Name: 原位近接结扎法检测蛋白异构体的 Heterodimerization (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学习原位近邻连接分析技术检测固定细胞中MST1/MST2蛋白异构体的异源二聚化。该方法利用特异性抗体和DNA探针实现高灵敏度可视化，无需转基因表达即可研究蛋白相互作用动态。

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我们感谢Chernoff实验室全体成员为本方案的优化和验证所做的贡献，特别是Maria Radu和Galina Semenova。我们还感谢Fox Chase癌症中心细胞成像中心的Andrey Efimov。本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金（R01 CA148805）对JC的资助支持。

1. 溶液的配制
<ol>
	<li>配制固定液：将4%多聚甲醛（PFA）溶于1×PBS中。配制10 mL溶液时，取2.5 mL的16% PFA，加入7.5 mL的1×PBS。 
	危险性：PFA在低剂量下具有致癌性，其蒸气和皮肤接触均有危害。储存于-20 °C。</li>
	<li>配制通透液：将0.1% Triton X-100溶于1×PBS中。配制100 mL溶液时，将100 µL Triton X-100加入100 mL的1×PBS中。室温（RT）保存。</li>
	<li>配制洗涤缓冲液：1×TBST。配制1 L溶液时，取100 mL的10×TBS、890 mL的dH2O和10 mL的Tween 20（10%）。</li>
	<li>使用试剂盒提供的封闭液进行配制。或者，使用含2% BSA的1×PBS溶液。</li>
	<li>使用试剂盒提供的抗体稀释液进行配制。或者，使用含1% BSA的1×PBS溶液。</li>
</ol>
2. 细胞接种
注意：在本研究中，我们使用了永生化的人源施万细胞（iHSC）和人胚胎肾293细胞（HEK 293）；然而，该方法也可用于多种类型的贴壁细胞。
<ol>
	<li>在添加了10%胎牛血清（FBS）、0.2%葡萄糖、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素G和100 µg/mL链霉素的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2条件下，在组织培养处理过的培养板上培养HEK 293细胞。将iHSC维持在含10% FBS的DMEM培养基中，添加青霉素/链霉素和2 µM佛司可林。常规检测细胞支原体污染。未进行细胞系鉴定。</li>
	<li>用50 µL浓度为10 µg/mL的天然小鼠层粘连蛋白或0.01%多聚-L-赖氨酸溶液包被16孔细胞培养板，于37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟。使用0.04%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞进行传代。</li>
	<li>将iHSC和HEK-293细胞以80%汇合度（每孔15,000–25,000个细胞）接种于100 µL培养基中。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、湿润、5% CO2的培养箱中孵育12–24小时。</li>
</ol>
3. 固定与通透处理
<ol>
	<li>从孔中移除培养基，并用 100 µL 的 1x PBS 洗涤。使用移液器小心吸除液体，以尽量降低样本被移除的风险。</li>
	<li>每孔加入 50 µL 的 4% 多聚甲醛（PFA）固定细胞，在室温下静置孵育 10 分钟，避免振荡。细胞容易脱落，因此请勿将溶液直接滴加在细胞上。</li>
	<li>用 0.05% TBST 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗涤三次。使用移液器吸除液体，以尽量降低样本被移除的风险。</li>
	<li>在室温下，用通透液（含 0.1% Triton X-100 的 1x PBS）处理细胞 10 分钟，避免振荡。</li>
	<li>用 TBST 洗涤细胞三次，每次 5 分钟，洗涤过程中轻轻振荡。</li>
</ol>
4. 封闭
<ol>
	<li>用移液器轻轻吸去 TBST。在显微镜下观察切片，检查细胞是否仍然附着。</li>
	<li>向每个样本加入一滴（50–60 µL）1× 封闭液。</li>
	<li>将湿盒（装有水的空枪头盒）预热至 37 °C，将切片放入其中，在 37 °C 下孵育 1 小时。</li>
</ol>
5. 一抗
<ol>
	<li>用抗体稀释液（参见材料表）按1:100比例稀释一抗。每孔准备40 µL抗体溶液。</li>
	<li>轻敲载玻片以去除封闭液，切勿让细胞干燥。</li>
	<li>涡旋混匀后，每孔加入40 µL抗体溶液。</li>
	<li>在预热的湿化孵育盒中，37 °C孵育1小时。</li>
</ol>
6. 邻近连接实验探针
注意：PLA探针作为试剂盒的一部分提供（参见材料表）。探针的选择取决于用于检测目标蛋白的一抗物种。
<ol>
	<li>将两种 PLA 探针（抗小鼠 MINUS 和抗兔 PLUS）用抗体稀释液按 1:5 比例稀释。每个样本准备 40 µL 的 PLA 探针溶液，在室温下孵育 20 分钟。</li>
	<li>从载玻片上轻轻弃去一抗溶液，在室温下用洗涤缓冲液洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗涤两次。</li>
	<li>轻轻从载玻片上吸去洗涤缓冲液，并向孔中加入稀释后的 PLA 探针溶液（40 µL/孔）。</li>
	<li>将载玻片置于预热的湿盒中，在 37 °C 下孵育 1 小时。</li>
</ol>
7. 连接
注意：原位检测用红色试剂、连接酶和连接溶液作为试剂盒的一部分提供（参见材料表）。
<ol>
	<li>使用原位检测红色试剂（in situ Detection Reagents Red）。</li>
	<li>使用前立即涡旋振荡，并将5倍浓度连接反应原液用高纯度水按1:5比例稀释。 
	注意：稀释后的试剂不可储存。</li>
	<li>从载玻片上轻轻吸去PLA探针溶液。在1倍洗涤缓冲液中于室温下洗涤载玻片两次，每次5分钟。</li>
	<li>在加入样品前立即涡旋振荡，并按1:40比例将连接酶加入连接反应液中，再次涡旋混匀。</li>
	<li>从载玻片上轻轻吸去洗涤缓冲液，向每个孔中加入连接反应液/连接酶混合液（40 µL/孔）。</li>
	<li>将载玻片置于预热的湿盒中，在37 °C下孵育30分钟。</li>
</ol>
8. 扩增
注意：扩增试剂原液作为试剂盒的一部分提供（参见材料表）。试剂对光敏感，因此应避免将载玻片暴露于光照下。
<ol>
	<li>涡旋并用高纯度水将5x扩增储备液按1:5体积比稀释，混匀。</li>
	<li>从载玻片上弃去连接反应/连接酶溶液。在1x洗涤缓冲液中于室温下洗涤载玻片两次，每次2分钟。</li>
	<li>涡旋后，将聚合酶按1:80稀释比例加入扩增溶液中，再次涡旋混匀。</li>
	<li>从载玻片上弃去洗涤缓冲液，向每个孔中加入扩增/聚合酶溶液（40 µL/孔）。将载玻片置于预热的湿化 chamber 中，在37 °C孵育100分钟。</li>
</ol>
9. 成像前准备
注意：这些试剂对光敏感。请将载玻片避光保存。
<ol>
	<li>轻轻敲击载玻片，去除扩增-聚合酶溶液，并在室温下用1×洗涤缓冲液洗涤两次，每次10分钟。</li>
	<li>彻底移除载玻片上的反应腔室及围绕孔周围的硅胶，用刀片刮去残留的硅胶碎片。在载玻片上绘制网格，以分隔每个孔。</li>
	<li>加入约40 µL含DAPI的封片剂。注意避免盖玻片下产生气泡。可用指甲油密封盖玻片边缘。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜进行成像分析前，至少静置20分钟。 
	注意： 此处可暂停实验流程。</li>
	<li>成像完成后，将载玻片置于-20 °C避光保存。</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nore1B%2FMst1+complex+restrains+antigen+receptor-induced+proliferation+of+na%C3%AFve+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).</li>
<li>Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOBKL1A%2FMOBKL1B+phosphorylation+by+MST1+and+MST2+inhibits+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation.</a> Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li>
<li>Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ste20+group+kinases+as+regulators+of+MAP+kinase+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades.</a> Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).</li>
<li>Rawat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H-ras+Inhibits+the+Hippo+Pathway+by+Promoting+Mst1%2FMst2Heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization.</a> Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).</li>
<li>Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ste20-like+protein+kinase%2C+Mst1%2C+dimerizes+and+contains+an+inhibitory+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).</li>
<li>Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Approaches+Toward+Quantitative+Mapping+of+the+Interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome.</a> Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).</li>
<li>Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li>
<li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li>
<li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们发现本实验使用玻璃腔室载玻片非常方便，因为可以同时对多个（14-16个）细胞系进行实验，且在显微镜分析过程中无需每次更换样品。然而，该方法也可能带来一些问题，例如抗体交叉污染的风险增加。因此，尽管会延长实验时间，我们建议对每个孔进行单独清洗，而不是使用考普林瓶（Coplin jar）。此外，移除硅胶垫圈是一个精细的操作，必须小心且耐心地进行。即使操作极为细致，有时在移除垫圈后仍可能看到少量硅胶残留物。因此，必须彻底清除硅胶垫圈，必要时可使用刀片，因为残留过多的硅胶会影响显微镜观察时的共聚焦焦距。在移除硅胶垫圈后，用划线标记各孔的边界以帮助在显微镜下定位细胞，也可能有所帮助。
必须使用非交叉反应的一抗，每种一抗仅特异性识别异源二聚体中的一个成员（例如， MST1 抗体不应同时识别 MST2 反之亦然）。此外，需要注意使用不同的枪头以避免一抗和PLA探针之间的交叉污染，避免触碰孔板底部，并避免在样品上方直接移液。我们发现，对于iHSC，使用0.01%的多聚赖氨酸溶液包被培养皿效果更佳；而对于HEK-293细胞，则使用10 µg/mL的小鼠层粘连蛋...

MST1/ Hippo 信号通路的失调与发育障碍及致癌作用相关1在哺乳动物中，激酶MST1和MST2可激活（磷酸化）MOB1和LATS1/2，后者进一步磷酸化并失活转录共激活因子Yes相关蛋白（YAP）。2在活性（去磷酸化）状态下，YAP 具有促癌活性，可增强细胞增殖相关基因的转录；相反，当 YAP 被 Hippo 通路失活时，细胞增殖受到抑制，同时促进细胞凋亡3在组织中，MST1 和 MST2 主要以活性同源二聚体形式存在，但致癌刺激可增加 MST1/MST2 异源二聚体的水平，而此类异源二聚体无活性。4然而，MST1/MST2 异源二聚体的调控机制仍不清楚。同源和异源二聚体均通过 通过 MST1与MST2的C端卷曲螺旋区域（称为SARAH结构域）之间的相互作用5. 使用一个 原位 本文通过邻近连接实验（PLA）展示了人施万细胞（HSC）和人胚胎肾细胞（HEK-293）中存在MST1/MST2异源二聚体。PLA相较于其他蛋白质相互作用检测方法具有优势，因其能够检测内源性蛋白质相互作用，且无需外源基因表达或表位标签的使用即可实现对相互作用的识别与定量。6.
信号转导通路在很大程度上由组分蛋白的条件性相互作用所调控。例如，大多数受体酪氨酸激酶在受到刺激后会发生同源或异源二聚化，并继而与额外的胞内信号蛋白结合，这些信号蛋白自身还可进一步形成复合物。PLA方法的目的是在细胞内可视化蛋白之间的邻近关系，前提是这些蛋白之间的距离小于30–40 nm。通常，首先将细胞与来自不同物种的相应一抗孵育，以检测蛋白的邻近性。例如兔和小鼠）的相互作用蛋白分别孵育，然后加入与短DNA探针预偶联的物种特异性二抗。如果这些DNA探针彼此靠近，一条特异的连接DNA寡核苷酸可同时结合这两个探针，从而形成扩增平台 原位 通过PCR或滚环扩增机制进行扩增。在扩增反应中加入荧光标记，可使相互作用的蛋白质可视化，表现为可清晰识别的荧光点，能够被定量并定位到细胞内的特定区域7,8,9,10.

<table><tbody><tr><td>培养皿载玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>178599</td><td>16孔，玻璃载片</td></tr><tr><td>PLA探针 抗小鼠负链</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td>包含1×封闭液、1×抗体稀释液</td></tr><tr><td>PLA探针 抗兔正链</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td>包含1×封闭液、1×抗体稀释液</td></tr><tr><td>荧光洗涤缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>包含洗涤缓冲液A和洗涤缓冲液B</td></tr><tr><td>含DAPI的封片介质</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>红色检测试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92008</td><td>包含5×连接反应液、1×连接酶、5×红色扩增液、1×聚合酶</td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (Erk1/2) 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>9102s</td><td></td></tr><tr><td>磷酸化p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)</td><td>Cell Signaling</td><td>5726s</td><td>pERK抗体</td></tr><tr><td>MST2抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>3952s</td><td></td></tr><tr><td>Krs-2 (RJ-5)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-100449</td><td>MST1抗体</td></tr><tr><td>16% 戊二醛</td><td>Electron microscopy sciences</td><td>15710</td><td>用PBS稀释至4% PFA作为固定液</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP 151-500</td><td>用1×PBS配制0.1% Triton X-100作为通透溶液</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica TCS SP8, 63x</td><td></td><td>使用ImageJ软件进行图像分析</td></tr></tbody></table>

利用双分子荧光互补技术检测蛋白异构体异源二聚化 原位 邻近连接实验

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

受调控的蛋白质-蛋白质相互作用是许多信号转导事件的基本原则，检测此类相互作用对于理解信号通路的组织方式和功能机制具有重要意义。目前已有多种方法可用于细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的检测，但能够用于检测内源性蛋白质之间相互作用的方法相对较少。其中一种方法——邻近连接实验（proximity ligation assay, PLA）——具有多项优势，值得推广应用。与其他常见的蛋白质-蛋白质相互作用分析方法相比，PLA 具有较高的灵敏度和特异性，实验过程中对细胞的干预最小，在本方案中仅需使用两种来源于不同物种的靶标特异性抗体。例如来自小鼠和兔的抗体）以及一种专用试剂：一组与特定寡核苷酸共价连接的二抗，当这些二抗彼此靠近时，可形成可扩增的平台 原位 PCR 或滚环扩增。在本演示中，我们展示了如何应用 PLA 技术在固定细胞中可视化 MST1 与 MST2 之间邻近关系的变化。本文所述技术特别适用于细胞信号转导研究的分析。

我们采用 PLA 检测法检测 MST1 与 MST2 在 HEK-293 和 iHSC 细胞中的相互作用。细胞经固定、透化处理后，使用多种抗体进行染色，随后 原位 根据PLA方案进行扩增（图1）。为检测MST1/MST2异源二聚体的水平，使用MST1和MST2抗体对细胞进行染色（图1A，1C，和1G）。作为阳性对照，我们还使用了ERK和pERK抗体，这两种抗体在ERK激活的细胞中应处于邻近位置（图1B 和 1F）。缺乏 MST1 和 MST2 的细胞未显示 PLA 信号（图1C）。仅用两种抗体中的一种进行染色的细胞同样不显示 PLA 信号（图1G这些结果表明，HEK-293细胞和iHSC细胞中...

本文展示了如何利用邻近连接实验（PLA）以高灵敏度在固定细胞中可视化MST1/MST2异源二聚体的形成。

受调控的蛋白质-蛋白质相互作用是多种信号传导事件的指导性原则，而此类事件的检测是……中的重要环节

原位邻近连接技术（PLA）是一种能够在固定组织和细胞中检测蛋白质间相互作用的技术。该技术无需转基因表达或额外的其他技术手段，即可识别并定量蛋白质之间的相互作用。其唯一要求是具备可与DNA寡核苷酸修饰的高效特异性抗体。在组织中，MST1 和 MST2 主要以活性同源二聚体形式存在，但致癌刺激可增加 MST1 与 MST2 异源二聚体的水平，而此类异源二聚体是无活性的。在使用针对目标蛋白的特异性一抗孵育后，加入特殊的特异性二抗，每种二抗均连接了一条独特且较短的互补 DNA 链，并被添加至加样孔中，以结合一抗。如果目标蛋白形成了异源二聚体，则结合在蛋白上的一抗和二抗将彼此靠近。在此状态下，通过后续加入两种成环DNA寡核苷酸，第二抗体上连接的DNA链可发生相互作用。经过扩增反应后，DNA环可实现数百倍的复制，并由层级互补的寡核苷酸探针产生荧光信号。因此，每个检测到的信号均表现为独立的荧光点，可根据显微镜图像将其定位至特定的亚细胞位置。实验前一天，向16孔板中加入50至100微升小鼠层粘连蛋白或聚-L-赖氨酸进行包被，并在37摄氏度下孵育。30分钟后去除冷溶液，用胰蛋白酶消化细胞，将15,000至25,000个细胞接种至16孔板的每个孔中。将细胞置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育24小时。24小时后，从孔中移除培养基，并用PBS轻轻洗涤细胞。使用移液器以尽量降低样本损失的风险，然后吸去PBS，并通过每孔加入50微升4%多聚甲醛（PFA）固定细胞，在室温下静置孵育10分钟，期间不进行震荡。切勿将溶液直接滴加到细胞上，以免导致细胞脱落。固定后，用 TBST 轻轻振荡洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。接着对细胞进行通透处理，在室温下孵育 10 分钟，期间不振荡。通透完成后，用 TBST 振荡洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。除去 TBST 后，向每个孔中加入一滴封闭液，并将切片置于预热的湿盒中，于 37 摄氏度孵育一小时。稀释一抗。使用微量移液器去除封闭液，但切勿让切片干燥。涡旋混匀后，向相应的孔中加入40微升稀释的抗体溶液，在预热的湿盒中37摄氏度孵育一小时。孵育期间，用抗体稀释液稀释两种PLA探针。每个样本准备40微升PLA探针。孵育一小时后，吸去抗体溶液，用 TBST 在室温下洗涤载玻片两次，每次五分钟。轻轻移除载玻片上的 TBST，每孔加入 40 µL PLA 探针溶液。将载玻片置于预热的湿盒中，在 37 °C 下孵育一小时。使用前立即用高纯度水涡旋并稀释连接反应原液1至5至所需体积。每个孔需要40微升连接溶液。孵育结束后，从载玻片上移除PLA溶液，并在室温下用TBST振荡洗涤两次，每次五分钟。从冰箱中取出连接酶时使用预冷的冰块，并在将其加入细胞前涡旋混匀，用连接反应液稀释。移除载玻片上的TBST溶液，每孔加入40微升连接反应酶混合液。将载玻片置于预热的湿盒中，在37摄氏度孵育30分钟。孵育后，吸去溶液，用 TBST 在室温下振荡洗涤两次，每次五分钟。避免将孔板暴露于强光下，因为试剂对光敏感。在最后一次洗涤期间，使用前立即用高纯水涡旋并稀释所需体积的扩增溶液。将聚合酶置于冰上或冷却块中，在加入细胞前轻轻涡旋并用扩增溶液稀释。吸去各孔中的TBST，每孔加入40 µL扩增溶液。将切片置于黑暗、预热的湿盒中，在37°C下孵育100分钟。孵育结束后，从载玻片上吸除扩增聚合酶溶液，并在室温下用TBST洗涤两次，每次十分钟。彻底移除载玻片上的反应腔室及加样孔周围的硅胶。用刀片刮去残留的硅胶颗粒。在载玻片上绘制网格，以分隔每个孔。加入约 40 µL 含 DAPI 的封片剂，确保盖玻片下无气泡产生。使用指甲油固定盖玻片。固定后20分钟即可进行显微分析，但在实际操作中，我们发现次日进行图像分析最为方便。为分析样品，我们使用Leica SP8共聚焦激光扫描显微镜。图中A至D面板展示了原位邻近连接实验的结果，用于可视化人胚胎肾细胞中MST1与MST2蛋白之间的紧密邻近关系；E至H面板则展示了人施万细胞中的相应结果。所有图中，细胞核经DAPI染色呈蓝色，红色点状信号表示由所指示蛋白之间紧密邻近所产生的阳性邻近连接实验信号。图A显示MST1与MST2之间的邻近关系，图B显示ERK与其磷酸化形式phosphoERK的邻近关系，因为这些表位位于同一蛋白上。图C为阴性对照，其中细胞同时表达MST1和MST2；图D为第二个阴性对照，使用针对MST1和ERK的抗体进行染色，这两种蛋白预期彼此之间不发生邻近结合。图E和图F分别显示雪旺细胞中MST1与MST2、ERK与phosphoERK之间的邻近信号。图G和图H为阴性对照，仅使用MST1抗体或MST1与ERK抗体进行染色。必须使用不发生交叉反应的一抗，确保其仅识别异源二聚体中的一个成员。同时需注意：使用不同的枪头以避免一抗和PLA探针之间的交叉污染，避免触碰孔板底部，并避免将液体直接加在样本上。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用原位邻近连接技术（in situ PLA）在固定细胞中研究蛋白质二聚化。

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科研

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Biochemistry

生物化学

原位近接结扎法检测蛋白异构体的 Heterodimerization

本文展示了如何利用邻近连接技术（PLA），结合特异性抗体来可视化固定细胞中骨形态发生蛋白（BMP）信号通路。该技术使我们能够追踪内源性BMP激活的效应复合物在细胞核中的累积，并在BMP4刺激条件下随时间定量其表达水平。...

使用 BMP4 下游信号效应复合物的检测 原位 PLA，一种邻近连接检测技术

本视频介绍了用于研究线虫细胞中原位蛋白质-蛋白质相互作用的邻近连接分析技术。当目标蛋白质彼此靠近时，在连接有二抗的PLA探针的帮助下，可形成环状DNA模板。随后使用扩增溶液对探针进行扩增，产生一条长的单链DNA，再通过检测探针的杂交，实现细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的定位。...

原位蛋白质-蛋白质相互作用研究的邻近连接实验

本方案演示了如何利用邻近连接技术检测 原位 蛋白质-蛋白质相互作用在 果蝇 幼虫神经肌肉接头。利用该技术，Discs large 和 Hu-li tai shao...

检测 原位 蛋白质-蛋白质复合物在 果蝇 利用邻近连接技术检测幼虫神经肌肉接头

在此，我们介绍一种高灵敏度可视化和定量固定细胞中内质网与线粒体之间内源性相互作用的方法。该方案采用了一种优化的 原位 靶向线粒体相关膜界面处的三磷酸肌醇受体/葡萄糖调节蛋白75/电压依赖性阴离子通道/亲环素D复合物的邻近连接...

内质网与线粒体相互作用的研究方法 原位 固定细胞中的邻近连接测定

蛋白质-蛋白质相互作用可发生在细胞的细胞核和细胞质中。为了研究这些相互作用，通常采用传统的共免疫沉淀法和现代的邻近连接技术。在本研究中，我们比较了这两种方法，以可视化NF90-RBM3相互作用在细胞核和细胞质中的分布情况。...

通过免疫共沉淀法在核组分和胞质组分中可视化蛋白质-蛋白质相互作用 原位 邻近连接实验

在此演示了如何 原位 邻近连接实验（Proximity Ligation Assay, PLA）可用于检测和可视化在基因毒性应激条件下悬浮培养细胞中ATM与p53之间的直接蛋白质-蛋白质相互作用。...

利用邻位连接技术在悬浮细胞培养物中检测和可视化DNA损伤诱导的蛋白质复合物

本文介绍了一种利用生物膜干涉技术（BLI）监测炭疽毒素组装与解聚过程的实验方案。在生物传感器表面完成毒素复合物的组装与解聚后，将大分子蛋白复合物从传感器表面释放，进而通过电子显微镜和质谱技术分别对其进行可视化观察及组分鉴定。...

利用质谱和电子显微镜分析在生物层干涉技术生物传感器上组装并释放的动态蛋白质复合物

本方案描述了一种无需校准的蛋白质同源寡聚化定量方法 体外...

无需校准 体外 使用商用仪器和免费开源亮度分析软件定量检测蛋白质同源寡聚化

同源J结构域蛋白与Hsp70分子伴侣协同作用，参与从蛋白质折叠到降解等多种生物学过程。本文介绍了一种原位邻近连接实验方法，可用于在细菌、酵母和人类细胞中监测这些短暂形成的分子伴侣复合物。...

原位监测细菌、酵母和人类细胞中瞬时形成的分子伴侣复合物

本方案演示了使用邻近连接技术检测蛋白质-蛋白质相互作用 原位 在 秀丽隐杆线虫...

利用邻位连接实验在 C. elegans 生殖系中检测核糖核蛋白复合物的原位组装

D-环捕获（DLC）和D-环延伸（DLE）实验利用邻近连接原理结合定量PCR，用于定量检测酿酒酵母（Saccharomyces...

同源重组中间体的检测 通过 邻近连接与定量 PCR 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

学习原位近邻连接分析技术检测固定细胞中MST1/MST2蛋白异构体的异源二聚化。该方法利用特异性抗体和DNA探针实现高灵敏度可视化，无需转基因表达即可研究蛋白相互作用动态。

利用双分子荧光互补技术检测蛋白异构体异源二聚化原位邻近连接实验

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利用双分子荧光互补技术检测蛋白异构体异源二聚化 原位 邻近连接实验

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