Name: 用 X 射线晶体学和生物物理技术表征免疫球蛋白折叠的糖蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学习使用X射线晶体学和生物物理技术表征具有免疫球蛋白折叠结构的糖蛋白。该方法涵盖生物层干涉测量、等温滴定量热法和蛋白质纯化技术，可广泛应用于各类糖蛋白靶点的结构与功能研究。

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本文所述的X射线衍射实验在加拿大光源（Canadian Light Source）的08-ID和08-BM光束线上完成。加拿大光源得到了加拿大创新基金会、加拿大自然科学与工程研究委员会、萨斯喀彻温大学、萨斯喀彻温省政府、加拿大西部经济多元化部、加拿大国家研究委员会以及加拿大卫生研究院的资助支持。我们感谢多伦多病童医院（The Hospital for Sick Children）的结构与生物物理核心设施（Structural &amp;#38; Biophysical Core Facility）提供等温滴定量热仪（ITC）和生物层干涉仪（BLI）的使用机会。J.E.O. 的研究得到了加拿大卫生研究院颁发的班廷博士后奖学金（Banting Postdoctoral Fellowship BPF-144483）的支持。T.S. 获得了加拿大卫生研究院提供的加拿大研究生奖学金硕士奖项（Canada Graduate Scholarship Master's Award）以及范尼尔加拿大研究生奖学金（Vanier Canada Graduate Scholarship&#160;）。本研究获得了加拿大卫生研究院运营基金（项目号：PJT-148811，负责人：J.-P.J.）的支持。本研究的部分工作得益于加拿大研究教席计划（Canada Research Chairs program (J.-P.J.)）提供的资金支持。

作者声明无竞争利益。

膜锚定糖蛋白对细胞功能至关重要，并且是极具潜力的治疗靶点。本文介绍了一种用于对膜糖蛋白的胞外区（ECD）进行结构与生物物理表征的实验方案，既可单独研究，也可用于研究其与小分子配体及Fab片段形成的复合物。我们已成功应用该方案解析了人CD22胞外区最靠近N端的三个Ig结构域的晶体结构28，CD22是B细胞上一种关键的共受体，在调控体液免疫中发挥重要作用79。我们还鉴定了CD22与其天然配体α2-6-唾液酸乳糖的结合位点，并阐明了一种治疗性抗体识别人CD22的分子机制。这些结果揭示了Siglec家族中一个在B细胞上特异性表达的关键成员的结构与功能关系，并为开发靶向CD22的小分子及抗体类新疗法提供了分子基础。尽管本方案最初成功应用于含Ig结构域的B细胞受体，但我们认为该方法可推广至任何具有明确结构域组织的膜糖蛋白的结构与生物物理表征。在此类情况下，可通过设计表达载体并结合N-连接糖链的组合突变（突变为Gln或Ala），筛选出适合晶体生长并获得高分辨率衍射数据的蛋白构建体。
获得均一且纯净的糖蛋白样品对于晶体生长和X射线衍射，以及后续的生物物理表征至关重要。糖蛋白上的N-连接聚糖本质上具有异质性，可能导致糖蛋白内部的构象和化学异质性，从而阻碍晶体形成。为降低这种微异质性，可采用一些策略，例如引入定点突变以去除预测携带N-连接聚糖的Asn残基，或使用突变细胞系（如HEK293S），再结合内切糖苷酶处理（如EndoH），这些方法可显著提高结晶成功率15,21,22。在本方案中，我们讨论分泌到细胞上清液中的可溶性糖蛋白和Fab片段的纯化。糖蛋白的分泌提供了一条相对简单的纯化途径，无需细胞裂解或添加剧烈化学试剂或去污剂。收集细胞后获得的上清液可直接上样至对目标蛋白具有亲和力的层析柱（例如，用于His标签糖蛋白的Ni-NTA柱，或用于Fab片段的LC亲和柱）。然而，根据所用层析柱类型及细胞上清液的条件（例如，pH值），目标蛋白与层析柱的结合能力可能受到影响。若出现此类情况，可能需要对细胞上清液进行浓缩和缓冲液置换，以提高其在层析柱上的结合效率。此外，强烈建议在纯化过程中引入质量控制步骤，以评估蛋白纯度。对所有样品（纯化前、纯化中和纯化后）进行SDS-PAGE电泳或Western blot分析，有助于判断所设计的纯化方案是否适用于目标蛋白。若在SDS-PAGE中观察到污染条带，或在纯化过程中获得多个组分（例如，尺寸排阻层析中出现多个峰），则应考虑增加额外的纯化步骤，例如离子交换层析，以提高纯度并增加后续结晶的成功几率80。
对于大分子结晶，通常需要获得足量的目标蛋白，以便在高蛋白浓度下筛选大量潜在的结晶条件，从而找到合适的晶体初筛结果。一般来说，本文讨论的HEK293细胞系（HEK293F和HEK293S）是稳定的表达系统，可根据需要轻松放大培养以获得更多样品。然而，目标蛋白在这些细胞系中可能表达量不足。在此情况下，已有研究发现其他细胞系（如Expi293细胞81,82）的蛋白表达水平更优，可作为替代选择。
如果在测试了目标蛋白的多个构建体后，尽管蛋白纯度较高，仍未能获得有序且可衍射的晶体，则可能需要拓展结晶技术以促进晶体形成。已有研究表明，抗体的Fab片段和纳米抗体可以&#160;优异的结晶促进剂，并促进晶体形成高度有序的排列83,84,85这些片段可被表达并纯化至均一，可用于与目标蛋白形成复合物以促进结晶。值得注意的是，按照第10节所述方法制备的Fab片段可能倾向于形成无功能的轻链（LC）二聚体。86这些二聚体属于杂质，应在纯化过程中予以去除。根据我们的经验，轻链二聚体在尺寸排阻层析中通常具有不同的洗脱体积，或在离子交换层析中呈现为独立的洗脱峰，因此可在Fab片段纯化过程中将其分离；但情况并非总是如此。若上述方法不足以从Fab片段纯化中完全去除轻链二聚体，则可采用其他纯化手段，如Protein G亲和层析，以提高产物纯度。
除了与Fab片段共复合物化之外，已有充分文献记载的技术（如随机基质微晶种法）可提高获得有序晶体的几率63,70。该方法是在结晶条件下加入少量研碎的、非理想的晶体，以提供晶核促进晶体生长。此操作可使用目标蛋白自身的晶体，也可使用具有相似结构域架构和三级结构的其他晶体。此外，随机基质微晶种法&#160;可用于尝试使目标蛋白单独结晶，或使其与Fab片段或小分子配体形成复合物后结晶。近年来冷冻电子显微技术的进步，也使其成为获取具有合适特征分子高分辨率结构信息的一种颇具吸引力的X射线晶体学替代方法87,88,89,90,91。
当通过分子置换法（MR）无法确定X射线衍射数据集的相位时，可能需要通过重原子（HA）浸泡，利用反常散射或同晶置换法来解决相位问题。分析蛋白质的氨基酸序列可为HA衍生化策略提供线索，包括结合的最佳pH值。特别是，蛋白质中未配对的半胱氨酸可特异性结合含汞的重原子化合物。将天然晶体与重原子化合物进行浸泡是一个迭代过程，旨在确定最佳重原子化合物的种类、浓度以及所需的孵育时间。如果初步的浸泡尝试未能获得具有良好衍射质量且含有适合用于相位确定的重原子的晶体，则可能需要引入氨基酸替换突变，以提高重原子结合的概率并增强反常信号。例如，可引入突变以产生游离的半胱氨酸残基，从而高效结合Hg、Au、Pt或Pb。在大肠杆菌（E. coli）中利用添加硒代甲硫氨酸的培养基表达蛋白质，已被广泛用于反常散射相位确定；然而，目前尚无可靠且适用于悬浮培养的哺乳动物细胞的等效系统来有效掺入硒代甲硫氨酸，这仍是未来发展的方向92,93。
获得目标糖蛋白的无配体结构后，可通过将晶体浸泡在小分子配体溶液中，以获得免疫受体-配体复合物的结构。这些数据为合理设计更具特异性和高亲和力的配体提供了蓝图，此类配体可作为小分子治疗药物，同时也为糖蛋白的生物学功能提供了高分辨率的深入见解。在尝试将目标小分子配体浸泡到糖蛋白晶体中时，可通过检查无配体晶体结构来判断浸泡是否可行。如果在配体结合位点周围或预期在配体结合后发生构象变化的区域存在紧密的晶体堆积接触，则浸泡很可能存在问题。在此情况下，应采用其他方法，例如蛋白质-配体复合物的共结晶。

表面蛋白在细胞功能中发挥着关键作用。通过其胞外结构域，这些膜蛋白可以调节细胞间相互作用、黏附、转运和信号传导1,2。由于这些蛋白定位于细胞外侧，使其成为开发治疗多种疾病（包括癌症和自身免疫性疾病）药物的理想靶点3,4,5,6,7。人类膜蛋白胞外区最常见的折叠结构之一是免疫球蛋白样（Ig）折叠，由七条或更多的β链组成两个β片层结构8,9。通常，含Ig结构域的糖蛋白是由多个结构域组成的复合体，其中Ig结构域依次排列在膜蛋白的胞外部分10。这些细胞表面蛋白的翻译后修饰，特别是N-连接和O-连接糖基化，在其调控、折叠、分泌和功能中已被证实具有重要作用11。为了更深入理解其功能，并更有效地设计靶向这些蛋白的治疗分子，亟需能够对其开展详细分子表征的技术。本文介绍了一组联合技术，可用于对含Ig结构域的膜糖蛋白的胞外区进行生物物理（生物层干涉技术（BLI）和等温滴定 calorimetry（ITC））和结构（X射线晶体学）表征，既可单独分析，也可&#160;与其生物学相关配体或治疗分子形成复合物后进行分析（图1）。
N-连接糖基化是哺乳动物蛋白质中最常见的翻译后修饰之一，发生在蛋白质于内质网和高尔基体中成熟的过程中12,13细胞系，例如人胚肾（HEK）293细胞，已被开发用于大量重组表达糖基化的哺乳动物蛋白。14,15该细胞系已开发为悬浮培养形式，便于大规模扩增以生产较大量蛋白质。&#160;与贴壁细胞系相比。在此，我们使用了两种 HEK293 细胞系：HEK293F 和 HEK293 Gnt I-/- （HEK293S），两者的区别在于后者缺乏N-乙酰葡萄糖胺基转移酶I（Gnt I）。因此，后者无法产生复杂的糖链（如HEK293F细胞中所见），而只能生成高甘露糖型糖链（主要为Man5GlcNAc2位于&#160;N-连接糖基化位点18,19,20使用这两种细胞系进行平行实验，可研究糖链大小和复杂性对生物学功能及治疗靶向性的影响。事实上，HEK293F细胞产生的糖蛋白所携带的糖链比在HEK293S细胞中产生的相同糖蛋白具有更大的尺寸和更高的复杂性。由于HEK293S细胞中N-连接糖链的化学和构象异质性较低，其产生的糖蛋白更易于结晶。为进一步提高结晶能力，可在HEK293S细胞（而非HEK293F细胞）中表达的糖蛋白使用内切糖苷酶H（Endo H）处理，该酶可切割高甘露糖型糖链，使每个N-连接糖基化位点仅保留一个N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）基团。21,22. 也可采用其他方法限制细胞内N-糖链的加工，例如在糖蛋白表达过程中加入糖基转移酶抑制剂，如kifunensine23替代方法包括在HEK293F细胞中表达天然糖蛋白，随后使用肽-N-糖苷酶F（PNGaseF）进行酶法去糖基化。然而，研究表明在天然条件下使用PNGaseF去糖基化效率较低，并可能导致某些蛋白质发生聚集；在处理后蛋白质仍保持可溶的情况下，由于天冬酰胺残基脱酰胺转化为天冬氨酸，其表面会引入负电荷24，这可能不利于其结晶。预测的N-糖基化位点也可被突变，通常突变为丙氨酸或谷氨酰胺残基，以阻止这些位点发生N-连接糖基化，从而获得高度均一的糖蛋白样品。 Alternatively，糖蛋白也可在其他真核细胞表达系统中产生，包括酵母、昆虫和植物细胞系统，或其他哺乳动物细胞系，如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。16,17.
许多哺乳动物表达载体（包括pHLsec）可将重组糖蛋白胞外域分泌到细胞培养基中25。从HEK293细胞中分泌糖蛋白无需细胞裂解，从而实现快速且简便的纯化。在目标糖蛋白的N端或C端添加纯化标签（例如 His标签、Strep标签、Flag标签、Myc标签、HA标签），可通过一步亲和层析进行纯化。随后可采用尺寸排阻层析，以获得单一分散的样品，用于生物物理和结构表征。
在适当条件下，高纯度且均一的糖蛋白样品可形成衍射质量良好的晶体。一旦从此类晶体获得完整的X射线衍射数据集，便需要确定初始相位，以计算该糖蛋白的电子密度。得益于蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB）中结构数量的持续增长，目前最常用的相位确定方法是分子置换法（molecular replacement, MR），该方法利用已知的同源蛋白结构来获取初始相位26。然而，对于某些多免疫球蛋白结构域的糖蛋白，分子置换法有时无法解决相位问题27,28,29，此时则需要采用其他替代方法。本文详细描述了一种用于相位确定的重原子（heavy atom, HA）浸泡晶体的方法，该方法曾被用于解析CD22胞外域的结构28。选择合适的重原子进行相位测定是一个迭代过程，其结果取决于重原子的反应性、糖蛋白在特定晶格中可利用的原子种类以及结晶溶液的组成30,31。此外，若糖蛋白中半胱氨酸和甲硫氨酸残基所含的天然硫原子比例足够高，且能够收集到足够高冗余度的X射线衍射数据，则也可利用这些硫原子进行相位测定32,33。
膜糖蛋白的生物学功能通常由蛋白质-蛋白质相互作用或蛋白质-配体相互作用介导，例如与碳水化合物的相互作用。当配体足够小，能够从溶液中扩散至晶体晶格中糖蛋白的结合位点时，浸泡实验可能成功获得糖蛋白-配体共结晶结构，从而更深入地理解配体识别机制。
本文所述方案对于理解表面糖蛋白与合成治疗性配体34,35以及抗体类治疗药物36,37之间的相互作用同样具有重要意义。当结合结构信息时，结合动力学和热力学参数可用于深入理解并优化其作用机制。一种可用于分析治疗性抗体与糖蛋白结合动力学的技术是生物膜干涉技术（BLI）38,39。BLI利用固定了配体的生物传感器，测量其与结合伙伴的结合与解离动力学，最终确定平衡解离常数（KD）。BLI是一种颇具吸引力的方法，因其所需糖蛋白用量少（&#60;100 µg）、实验时间短（每次运行约10–15分钟），且可实现自动化。等温滴定量热法（ITC）也适用于研究糖蛋白与其结合伙伴之间的亲和力40,41,42,43。尽管ITC在时间和试剂消耗上要求更高，但可获得有关相互作用热力学的宝贵信息（ΔG、ΔH、ΔS及化学计量比）。ITC还特别适用于研究通常与表面糖蛋白和配体之间瞬时结合相关的弱相互作用。此外，这些技术可联合使用，以评估不同构建体的结合特性，并分析在不同细胞系中表达糖蛋白所获得的不同N-连接糖型的影响。对在HEK293F、HEK293S细胞中表达并经Endo H处理产生的糖蛋白进行BLI和ITC分析，可深入揭示糖链在生物学活性及治疗作用中的功能。
我们成功应用这些方案对人CD22的胞外域（ECD）进行了表征28，CD22是一种唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglecs）家族的糖蛋白成员，在维持B细胞稳态中起关键作用44。我们通过深入的构建设计以促进结晶，并采用Hg进行重原子浸泡法对X射线数据集进行相位解析。此外，我们将CD22晶体与其配体唾液酸（α2-6 唾液乳糖）进行浸泡，获得了免疫受体-配体复合物的结构，从而为基于结构设计糖类模拟物提供了蓝图45,46。另外，我们制备了抗CD22治疗性抗体epratuzumab的抗原结合片段（Fab）——该抗体目前正处于非霍奇金淋巴瘤III期临床试验阶段47——并通过BLI和ITC测定其与不同糖基化修饰的CD22 ECD构建体之间的结合亲和力。这些研究揭示了N-连接糖基化在epratuzumab结合过程中的关键作用，对功能异常B细胞上CD22的识别具有潜在意义。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;mu;m Steritop 滤器</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPS02RE</td><td></td></tr><tr><td>10 孔 4-15% 梯度 SDS-PAGE 凝胶</td><td>Bio-Rad</td><td>4561084</td><td></td></tr><tr><td>10x 糖缓冲液 3</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702S</td><td>随 Endo H 试剂提供</td></tr><tr><td>10x 动力学缓冲液</td><td>PALL Fort&amp;eacute;Bio</td><td>18-1092</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/甘氨酸/SDS 缓冲液</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 圆底 96 孔板</td><td>ThermoFisher</td><td>260251</td><td></td></tr><tr><td>22 mm 盖玻片</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli 上样缓冲液</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>96-3 孔 INTELLIPLATE&amp;nbsp; 低体积储液槽</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>102-0001-03</td><td></td></tr><tr><td>AgeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0552S</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTA Pure</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTA Start&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 离心过滤装置，10 kDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4 离心过滤装置，10 kDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>Auto-iTC200</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>MCT150C</td><td></td></tr><tr><td>Countess 细胞计数板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 × 0.05–0.1 mm</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-945</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 × 0.1–0.2 mm</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-947</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 × 0.2–0.3 mm</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-970</td><td></td></tr><tr><td>数字干浴器</td><td>Bio-Rad</td><td>1660562EDU</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DH5&amp;alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>Endo H</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702S</td><td></td></tr><tr><td>锥形瓶（带挡板底），聚碳酸酯，无菌，500 mL，DuoCAP</td><td>TriForest Labware</td><td>FBC05000S</td><td></td></tr><tr><td>锥形瓶 125 mL（带挡板底），聚碳酸酯，无菌，125 mL，带通气盖</td><td>VWR</td><td>89095-258</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 一次性无菌移液管，无热原，10 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 一次性无菌移液管，无热原，25 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 一次性无菌移液管，无热原，5 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 一次性无菌移液管，无热原，50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>768180</td><td></td></tr><tr><td>FectoPRO DNA 转染试剂，Polyplus</td><td>VWR</td><td>10118-842</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle 293F 细胞</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle 表达培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12338001</td><td></td></tr><tr><td>重原子筛选试剂盒 Au</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-444</td><td></td></tr><tr><td>重原子筛选试剂盒 Hg</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-446</td><td></td></tr><tr><td>重原子筛选试剂盒 M1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-448</td><td></td></tr><tr><td>重原子筛选试剂盒 M2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-450</td><td></td></tr><tr><td>重原子筛选试剂盒 Pt</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-442</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293S</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap 亲和层析柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17525501</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap KappaSelect 亲和层析柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17545811</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap LambdaSelect 亲和层析柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17548211</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-1 结晶筛选试剂盒 1.7 mL 板</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-1</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-2 结晶筛选试剂盒 1.7 mL 板</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-2</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-3 结晶筛选试剂盒 1.7 mL 板</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-3</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-4 结晶筛选试剂盒 1.7 mL 板</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-4</td><td></td></tr><tr><td>氯化汞</td><td>Sigma</td><td>1044170100</td><td></td></tr><tr><td>微孔板，96 孔，聚丙烯，平底，黑色&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>Minstrel DT UV</td><td>Formulatrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro 摇床</td><td>Infors HT</td><td>MP25-TA-CO2HB</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c 分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep 3K Omega 离心浓缩管</td><td>PALL Life Science</td><td>OD003C33</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 生物传感器</td><td>PALL Fort&amp;eacute;Bio</td><td>18-5102</td><td></td></tr><tr><td>Octet RED96</td><td>PALL ForteBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oryx 4 结晶机器人</td><td>Douglas Instrument</td><td>ORY-4/1</td><td></td></tr><tr><td>氯铂酸</td><td>Sigma</td><td>520632-1g</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein 标准蛋白</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure 质粒大提试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K210006</td><td></td></tr><tr><td>Quick Coomassie 染色液</td><td>Protein Ark</td><td>GEN-QC-STAIN-1L</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip 无菌 50 mL 一次性真空过滤系统，0.22 &amp;micro;m Millipore Express</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17517201</td><td></td></tr><tr><td>溴化钽簇</td><td>Jena Bioscience</td><td>PK-103</td><td></td></tr><tr><td>Top96 结晶筛选试剂盒</td><td>Rigaku Reagents</td><td>1009846</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>VDX 24 孔板（带密封剂）</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;2-6 唾液酸乳糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8556-1mg</td><td></td></tr></tbody></table>

利用x射线晶体学与生物物理技术对具有免疫球蛋白折叠结构的糖蛋白进行表征

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

细胞表面的糖蛋白在细胞功能中发挥关键作用，包括信号传导、黏附和转运。在白细胞上，多种此类糖蛋白具有免疫球蛋白（Ig）折叠结构，对免疫识别与调控至关重要。本文介绍了一个用于设计、表达及生物物理表征人B细胞受体CD22胞外域的平台。我们提出，这些方法可广泛应用于含有Ig结构域的哺乳动物糖蛋白胞外域的表征。采用两种悬浮培养的人胚胎肾细胞系HEK293F和HEK293S，分别表达携带复杂型和高甘露糖型糖链的糖蛋白。这些具有不同糖型的重组糖蛋白可用于研究糖链大小和组成对配体结合的影响。我们讨论了研究糖蛋白与生物学相关配体及治疗性抗体候选分子之间结合动力学和热力学的实验方案。由于HEK293S细胞产生的重组糖蛋白糖链均一性高、柔性较低，且可被内切糖苷酶H处理，因此适合用于结晶。我们介绍了将糖蛋白晶体分别浸泡于重原子和小分子溶液中，以进行相位确定和配体结合分析的方法。本文所述实验方案有望推动哺乳动物糖蛋白的表征研究，深入理解其功能，并揭示治疗药物的作用机制。

成功将多个CD22胞外区（ECD）构建体克隆至pHLsec表达载体，并在哺乳动物HEK293F和HEK293S细胞系中过表达（图&#160;2和3A）。所有构建体均通过尺寸排阻色谱纯化至分子大小均一，并获得高纯度样品用于结晶研究（图&#160;3B和3C）。最终获得良好衍射晶体的CD22构建体为d1-d3截短体（残基20-330），其中预测的六个N-连接糖基化位点中有&#160;五&#160;个由天冬酰胺（Asn）突变为丙氨酸（Ala）（N67A、N112A、N135A、N164A和N231A），该构建体在HEK293S细胞中表达，仅保留位于N101位置的糖基化位点（此构建体命名为CD2220-330, 5A）。晶体在MCSG-1稀疏矩阵筛选的多个条件下获得，其中最优晶体来自含30%（w/v）聚乙二醇4000、0.2 M氯化锂和0.1 M Tris（pH 8.5）的条件。这些天然晶体衍射至2.1 Å分辨率；在分子置换（MR）搜索中，使用相关Siglec蛋白Ig结构域的已知结构未能获得任何可行解。
为了获得相位信息，我们将天然晶体浸泡在一系列包含Hg、Pt、Os、Ta和Br的重原子（HA）化合物中，HA化合物浓度范围为1–20 mM，孵育时间从5分钟至1天不等（图4）。我们监测了晶体形态的变化，发现用20 mM HA化合物浸泡的晶体迅速出现开裂和溶解现象。我们共冷冻了63颗在特定孵育时间后仍保持完整形态的晶体，这些晶体分别浸泡于溴化钽簇、氯铂酸、醋酸汞和氯化汞溶液中。其中，用7 mM氯化汞浸泡30分钟的晶体在加拿大光源（CLS）08-BM线站（加拿大萨斯卡通）进行荧光扫描时显示出明显的反常散射信号，从而实现了单晶的多波长反常衍射X射线数据收集。这些数据集使我们能够解析CD2220-330, 5A的汞亚结构，结果显示一个汞原子结合在C308位点的游离半胱氨酸上，最终使我们能够利用AutoBuild78将CD2220-330, 5A的结构搭建到带相位的电子密度图中。
在解析出无配体结合的结构后，我们进一步希望解析CD22与其配体α2-6-唾液酸乳糖结合后的结构。我们首先采用等温滴定量热法（ITC）测定CD22对α2-6-唾液酸乳糖的亲和力，以表征该相互作用的结合热力学参数。实验测得其亲和力约为280 µM，并据此确定了用于浸泡原生CD2220-330,5A晶体的初始配体浓度（约100倍KD）。我们将CD2220-330, 5A晶体分别在25 mM唾液酸乳糖溶液中浸泡5分钟、2小时、14小时、40小时和5天，并监测晶体形态的变化。共约75颗晶体在不同时间点被冷冻，并送往加拿大萨斯卡通的CLS同步辐射光源08-ID线站进行远程数据收集。从衍射质量良好的晶体中总共收集了六套X射线衍射数据集。每套X射线数据集的结构均通过分子置换法（MR）&#160;解析，以无配体结合的CD2220-330, 5A结构作为初始搜索模型。随后，我们检查了各数据集的电子密度图，特别关注Fo-Fc差值图中是否存在对应于CD22结合位点内结合的α2-6-唾液酸乳糖的正向电子密度。值得注意的是，所有收集的数据集——即使来自仅浸泡5分钟的晶体——均显示出与配体结合相符的正向电子密度。总体而言，无配体与有配体结合的CD22结构高度相似，构象变化极小，这可能解释了使用α2-6-唾液酸乳糖进行浸泡实验能够成功的原因。
接下来，我们通过BLI和ITC实验表征了治疗性抗体epratuzumab识别的CD22抗原表面（图5）。epratuzumab Fab与不同糖型CD22构建体结合的动力学和热力学分析显示，随着N-连接糖链尺寸减小，其对CD22的亲和力逐渐增强，在较小糖链情况下亲和力最高可提升达14倍（BLI结果：327 nM vs 24 nM；ITC结果：188 nM vs 58 nM）。通过CD22单点突变体的BLI分析以及epratuzumab Fab与CD22 d1-d3共结晶结构的解析，确定了限制抗体接近其表位的CD22 N-连接糖链28。
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig1.jpg" /> 
图 1．糖蛋白表征的总体流程：从构建设计到生物物理与结构表征。 （1）代表性糖蛋白的一级序列分析。灰色部分为胞外域（ECD）；绿色部分为跨膜（TM）区段；蓝色部分为糖蛋白的胞内域。预测的N-连接糖链已作标注。（2）ECD构建体的克隆。（3）在哺乳动物细胞中表达ECD构建体。（4）糖蛋白纯化。在HEK293F细胞中表达的蛋白含有复杂的糖型，而在HEK293S细胞中表达的蛋白则具有高甘露糖型糖链。使用Endo H对在HEK293S细胞中产生的糖蛋白进行酶处理，可得到仅在N-连接糖基化位点保留一个GlcNAc基团的糖蛋白。（5a）通过生物层干涉技术（BLI）和等温滴定量热法（ITC）检测糖蛋白与抗体的结合能力。ITC也可用于测定其与小分子配体的亲和力。（5b）对具有均一N-连接糖链的糖蛋白（例如在HEK293S中表达并经Endo H去糖基化的蛋白）进行结晶试验。（6）在某些情况下，需对N-连接糖基化位点进行突变以获得晶体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig2.jpg" /> 
图2．用于在哺乳动物细胞中表达的CD22胞外域DNA构建体设计。&#160;A) 用于瞬时转染CD22 ECD构建体的pHLsec质粒示意图。用于克隆的AgeI和KpnI酶切位点以红色框标出。B) CD22 ECD包含七个Ig结构域（d1-d7）和12个预测的N-连接糖基化位点（以蓝色标出）。从CD22 ECD设计了四种构建体。C) 1%琼脂糖凝胶电泳显示用于克隆至pHLsec哺乳动物表达载体的CD22 ECD构建体的PCR扩增产物。第一泳道为1 kb DNA标记物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig3.jpg" /> 
图3糖蛋白的表达与纯化&#160;A) 细胞密度对表达量的影响。在25 mL小规模培养中，转染三种不同起始密度细胞（0.5 × 10⁶、1.0 × 10⁶ 和 1.5 × 10⁶ 个细胞/mL）的HEK293F悬浮细胞后，糖蛋白的表达情况。6 细胞/mL-1，1.0 × 106 细胞/mL-1，以及 1.5 x 106 细胞/mL-1左侧图示通过 SDS-PAGE 电泳条带密度测定进行定量，右侧图示通过定量 BLI 分析进行定量。数据代表一次糖蛋白制备样品的典型结果。 B) 构建体CD22第一步纯化层析图谱20-330, 5A 从600 mL上清液中使用Ni-NTA亲和柱纯化糖蛋白。采用咪唑梯度（灰色线条）进行洗脱，其中100%对应含500 mM咪唑的洗脱缓冲液。合并的组分以垂直线表示。 C) CD22 构建体的尺寸排阻色谱图20-330,5A 使用高性能凝胶过滤柱。洗脱峰的合并组分以垂直线表示。插图：考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶，显示糖蛋白的纯度。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig4.jpg" /> 
图 4．使用重原子进行晶体浸泡。 A) 用于将天然晶体浸泡在重原子（HA）化合物中的样品工作台。所有必需的工具均已标注。B) 将CD2220-330, 5A构建体的晶体浸泡在HA化合物中的操作步骤。步骤 1，打开含有晶体的孔，使用环状工具将晶体转移至载玻片上含有HA溶液的0.2 µL液滴中，该HA溶液用结晶条件缓冲液稀释，使其终浓度为1–10 mM。步骤 2，将液滴密封于结晶板中，并让晶体与HA化合物孵育不同时间。步骤 3，将浸泡后的晶体用环状工具夹取，并依次在载玻片上三个连续的、每份0.2 µL、含有补充了20% (v/v) 甘油的母液的液滴中进行反向浸泡（back-soak），每次30秒。步骤 4，将环上固定的晶体用液氮快速冷冻，随后放入样品托（puck）中，准备运送到同步辐射光束线进行数据收集。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig5.jpg" /> 
图5．生物层干涉测量与等温滴定热量测定实验结果。A） 典型的BLI实验。上图：动力学实验的微孔板设置示例，图中标注如下：1×动力学缓冲液（B）、His6x-标签糖蛋白上样（L）、典型Fab浓度（500、250、125、&#160;62.5&#160;nM）、PBS + 500 mM再生缓冲液（R）以及1×动力学中和缓冲液（B）。每个孔中含200 µL溶液。动力学实验的步骤编号位于板的上方。中图：使用Ni-NTA生物传感器及上图所述微孔板进行的BLI实验的典型原始数据。步骤编号对应于基线（1）、His6x糖蛋白上样（2）、基线（3）、Fab系列稀释液中的结合（4）和解离（5）。再生步骤未显示（步骤6-7）。下图：典型分析数据，显示原始结合与解离曲线（蓝色线）及相应的1:1拟合曲线（红线）。B）&#160;上图：在自动化ITC仪器上进行单次ITC运行的典型微孔板设置，使用96孔圆底板，共包含七个实验，每个实验由三个孔组成。第一个孔（红色）为样品池样品（400 µL），第二个孔（绿色）为注射器样品（120 µL）。第三个孔保持空置，实验完成后混合样品将返回此孔。实验1、2和7为缓冲液对缓冲液的对照实验。实验3-5为在样品池中加入糖蛋白（P）、注射器中加入Fab或配体（L）的三重复实验。实验6为配体稀释热对照，在数据分析过程中应从实验3-5中扣除。下图：典型的原始（上）和处理后（下）ITC数据，显示Fab（epratuzumab）与在HEK293F细胞中表达的CD22 ECD的结合。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们介绍了利用生物膜干涉技术、等温滴定热量法和X射线晶体学对具有免疫球蛋白折叠结构的糖蛋白进行生物物理和结构表征的方法。

利用X射线晶体学与生物物理技术对具有免疫球蛋白折叠结构的糖蛋白进行表征

细胞表面的糖蛋白在细胞功能中发挥关键作用，包括信号传导、黏附和转运。在白细胞上，多种……

该方法有助于解答糖蛋白研究领域中的关键问题，包括蛋白质功能、N-连接聚糖的作用，以及靶向糖蛋白的抗生素的作用机制。该技术的主要优势在于可应用于任何感兴趣的糖蛋白。促进多种糖蛋白靶标的结构与生物物理表征。本实验操作由本实验室的研究项目协调员 Hong Cui 演示。首先，按照文本方案中所述步骤准备并转染细胞。在4℃条件下，以6,371 × g离心20分钟收集细胞。保留上清液，然后使用0.22微米滤膜过滤。在台式层析系统中，以每分钟4毫升的流速将过滤后的上清液上样至Ni-NTA柱。用三到四个柱体积的洗涤缓冲液洗涤层析柱。使用洗脱缓冲液梯度稀释柱中纯化的糖蛋白，同时收集洗脱组分。将含有洗脱峰的组分收集到截留分子量为10千道尔顿的离心过滤装置中。然后在4,000 × g、4 °C条件下离心15分钟，或直至样品体积浓缩至500 µL。将浓缩后的糖蛋白注入500 µL的样品环中。在4 °C条件下，将糖蛋白上样至预先平衡的FPLC系统中的高效尺寸排阻色谱柱，并同时收集组分。运行 SDS-PAGE 凝胶以鉴定哪些洗脱组分含有糖蛋白，并收集阳性组分。使用截留分子量为 10 千道尔顿的离心过滤装置，在 4,000 × g 和 4 °C 条件下浓缩纯化的去糖基化 ECD，直至达到所需浓度。测定蛋白浓度后，在 12,000 × g 和 4 °C 条件下离心样品 5 分钟，以去除灰尘及其他污染物。接下来，从商业化的结晶筛选试剂盒中取出80微升结晶溶液，加入96孔坐滴结晶板的每个储液池孔中。使用结晶机器人将蛋白质溶液分配到结晶板的各孔中，总液滴体积为200纳升，纯化蛋白质与结晶溶液按1:1的比例混合。此后，用封板膜密封微孔板。将密封好的微孔板转移至平板成像仪中，通过可见光和紫外光进行检测。确定能够产生初始糖蛋白晶体晶核的条件，并按照文本方案中所述进一步优化这些晶体。将晶体浸入含有20%甘油的母液溶液中进行冷冻保护。然后将晶体装入CryoLoops中。在收集数据前，使用液氮快速冷冻装好的晶体。在24孔结晶板中获得良好衍射晶体后，配制含有50毫摩尔配体和20毫摩尔Tris（pH 9.0）、150毫摩尔氯化钠的储备溶液。将该配体溶液以不同浓度加入先前制备的含有ECD晶体的液滴中。密封液滴，孵育时间从5分钟至5天不等。使用光学显微镜观察晶体，以识别其形态上可能发生的任何变化。孵育结束后，使用 CryoLoops 支撑晶体，并在添加了 20% 甘油的母液溶液中进行冷冻保护。开始生物层干涉技术实验前，按照文本方案中的说明，将 10X 动力学缓冲液稀释制备 50 毫米的 1X 动力学缓冲液。向预润洗板中加入 200 微升该缓冲液。将六根 Ni-NTA 生物传感器转移至该板中，并在缓冲液中水合 10 分钟。接着，将 His 标签 ECD 溶于 1 毫升 1× 动力学缓冲液中，稀释至终浓度为 25 纳克/微升。然后对纯化的FAB进行系列稀释。现在如图所示，在96孔微孔板中加入试剂，其中B代表1×动力学缓冲液，L代表带His标签的糖蛋白上样，数字表示稀释后的FAB浓度，R代表再生缓冲液。将水合后的生物传感器转移至含有1X动力学缓冲液的孔中，孵育60秒以进行基线平衡。随后，在1,000 RPM转速下，加入浓度为25纳克/微升的糖蛋白，孵育240秒。最后，将生物传感器重新放回含有1X动力学缓冲液的孔中，再次孵育60秒，以获取第二次基线。将传感器转移至含有FAB系列稀释液的孔中，孵育180秒。此结合阶段结束后，将生物传感器重新转移回1X动力学缓冲液中，进行180秒的解离步骤。随后，打开分析软件。在第一个标签页中，导入并选择数据。在第二个标签页的步骤一“数据选择”中，选择传感器。选中参比孔，然后单击右键设置参比孔。在第二步减法中，选择参比孔。然后，在第三步“对齐Y轴”中，选择基线，并将时间范围设置为从0.1秒到59.8秒。在第四步中，选择步间校正，并对齐至解离相。然后在第五步中，进行Savitzky-Golay滤波处理，并点击处理数据。切换到第三个选项卡。在第二步中，使用1:1模型进行分析，选择结合与解离，选择全局拟合，并按颜色分组。右键单击曲线，点击“设置颜色”并将所有曲线设置为所需的颜色。之后，选择拟合曲线。如果数据拟合良好，通过点击“保存报告”导出结果。针对所有期望的条件重复该实验。在本研究中，CD22 胞外域的多个结构成功克隆至 pHL-sec 表达载体中。随后，这些结构在哺乳动物 HEK293-F 和 HEK293-S 细胞系中过表达。当每毫升含有约一百万至一百五十万个细胞的培养物中，糖蛋白的表达水平非常相似；而每毫升仅五十万个细胞的培养物中，糖蛋白表达量则明显较低。此后，收集培养物，并通过亲和层析和尺寸排阻层析分离ECD糖蛋白，以纯化所有构建体，使其达到分子大小的均一性。获得高纯度样品，用于结晶和生物物理研究。在完成这些操作步骤后，还可进行其他方法，如单颗粒电子显微镜技术，以进一步探究全长胞外结构域或蛋白质复合物的三维结构。观看本视频后，您应能够充分掌握如何表达、纯化糖蛋白、其配体及靶向抗体，并对其进行结构与生物物理表征。

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科研

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生物化学

用 X 射线晶体学和生物物理技术表征免疫球蛋白折叠的糖蛋白

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超过一半的蛋白质是小分子蛋白质（分子质量 &lt;200 kDa），这类蛋白质在电子显微镜成像和三维重构方面均具有挑战性。优化的负染色法是一种可靠且高通量的方案，可在不同生理条件下获得小分子非对称蛋白质或复合物的高对比度和相对高分辨率（约 1...

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从构建体到晶体——迈向β-桶状外膜蛋白的结构解析

我们描述了一个结合了简单生化分析与计算分析的框架，用于指导大型卷曲螺旋结构域的表征与结晶。该框架可针对球状蛋白进行调整，或进一步拓展以整合多种高通量技术。...

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我们描述了用于在X射线自由电子激光器和同步辐射光源上进行序列晶体学实验的脂质立方相中膜蛋白微晶的制备与递送方法。这些方案也可应用于可溶性蛋白微晶的包埋与递送，与液体注射相比，可显著减少样品消耗。...

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