原位近接结扎法检测蛋白异构体的 Heterodimerization

原位接近结扎分析或PLA，是一种能够检测蛋白质、附着组织和细胞之间的相互作用的技术。蛋白质之间的关联可以识别和量化，而无需转基因表达或额外的技术。唯一的要求是提供特定的高效抗体，可以使用DNA寡核苷酸进行修饰。

在组织中，MST1 和 MST2 主要作为活性同质体存在，但原生刺激可增加 MST1 MST2 异质剂的水平，此类异质剂处于非活动状态。与感兴趣的蛋白质进行特定底基因抗体的孵育后，将特殊的特异性二级抗体添加到插槽中，与附着在该蛋白上的独特、短、免费DNA链相连，以结合初级抗体。如果问题中的蛋白质是异质化的，则与它们结合的初级抗体和二级抗体都将非常接近。

在此状态下，第二个抗体上附加的DNA链可以通过随后添加另外两个形成圆的DNA寡核苷酸进行相互作用。在扩增反应和荧光信号通过水平的互补寡核苷酸探针产生荧光信号后，DNA圆可以进行几百倍的复制。因此，每个检测到的信号都可视化为单个荧光点，可以根据显微镜图像分配给特定的亚细胞位置。

在实验前一天，通过加入50至100微升小鼠层胺或聚L-lysine，在37摄氏度下孵育，对16个密室良好的幻灯片进行涂装。30分钟后去除冷溶液，使用 Trypsin 和板 15，000 到 25，000 个细胞每井分成 16 个良好的腔滑梯。在37摄氏度的加湿5%二氧化碳培养箱中孵育细胞24小时。

24 小时后，从井中取出介质，用 PBS 轻轻清洗细胞。使用微管，以尽量减少样品的风险，然后吸气PBS和修复细胞，通过添加50微升4%PFA每井和孵化10分钟室温没有搅拌。不要将溶液直接移液到细胞上，因为这可能导致细胞分离。

固定后，用TBST清洗细胞三次，每次用轻度搅拌五分钟。接下来渗透细胞，在室温下孵育10分钟，无搅拌。渗透完成后，用TBST清洗细胞三次，每次搅拌洗涤五分钟。

去除 TBST 后，将一滴阻尼溶液添加到每个孔中，并在预热湿度室中孵化幻灯片一小时，温度为 37 摄氏度。稀释原抗体。使用微管拆下阻塞溶液，但不允许滑轨干燥。

Vortex 将稀释的抗体溶液的 40 微升添加到适当的孔中，并在预热湿度室中孵育样品在 37 摄氏度下一小时。在孵育过程中，用抗体稀释剂稀释两个PLA探针。每个样品准备40微升的PLA探头。

孵育一小时后，吸出抗体溶液，并在室温下用TBST洗涤两次，用TBST清洗五分钟。从滑轨中轻轻取出 TBST，并在每个孔中加入 40 微升的 PLA 探针溶液。在37摄氏度的预热湿度室中孵育滑梯一小时。

在使用前立即将连接液中所需的体积 1 至 5 中的涡流稀释。每井需要40微升的结扎溶液。孵育后，从幻灯片上取出PLA溶液，在TBST中清洗两次，在室温下搅拌五分钟。

从冰柜中取出连体时，在将其添加到细胞中之前，使用冷冻块，用结扎溶液进行涡流和稀释。从幻灯片上取出 TBST，并将 40 微升的结扎连接溶液添加到每孔中。在37摄氏度的预热湿度室中孵育30分钟。

孵育后吸气溶液，用TBST洗涤两次，在室温下搅拌五分钟。避免将井暴露在明亮的光线下，因为试剂对光敏感。在上次洗涤过程中，在使用前立即将高纯度水中的放大溶液的体积进行涡流和稀释。

将聚合酶放在冰上或冷却块中，然后加入细胞漩涡，用扩增溶液稀释。从油井中吸出 TBST，并在每口油井中加入 40 微升的扩增溶液。在37摄氏度的黑暗预热湿度室中孵育100分钟。

孵育后，从幻灯片中吸出扩增聚合酶溶液，并在室温下在TBST中各洗涤两次10分钟。从滑轨上完全拆下油井周围的腔室和硅胶。用剃须刀刮掉剩下的硅胶珠子。

在幻灯片上绘制一个分隔每个井的网格。使用 DAPI 添加约 40 微升的安装介质，确保没有气泡在盖滑下被捕获。使用指甲油固定盖玻璃。

固定后20分钟内即可进行显微分析，但在实践中我们发现第二天进行图像分析最方便。为了分析样品，我们使用 Leica SP8 配置激光扫描显微镜。此处显示的示例包括:在面板 A 至 D 中，将人类胚胎肾细胞中的 MST 1 和 MST2 蛋白质的接近性可视化，面板 E 到 H.In 中所有面板中的人类 Schwann 细胞被 DAPI 染成蓝色，红点表示指示的蛋白质之间的接近产生的正接近结扎检测信号。

面板 A 显示 MST1 和 MST2 的接近性，面板 B 显示 ERK 和磷的接近性，因为这些表位位于同一蛋白质上。面板 C 表示负对，因为这些细胞（如 MST1 和 MST2）以及面板 D 表示沾染 MST1 和 ERK 抗体的第二次阴性对照，预计它们不会彼此接近。面板 E 和 F 显示 MST1 与 MST2 和 ERK 与 Schwann 细胞中磷磷的接近性。

面板 G 和 H 是仅与 MST1 抗体或 MST1 和 ERK 抗体染色的阴性对比。必须使用非交叉反应原抗体，因为它应该只识别异质剂的一个成员。此外，重要的是要记住使用不同的提示，以避免初级抗体和PLA探针交叉污染，避免接触井底，并避免直接在样品上移液。

看完这段视频后，你应该对如何使用原位PLA研究固定细胞中的蛋白质二化有了很好的了解。