Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

这种方法可以帮助回答有关蜱虫昆虫学的关键问题，例如从空间和时间上评估蜱虫中是否存在活细菌。该技术的主要优点是它不需要对蜱虫进行切片或昂贵的设备，并且它允许基因转录本的空间和时间可视化。一般来说，刚接触这项技术的人会很挣扎，因为它涉及多个步骤和试剂。

但是，这种技术并不费力。虽然可能需要大约三天才能完成，但每天的动手时间只有几个小时。准备时，在收集肠道前 48 至 72 小时喂食收集到的蜱虫。

要从蜱虫中解剖肠道，将 20 至 30 微升 MEMFA 溶液添加到干净的载玻片中。然后将勾号放入 MEMFA 中，并将焦点调整到勾号的头部。现在，使用一对无菌的高碳钢剃须刀片切掉盾片的头部区域，使蜱虫的身体完好无损。

接下来，轻轻按压身体，将肠道憩室和唾液腺推出身体角质层。然后在不损坏内脏的情况下，小心地将它们与唾液腺分开，并小心地将伤口舀到剃须刀片上。将所有收获的内脏收集在 1.5 毫升管中，溶于 500 微米的 MEMFA 中。

然后将试管在室温下轻轻摇动孵育 1 小时。第二天，按照文本方案中的指示对组织进行脱水，并将其储存在零下 20 摄氏度。要准备网篮，首先，使用手术刀上加热的单刃刀片切下 2 毫升或 5 毫升卡口离心管的底部。

完成切割之前，刀片可能需要重新加热几次。接下来，切出一个 110 微米的尼龙网的正方形，该网格比新开口略大。然后，在设置为中/低火的热板上将管子轻轻压入网孔中，将网片粘合到开口处，直到制作出良好的 seel 效果。

冷却后，修剪掉多余的网格，并确保没有间隙。制作 24 个这样的篮子以匹配 24 孔板。接下来，在 24 孔板的盖子上开孔，使样品篮的边缘能够夹住孔而不会掉下来。

完成后，组装好的样品篮应完全放入孔中。现在，使用这款合适的篮架在整个原位杂交过程中相对轻松地将篮子从一个板转移到另一个板。使用两个这样的板，这样当样品在一个板中孵育时，另一个板可以为下一次洗涤做好准备。

本节介绍原位杂交的某些步骤。有关完整说明，请参阅文本协议。首先，将每个固定的组织样品转移到标记的样品篮中。

按实验条件组织板，每种条件至少染色五个内脏。首先，轻轻地使样品再水化。通过在每次洗涤中逐渐增加 PBS-T 与乙醇的比例来避免引入气泡。

在第一天，在两小时的预杂交步骤之后，不要丢弃杂交缓冲液，而是将其储存起来以备将来在检测期间使用。稍后，当用探针杂交溶液处理样品时，用铝箔紧贴板以防止溶液蒸发。第二天，将预留的杂交缓冲液加载到 24 孔板中，并将板加热至 60 摄氏度。

当天晚些时候，要去除所有痕量探针和杂交缓冲液，请用 2x SSC 洗涤样品两次，每次洗涤 3 分钟。然后在 60 摄氏度下用 2x SSC 洗涤样品 3 次，每次洗涤 20 分钟。然后在封闭缓冲液中制备一抗。

将 500 微升这种混合物加载到每个孔中。封闭步骤后，在室温下孵育约 4 小时或在 4 摄氏度下孵育过夜。第三天，在显色底物中运行显色反应。

用铝箔覆盖样品板。在反应过程中，定期用解剖显微镜检查是否过度染色。第四天，重要的是在灯箱上孵育和漂白，因为这样可以去除样品中的任何色素沉着或 Bouin 溶液中的着色，并增强探针信号以实现清晰的可视化。

然后，在用 SSC 洗涤后，通过将篮子倒置到新的 24 孔板中，小心地转移肠道样品。在孔中时，使用 70% 乙醇彻底冲洗篮子。然后对样品进行成像。

在使用之前评估 RNA 探针的质量至关重要。探针可以在甲醛凝胶上检查。如果它们显示为明亮、离散的条带，则它们的质量很好。

染色时，生物重复之间以及个体肠道的七对憩室之间的分布变化是正常的。因此，最好每种情况至少对 5 个内脏进行染色，以了解平均染色模式。总体成功的最佳方法是通过比较每种情况下的正义和反义样品的染色来衡量的。

两者的开发时间必须相同。正义样品应具有最少或没有紫色，而反义样品应显示具有最小背景的稳健染色。至关重要的是，组织必须完全浸入染色剂中才能均匀曝光。

避免显色反应的过度发展很重要。这可能导致大量的背景染色，并且正义样品可能开始看起来像反义样品。影响结果的另一个因素是事先喂食了多少刻度。

未喂食或仅喂食 24 小时的蜱虫很难处理。他们的肠道更容易受损，而且染色效果不佳。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两天半到三天内完成。

在尝试此程序时，请务必记住在开始实验之前准备好试剂和材料表中列出的所有用品。感谢您的观看，祝您的实验好运。