全挂载原位杂交法可视化蜱内脏微生物群
2018年6月1日
在这里, 我们提出一个协议, 以空间和世俗评估的存在, 在蜱内脏有活力的微生物, 使用改良的全芒原位杂交方法。
这种方法可以帮助回答有关蜱虫昆虫学的关键问题，例如从空间和时间上评估蜱虫中是否存在活细菌。该技术的主要优点是它不需要对蜱虫进行切片或昂贵的设备，并且它允许基因转录本的空间和时间可视化。一般来说，刚接触这项技术的人会很挣扎，因为它涉及多个步骤和试剂。
但是，这种技术并不费力。虽然可能需要大约三天才能完成，但每天的动手时间只有几个小时。准备时，在收集肠道前 48 至 72 小时喂食收集到的蜱虫。
要从蜱虫中解剖肠道，将 20 至 30 微升 MEMFA 溶液添加到干净的载玻片中。然后将勾号放入 MEMFA 中，并将焦点调整到勾号的头部。现在，使用一对无菌的高碳钢剃须刀片切掉盾片的头部区域，使蜱虫的身体完好无损。
接下来，轻轻按压身体，将肠道憩室和唾液腺推出身体角质层。然后在不损坏内脏的情况下，小心地将它们与唾液腺分开，并小心地将伤口舀到剃须刀片上。将所有收获的内脏收集在 1.5 毫升管中，溶于 500 微米的 MEMFA 中。
然后将试管在室温下轻轻摇动孵育 1 小时。第二天，按照文本方案中的指示对组织进行脱水，并将其储存在零下 20 摄氏度。要准备网篮，首先，使用手术刀上加热的单刃刀片切下 2 毫升或 5 毫升卡口离心管的底部。
在完成切割之前，刀片可能需要重新加热几次。接下来，切出一个 110 微米的尼龙网的正方形，该网格比新开口略大。然后，在设置为中/低火的热板上将管子轻轻压入网孔中，将网片粘合到开口处，直到制作出良好的 seel 效果。
冷却后，修剪掉多余的网格，并确保没有间隙。制作 24 个这样的篮子以匹配 24 孔板。接下来，在 24 孔板的盖子上开孔，使样品篮的边缘能够夹住孔而不会掉下来。
完成后，组装好的样品篮应完全放入孔中。现在，使用这款合适的篮架在整个原位杂交过程中相对轻松地将篮子从一个板转移到另一个板。使用两个这样的板，这样当样品在一个板中孵育时，另一个板可以为下一次洗涤做好准备。
本节介绍原位杂交的某些步骤。有关完整说明，请参阅文本协议。首先，将每个固定的组织样品转移到标记的样品篮中。
按实验条件组织板，每种条件至少染色五个内脏。首先，轻轻地使样品再水化。通过在每次洗涤中逐渐增加 PBS-T 与乙醇的比例来避免引入气泡。
在第一天，在两小时的预杂交步骤之后，不要丢弃杂交缓冲液，而是将其储存起来以备将来在检测期间使用。稍后，当用探针杂交溶液处理样品时，用铝箔紧贴板以防止溶液蒸发。第二天，将预留的杂交缓冲液加载到 24 孔板中，并将板加热至 60 摄氏度。
当天晚些时候，要去除所有痕量探针和杂交缓冲液，请用 2x SSC 洗涤样品两次，每次洗涤 3 分钟。然后在 60 摄氏度下用 2x SSC 洗涤样品 3 次，每次洗涤 20 分钟。然后在封闭缓冲液中制备一抗。
将 500 微升这种混合物加载到每个孔中。封闭步骤后，在室温下孵育约 4 小时或在 4 摄氏度下孵育过夜。第三天，在显色底物中运行显色反应。
用铝箔覆盖样品板。在反应过程中，定期用解剖显微镜检查是否过度染色。第四天，重要的是在灯箱上孵育和漂白，因为这样可以去除样品中的任何色素沉着或 Bouin 溶液中的着色，并增强探针信号以实现清晰的可视化。
然后，在用 SSC 洗涤后，通过将篮子倒置到新的 24 孔板中，小心地转移肠道样品。在孔中时，使用 70% 乙醇彻底冲洗篮子。然后对样品进行成像。
在使用之前评估 RNA 探针的质量至关重要。探针可以在甲醛凝胶上检查。如果它们显示为明亮、离散的条带，则它们的质量很好。
染色时，生物重复之间以及个体肠道的七对憩室之间的分布变化是正常的。因此，最好每种情况至少对 5 个内脏进行染色，以了解平均染色模式。总体成功的最佳方法是通过比较每种情况下的正义和反义样品的染色来衡量的。
两者的开发时间必须相同。正义样品应具有最少或没有紫色，而反义样品应显示具有最小背景的稳健染色。至关重要的是，组织必须完全浸入染色剂中才能均匀曝光。
避免显色反应的过度发展很重要。这可能导致大量的背景染色，并且正义样品可能开始看起来像反义样品。影响结果的另一个因素是事先喂食了多少刻度。
未喂食或仅喂食 24 小时的蜱虫很难处理。他们的肠道更容易受损，而且染色效果不佳。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两天半到三天内完成。
在尝试此程序时，请务必记住在开始实验之前准备好试剂和材料表中列出的所有用品。感谢您的观看，祝您的实验好运。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本文介绍了一种评估蜱虫肠道活性微生物群的协议，使用修改的整体原位杂交方法。该方法允许在不需要昂贵设备或蜱虫切片的情况下进行基因转录本的空间和时间可视化。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 昆虫学
- 基因表达分析
背景
- 理解蜱虫微生物群对于研究蜱虫生物学至关重要。
- 活性细菌的存在可能影响蜱虫行为和生理。
- 传统方法可能无法提供必要的空间和时间数据。
- 该协议旨在用一种简单的方法来填补这一空白。
研究目的
- 开发一种可视化蜱虫肠道活性微生物群的方法。
- 空间和时间评估细菌的存在。
- 提供一种对于该领域新手研究者可访问的技术。
使用的方法
- 修改的整体原位杂交技术。
- 通过在收集肠道之前喂养48至72小时来准备蜱虫。
- 在蜱虫肠道中可视化基因转录本。
- 涉及试剂的多个步骤，但不是劳动密集型。
主要结果
- 成功可视化蜱虫肠道中的活性微生物群。
- 展示了空间和时间评估的能力。
- 协议在约三天内完成，只需每天几小时的实际操作时间。
- 蜱虫昆虫学研究者可访问的方法。
结论
- 该协议为研究蜱虫微生物群提供了一个有价值的工具。
- 它增强了对蜱虫-细菌相互作用的理解。
- 未来的应用可能包括更广泛的生态和健康相关研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Spatial and temporal visualization of microbiota in tick guts using whole-mount in situ hybridization enables direct assessment of vector-pathogen-microbiota interactions. This capability supports mechanistic de-risking in vector-borne disease research and informs early-stage target validation for interventions affecting pathogen transmission. The method's qualitative and distributional outputs are highly relevant for translational research and portfolio triage in infectious disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microbiota-pathogen interactions within intact vector tissues.
- Supports biological de-risking by clarifying spatial distribution of bacterial species.
- Facilitates functional target validation for interventions modulating vector microbiota.
- Provides qualitative data to inform predictive confidence in early discovery.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for downstream screening of microbiota-modulating compounds.
- Delivers reproducible spatial and temporal readouts for assay standardization.
- Enables robust comparison of experimental conditions through qualitative visualization.
- Supports platform reuse for diverse vector and pathogen studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling natural vector-pathogen-microbiota environments.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of microbiota-targeted strategies.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for vector-borne disease programs.
- Enhances predictive de-risking by visualizing microbiota changes during vector feeding.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for vector-borne disease research, supporting hypothesis testing and mechanistic studies prior to lead identification.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven assessment of microbiota influence on pathogen transmission.
- Screening: Provides reproducible, qualitative outputs for assay development and condition comparison.
- Analytics: Supports spatial and temporal measurement of bacterial distribution in vector tissues.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models of vector-pathogen interaction.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse vector and microbiota research initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in vector-pathogen studies.
- Operational Value: Standardizes visualization workflows and enhances reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in infectious disease portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of microbiota-targeted interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tick dissection and in situ hybridization protocols.
- Needs standard laboratory instrumentation and imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and staining procedures.
- Adaptable to other vector systems with protocol optimization.
- Dependent on probe quality and careful control of staining conditions for reliable outputs.
