用 X 射线晶体学和生物物理技术表征免疫球蛋白折叠的糖蛋白
July 5th, 2018
通过 biolayer 干涉法、等温滴定量热仪和 X 射线晶体学, 我们提出了免疫球蛋白褶皱的生物物理和结构表征方法。
这种方法可以帮助回答糖蛋白领域的关键问题。深入了解蛋白质的功能、N-连接聚糖的作用以及靶向糖蛋白的抗生素的机制和作用。该技术的主要优点是它可以应用于任何感兴趣的糖蛋白。
促进各种糖蛋白靶标的结构和生物物理表征。演示此程序的是我们实验室的研究项目协调员 Hong Cui。首先，按照文本方案中的说明准备和转染细胞。
通过在 6， 371 x g 和 4 摄氏度下离心 20 分钟来收获细胞。保留上清液，然后使用 0.22 微米过滤器过滤。以每分钟 4 mL 的浓度将过滤后的上清液上样到台式色谱系统的 Ni-NTA 柱上。
之后，用 3 到 4 倍体积的洗涤缓冲液洗涤色谱柱。使用洗脱缓冲液梯度稀释色谱柱中纯化的糖蛋白，同时收集馏分。将含有逃避峰的馏分拉入标称分子量限制为 10 kdalton 的离心过滤装置中。
然后以 4， 000 倍 G 和 4 摄氏度离心 15 分钟或直到样品达到 500 μL 的体积，进行浓缩。将浓缩的糖蛋白注入 500 μL 样品定量环中。在 4 °C 下将糖蛋白加载到 FPLC 系统上预平衡的高性能尺寸排阻柱上，同时收集馏分。
在此之后，运行 SDS-PAGE 凝胶以识别哪些逃避的级分含有糖蛋白并提取那些含有糖蛋白的组分。使用标称分子量限制为 10 道尔顿的离心过滤装置，在 4， 000 倍 G 和 4 摄氏度下浓缩纯去糖基化 ECD，直到获得所需的浓度。测定蛋白质浓度后，将样品在 12， 000 x G 和 4 摄氏度下离心 5 分钟，以去除灰尘和其他污染物。
接下来，将 80 微升来自商业结晶筛的结晶溶液添加到 96 孔液滴结晶板中的每个储液槽中。使用结晶机器人将蛋白质滴入结晶板的孔中。使用 200 纳升的总液滴体积，以纯化蛋白与结晶溶液的 1：1 比例。
在此之后，用胶带密封板。将密封板转移到板成像仪中，以便通过可见光和紫外线进行检查。确定产生初始糖蛋白晶体头的条件，并按照文本协议中的概述进一步优化这些晶体。
通过将晶体浸泡在补充有 20% 甘油的母液溶液中来冷冻保护晶体。然后将晶体安装在 CryoLoops 中。使用液氮，在数据收集之前快速冷冻封固的晶体。
在 24 孔结晶板中产生衍射良好的晶体后，用 150 毫摩尔氯化钠制备 pH 值为 9.0 的 50 毫摩尔配体和 20 毫摩尔 Tris 的储备液。将不同浓度的该配体溶液添加到先前制备的含有 ECD 晶体的液滴中。密封液滴，孵育时间长度为 5 分钟到 5 天。
使用光学显微镜，目视跟踪晶体以识别形态的任何可能变化。孵育后，使用 CryoLoops 封片晶体，并在补充有 20% 甘油的母液溶液中对其进行冷冻保护。要开始 Bio-Layer 干涉测定法，请按照文本方案中的说明，从 10X Kinetics 缓冲液中制备 50 mm 的 1X Kinetics 缓冲液。
将 200 微升此缓冲液添加到预润湿板中。将 6 个 Ni-NTA 生物传感器转移到板中，让它们在缓冲液中水合 10 分钟。接下来，用 1 mL 1X Kinetics 缓冲液稀释 His 标记的 ECD，终浓度为 25 ng/μL。
并制备纯化的 FAB 的连续稀释液。现在将试剂放入 96 孔微板中，如图所示。其中 B 代表 1X Kinetics 缓冲液，L 代表 His 标记的糖蛋白上样量，数字条目代表稀释的 FAB 浓度，R 代表再生缓冲液。
将水合的生物传感器转移到含有 1X Kinetics 缓冲液的孔中 60 秒，以对其进行基线测定。然后，以 25 ng/μL 的浓度以 1， 000 RPM 加载糖蛋白 240 秒。将生物传感器放回含有 1X Kinetics 缓冲液的孔中 60 秒，以获得第二个基线。
将传感器转移到含有 FAB 连续稀释液的孔中 180 秒。在此关联阶段之后，将生物传感器转移回 1X Kinetics 缓冲液中进行 180 秒的解离步骤。接下来，打开分析软件。
在选项卡 1 下，导入并选择数据。在选项卡 2 下的 step one data selection 下，选择 sensor selection。高亮显示参比井，然后右键单击以设置参比井。
在第 2 步 Subtraction 中，选择 Reference wells（参考井）。在此之后，在步骤 3 对齐 Y 轴下，选择基线并设置从 0.1 秒到 59.8 秒的时间范围。在第 4 步中，选择 inter-step correction 并 align to dissociation。
然后在第 5 步中，处理 Savitzky-Golay 过滤并单击 process data。通往第三选项卡的门。在步骤 2 下，使用一对一模型进行分析，选择关联和解离，选择全局拟合并按颜色分组。
右键单击曲线，单击 set color 并将所有曲线设置为所需的颜色。在此之后，选择 fit curves。如果数据拟合良好，请单击 save report 导出结果。
对所有所需条件重复实验。在本研究中，CD22 胞外结构域的几种构建体被成功克隆到 pHL-sec 表达载体中。然后，这些构建体在哺乳动物 HEK293-F 和 HEK293-S 细胞系中过表达。
而每毫升含有大约 100 万和 150 万个细胞的培养物表达非常相似的糖蛋白水平。每毫升只有五十万个细胞的培养物表达明显较低。在此之后，收获培养物并通过亲和和尺寸排阻色谱分离 ECD 糖蛋白，以纯化所有构建体至尺寸均一性。
产生用于结晶和生物物理研究的高纯度样品。遵循这些程序，可以执行其他方法，例如单粒子电子显微镜检查，以回答有关全长细胞外结构域或蛋白质复合物的三维结构的其他问题。观看本视频后，您应该对如何表达、纯化以及从结构和生物物理学上表征糖蛋白、其配体和靶向抗体有很好的了解。
概述
本文介绍了具有免疫球蛋白折叠的糖蛋白的生物物理和结构表征方法。讨论了生物层干涉、等温滴定量热法和X射线晶体学等技术。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物物理学
- 结构生物学
- 糖蛋白研究
背景
- 糖蛋白在各种生物过程中起着关键作用。
- 了解它们的结构和功能对药物开发至关重要。
- 当前研究糖蛋白的方法存在局限性。
- 本研究旨在增强现有的表征技术。
研究目的
- 提供有关糖蛋白功能的见解。
- 探索N-连接糖链的作用。
- 研究靶向糖蛋白的抗生素的机制。
使用的方法
- 用于实时相互作用分析的生物层干涉。
- 用于热力学分析的等温滴定量热法。
- 用于结构测定的X射线晶体学。
- 用于糖蛋白制备的细胞转染和纯化技术。
主要结果
- 使用所述方法成功表征了糖蛋白。
- 确定了结晶的最佳条件。
- 深入了解糖蛋白和配体的相互作用动力学。
- 展示了这些技术在不同糖蛋白中的多样性。
结论
- 所介绍的方法对研究糖蛋白是有效的。
- 这些方法可以应用于广泛的糖蛋白目标。
- 进一步的研究可以扩展对糖蛋白功能的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Characterizing glycoprotein ectodomains with immunoglobulin folds enables mechanistic de-risking of therapeutic candidates targeting immune receptors. This platform supports target validation by linking glycan heterogeneity to ligand binding kinetics and structural stability. The approach informs lead identification and preclinical decision-making for biologics development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating glycoform composition with binding affinity to ligands and antibody candidates.
- Operational Value: Enables functional target validation through biophysical quantification of glycoprotein-ligand interactions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by revealing how glycan size and composition modulate target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized glycoprotein ectodomains for downstream screening campaigns with defined glycoforms.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility via homogeneous glycan profiles from HEK293S expression systems.
- Scalability Value: Facilitates platform reuse across glycoprotein targets using conserved purification and characterization workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant systems by characterizing human B cell receptor CD22 ectodomain in immune recognition contexts.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation through structural and thermodynamic data.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by defining ligand binding thresholds and crystallization suitability.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target engagement assessment to lead optimization, enabling data-driven progression from early screening to preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how glycan heterogeneity affects ligand binding kinetics and thermodynamics.
- Screening: Delivers assay readiness through size-exclusion purified glycoprotein fractions suitable for biophysical analysis.
- Analytics: Generates quantitative readouts including binding affinity, stoichiometry, and thermal stability for comparative condition evaluation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via structural insights from X-ray crystallography of ligand-soaked crystals.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for characterizing diverse mammalian glycoprotein ectodomains containing immunoglobulin domains.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through correlated structural, kinetic, and thermodynamic datasets.
- Operational Value: Standardization and scalability via HEK293F/HEK293S expression systems and standardized purification protocols.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by de-risking mechanistic ambiguity in glycoprotein-targeted therapeutics.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on glycoform-dependent binding profiles and crystallization propensity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, protein purification, and biophysical characterization techniques.
- Dependent on access to FPLC, biolayer interferometry, isothermal titration calorimetry, and X-ray crystallography instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization for glycoform characterization and data interpretation across discovery and structural biology groups.
- Involves adaptation considerations when applying the method to glycoprotein targets beyond CD22 ectodomain.
- Practical limitations include glycan heterogeneity in HEK293F-derived samples affecting crystallization suitability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
Purification of Soluble Glycoprotein from HEK293 Supernatant
2:08
Crystallization of Glycoproteins
3:44
Soaking Glycoprotein Crystals with its Ligand
4:33
Characterization of Fab and Small Molecule Binding to the Glycoprotein
7:34
Results: Characterization of Glycoproteins
8:24
Conclusion
