，还可进行其他方法，如单颗粒电子显微镜技术，以进一步探究全长胞外结构域或蛋白质复合物的三维结构。观看本视频后，您应能够充分掌握如何表达、纯化糖蛋白、其配体及靶向抗体，并对其进行结构与生物物理表征。