Name: 映射代谢: 直接在组织中监测乳酸脱氢酶活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: 了解如何在组织样本中直接检测乳酸脱氢酶活性，以绘制酶活性的空间分布图。该方法使用冷冻切片和NAD(P)H显色反应，帮助研究人员精确定位毛囊干细胞等区域的代谢活动。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

HAC 是丽塔·艾伦基金会（http://www.ritaallenfoundation.org）的米尔顿·E·卡塞尔学者。本研究由以下基金资助：美国国立普通医学科学研究所 R01 GM081686、R01 AR070245、美国国立普通医学科学研究所 R01 GM0866465 以及伊莱 &amp;#38; 埃迪丝·布罗德再生医学中心 &amp;#38; 干细胞研究（Rose Hills 和 Hal Gaba 奖项）、Iris Cantor 女性健康中心/UCLA CTSI 美国国立卫生研究院资助号 UL1TR000124、白血病与淋巴瘤学会、Jonsson 综合癌症中心授予 WEL 和 HAC 的 Impact 奖项。本出版物所报告的研究由美国国立卫生研究院国家癌症研究所资助奖项编号 P50CA092131 支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。HAC 是 Eli &amp;#38; 埃迪丝·布罗德再生医学中心 &amp;#38；干细胞研究，加州大学洛杉矶分校分子生物学研究所，以及加州大学洛杉矶分校生物信息学跨系项目。

所描述的所有实验均经加州大学洛杉矶分校动物护理委员会批准。
1. 制备小鼠冷冻皮肤切片
<ol>
	<li>根据机构政策对小鼠实施安乐死。 
	注意：遵循机构关于防护服的规定。所有涉及动物的实验方案必须经过机构动物护理委员会批准。</li>
	<li>使用动物毛发修剪器去除小鼠体表毛发。</li>
	<li>使用剪刀在皮肤上做切口。用镊子将皮肤提起并脱离小鼠躯体，再用剪刀将皮肤组织剪下。</li>
	<li>用冷冻剂化合物填充冷冻模具（参见材料表）。</li>
	<li>用尖头镊子将皮肤组织放入已填充的冷冻模具中。调整皮肤方向，使后续切片可获得从表皮至真皮、皮下组织及肌肉的完整横截面（图2）。 
	注意：如有可能，将实验组和对照组小鼠的组织置于同一冷冻模具中包埋，以便后续切片至同一载玻片并同时处理。注意避免产生气泡。</li>
	<li>将冷冻模具置于装有干冰的冰桶内金属平板上，使其冷冻。持续观察皮肤组织的方向，必要时进行调整。 
	注意：操作干冰时应佩戴低温防护手套。</li>
	<li>将冷冻模具转移至 -80 °C 超低温冰箱中保存。样本可在冰箱中保存约3个月，而不会显著丧失酶活性。切勿让冷冻切片干燥。</li>
	<li>在 -20 °C 条件下使用冷冻切片机进行切片，制备厚度为 7 - 10 µm 的组织切片，以获得最佳皮肤形态结构21。</li>
</ol>
2. 染色用玻片的制备
<ol>
	<li>确定待检测的切片组。设置一个对照切片，不添加NAD；另设一个对照切片，不添加底物乳酸。同时包括一个来自先前研究过的冷冻组织包埋块的阳性对照切片。</li>
	<li>用4%甲醛对含有皮肤切片的玻片进行短暂固定，每张玻片加入1 mL 4%甲醛溶液，通过移液操作处理，或在处理多张玻片时，将玻片浸入盛有4%甲醛的容器中，固定5分钟。 
	注意：固定可确保皮肤在后续操作中不会从玻片上脱落，并保持皮肤的形态结构。 
	警示：甲醛为致癌物且具有危害性；操作时需佩戴手套，避免接触皮肤，并在化学通风橱中进行此步骤。</li>
	<li>每张玻片使用至少1 mL磷酸盐缓冲液（pH 7.4）进行洗涤，可通过移液或浸洗方式完成。</li>
</ol>
3. 配制染色液
<ol>
	<li>根据所需染色液的量，取适量试管，将乳酸脱氢酶活性染色试剂（50 mM Tris pH 7.4、750 µM NADP、80 µM phenazine methosulfate (PMS)、600 µM 硝基四氮唑蓝氯化物、30 mM 乳酸）混合后涡旋振荡。 
	注意：1 mL 染色液足以完全覆盖一张载玻片。</li>
	<li>配制第二种溶液，其中包含除 NAD 外的所有试剂；再配制第三种溶液，其中包含除乳酸外的所有试剂。</li>
</ol>
4. 将切片在染色液中孵育
<ol>
	<li>轻轻将染色液或对照溶液加到已制备的载玻片上，确保完全覆盖组织切片（每张载玻片使用1 mL即可）。若同时处理多张载玻片，可将所有载玻片同时浸入染色液中（确保容器内有足够溶液完全覆盖组织切片）。</li>
	<li>将载玻片置于湿润环境中，37 °C 避光孵育。若染色液覆盖在载玻片上表面，需将载玻片置于湿润环境中，以防溶液蒸发。</li>
</ol>
5. 监测玻片
<ol>
	<li>通过目视观察染色液从无色变为蓝色的过程。当样本达到理想的蓝色程度后，移除染色液以终止反应。 
	注意：对于皮肤组织，10 分钟已足够。染色时间需根据器官类型及酶活性进行调整。</li>
	<li>使用移液管滴加磷酸盐缓冲液（每张载玻片1 mL即可）或浸洗方式冲洗载玻片。 
	注意：相互比较的样本必须在染色液中保持相同的时间。</li>
</ol>
6. 复染与封片
<ol>
	<li>当切片达到适当的蓝色程度时，向切片上滴加复染剂。 
	注意：使细胞核呈现红色或绿色的复染剂可与甲臜沉淀产生的蓝色形成良好对比。</li>
	<li>使用水性或非水性封片介质封片22。根据盖玻片的大小，滴加1至3滴（40 - 50 µL）封片介质即可。</li>
</ol>
7. 图像采集与定量分析
<ol>
	<li>在光学显微镜下观察载玻片，对实验样本、对照样本以及所有阴性对照样本分别在10X、20X和40X放大倍数下进行拍照。</li>
	<li>使用图像分析软件测定不同区域蓝色染色的强度。</li>
</ol>

<ol><li>Boonacker, E., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+cytochemical+techniques+for+metabolic+mapping+in+living+cells%2C+with+special+reference+to+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).</li>
<li>Seidler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tetrazolium-formazan+system%3A+Design+and+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry.</a> Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).</li>
<li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+Noorden%2C+CJF+%22Enzyme+Histochemistry%3A+A+Laboratory+Manual+of+Current+Methods%22">Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods</a>. , Bios. (1992).</li>
<li>Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+cytochemical+analysis+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+living+isolated+hepatocytes+of+European+flounder+for+rapid+analysis+of+xenobiotic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).</li>
<li>Negi, D. S., Stephens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+the+histochemical+localization+of+glucose-6-phoshate+dehydrogenase+in+animal+and+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues.</a> J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).</li>
<li>Boren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+localization+of+transketolase+activity+in+epithelial+cells+of+different+rat+tissues+and+subcellularly+in+liver+parenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells.</a> J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).</li>
<li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+metabolic+configurations+of+single+cells+within+complex+tissue+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments.</a> Cell Metab. , (2017).</li>
<li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+serum+lactate+dehydrogenase+in+renal+cell+carcinoma%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis.</a> PLoS One. 11, e0166482(2016).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+serum+LDH+in+small+cell+lung+cancer%3A+A+systematic+review+with+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biomark%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis.</a> Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).</li>
<li>Petrelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+role+of+lactate+dehydrogenase+in+solid+tumors%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+76+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies.</a> Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).</li>
<li>Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+and+function+of+lactate+dehydrogenase+A%3A+Therapeutic+potential+in+brain+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor.</a> Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).</li>
<li>Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+a+gene%3A+Multiple+genes+for+LDH+isozymes+provide+a+model+of+the+evolution+of+gene+structure%2C+function+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation.</a> Science. 189, 102-114 (1975).</li>
<li>Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+altered+activity+of+M-+and+H-isozyme+forms+of+human+lactate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase.</a> Proteins. 43, 175-185 (2001).</li>
<li>Holness, M. J., Sugden, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pyruvate+dehydrogenase+complex+activity+by+reversible+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation.</a> Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).</li>
<li>Yi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphofructokinase+1+glycosylation+regulates+cell+growth+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism.</a> Science. 337, 975-980 (2012).</li>
<li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+of+lactate+dehydrogenase+A+is+important+for+NADH%2FNAD%28%2B%29+redox+homeostasis+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells.</a> Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).</li>
<li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine-5+acetylation+negatively+regulates+lactate+dehydrogenase+A+and+is+decreased+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer.</a> Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).</li>
<li>Vanderlinde, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+total+lactate+dehydrogenase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Lab+Sci%22%5BJournal%5D)">Measurement of total lactate dehydrogenase activity.</a> Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).</li>
<li>Nelson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+imaging+of+patients+with+prostate+cancer+using+hyperpolarized+%5B1-%281%29%283%29C%5Dpyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate.</a> Sci Transl Med. 5, 198ra108(2013).</li>
<li>Flores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactate+dehydrogenase+activity+drives+hair+follicle+stem+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation.</a> Nat Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning tissues.</a> CSH Protoc. 2008, pdb prot4991 (2008).</li>
<li>Espada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-aqueous+permanent+mounting+for+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy.</a> Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).</li>
<li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+A+photochemically+stable+electron+mediator+between+NADH+and+various+electron+acceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors.</a> J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).</li>
</ol>

作者无任何竞争利益需要披露。

本文所述方法可用于监测组织内不同细胞类型或组织不同区域中乳酸脱氢酶或其他产生NADH或NADPH的代谢酶在时间进程中的活性。乳酸脱氢酶是理解干细胞和肿瘤生物学的重要酶，能够在单个细胞水平上监测其酶活性，有望为该酶的功能提供重要见解。
与其它方法相比，本方案的一个重要优势在于能够监测酶活性而不仅仅是蛋白质丰度，从而不仅可以获知乳酸脱氢酶存在的位置，还能明确其实际发挥功能的位置，提供更具结论性的信息。此处描述的方法可与免疫组织化学相结合，以便在同一组织样本中同时检测选定蛋白质（例如细胞谱系标志物）的表达水平和乳酸脱氢酶活性。与基于磁共振成像（MRI）的乳酸脱氢酶活性监测方法相比，本方案具有更高的空间分辨率，有助于确定组织中哪些特定细胞具有较高的酶活性。与基于荧光底物的代谢定位方法相比，本方案的信号检测不受自发荧光的限制1。Miller 及其合作者通过监测向甲臜的转化，对五种不同酶的时间依赖性和底物依赖性进行了类似分析7。研究发现这些反应遵循酶动力学的化学计量原理。Miller 及其合作者通过...

了解酶在组织中哪些位置具有高或低活性，对于理解发育和生理过程至关重要。转录本或蛋白质水平常被用作酶活性的替代指标。尽管此类研究可能提供一定信息，但它们无法提供对确定酶活性至关重要的信息，例如翻译后修饰、蛋白质复合物的存在，或酶的亚细胞定位。当直接测量酶活性时，通常是在匀浆化的蛋白裂解液中进行监测，而此类样本已不再包含混合物中单个细胞的信息，也无法反映组织内具有高或低活性的细胞的空间分布情况。
我们在此提供一种详细的实验方案，用于绘制组织样本中酶活性空间分布图。该方法基于早期研究，证明四唑盐可用于定位冷冻组织中脱氢酶、还原酶和氧化酶的活性。1采用这些方法时，当质子转移至四氮唑盐后，会形成一种水不溶性的甲臜。2,3葡萄糖-6-磷酸脱氢酶可生成NADPH和一个质子，并可通过四唑盐活性检测。该酶的活性已在欧洲鲽肝细胞中进行监测。4肺泡Ⅱ型细胞中5 肾脏的肾单位5四氮唑盐也已被用于监测冻存组织中转酮醇酶的活性6最近采用了一种类似的方法&#160;用于在相邻切片上监测同一组织中多种脱氢酶的活性7.
本文介绍了一种利用四氮唑盐来监测乳酸脱氢酶活性空间分布的方法（图1）。乳酸脱氢酶能够将糖酵解产生的丙酮酸转化为乳酸，也可催化其逆向反应。因此，乳酸脱氢酶的活性是决定丙酮酸进入三羧酸循环还是以乳酸形式分泌的关键因素之一。血液中的乳酸水平常用于诊断多种疾病，包括癌症8,9,10，因为乳酸升高可能提示机体存在疾病或损伤导致细胞受损，酶被释放。
乳酸脱氢酶基因有四种：LDHA、LDHB、LDHC 和 LDHD11。LDHA 和 LDHB 被认为是由早期 LDHA 基因复制而来12。乳酸脱氢酶以四聚体形式发挥活性，LDHA 和 LDHB 可各自形成同源四聚体，也可相互结合形成异源四聚体。据报道，LDHA 对丙酮酸具有更高的亲和力，而 LDHB 对乳酸具有更高的亲和力，并倾向于将乳酸转化为丙酮酸13。LDHA 启动子区域含有 HIF1α、cMYC 和 FOXM1 转录因子的结合位点11。此外，与其他多种糖酵解酶类似14,15，LDH 可发生翻译后修饰。成纤维细胞生长因子受体 1 可在 Y10 位点磷酸化 LDHA，促进四聚体形成；或在 Y83 位点磷酸化，促进 NADH 底物结合16。LDHA 还可发生乙酰化修饰17。因此，要全面理解 LDH 的活性，不仅需要监测 LDH 蛋白的表达水平，还需同时检测其酶活性。
除了本文介绍的方法外，已有其他方法用于监测乳酸脱氢酶活性。乳酸脱氢酶活性可通过分光光度法在均质化的蛋白裂解液中进行检测。当乳酸转化为丙酮酸时，可依据在340 nm处的吸光度测定NADH的生成；而当丙酮酸转化为乳酸时，则可监测NADH的减少18。乳酸脱氢酶活性也可通过磁共振成像（MRI）进行监测。13C标记的丙酮酸可被施用，并通过监测[1-13C]乳酸/[1-13C]丙酮酸的比值来反映丙酮酸向乳酸的转化。在癌组织中已观察到[1-13C]乳酸/[1-13C]丙酮酸比值升高19。尽管基于MRI的方法可提供正常组织和病变组织中乳酸脱氢酶活性的信息，但这些方法缺乏确定特定细胞内酶活性水平所需的空间分辨率。本文所提供的方法则能够提供组织区域乃至单个细胞水平上的乳酸脱氢酶活性信息。
使用 原位 活性检测实验发现，小鼠皮肤毛囊干细胞中乳酸脱氢酶的活性较高20我们还利用该方法检测了培养的胚胎干细胞中乳酸脱氢酶的活性，发现干细胞中的酶活性高于饲养层细胞。最后，我们检测了新鲜小鼠主动脉中乳酸脱氢酶的活性，观察到平滑肌细胞呈现染色阳性。本文详细描述了一种用于检测冷冻小鼠皮肤中乳酸脱氢酶活性的实验方案。

<table><tbody><tr><td>手术器械</td><td></td><td></td><td>用于采集安乐死小鼠的皮肤组织</td></tr><tr><td>Tissue-tek 冷冻模具 25 mm x 20 mm x 5 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9511236</td><td>用于冷冻小鼠皮肤</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9638938</td><td>用于固定冷冻模具</td></tr><tr><td>冰桶</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-106</td><td></td></tr><tr><td>干冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polysine 黏附载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-78</td><td></td></tr><tr><td>4% 甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-684</td><td>用水稀释</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-684</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>吩嗪甲基硫酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>硝基四氮唑蓝氯化物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>L-乳酸锂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2250</td><td>底物</td></tr><tr><td>37&amp;deg;C 培养箱（或组织培养箱）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Braziliant! 复染剂</td><td>Anatech</td><td>861</td><td>复染剂</td></tr><tr><td>封片介质</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-5000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>载玻片盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544D</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

绘制代谢图谱：在组织中直接监测乳酸脱氢酶活性

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

在空间和时间上定位酶活性对于理解正常组织和疾病状态下细胞行为的分子基础至关重要。原位代谢活性检测可提供有关组织内代谢活性空间分布的信息。本文提供了一种在组织样本中直接监测乳酸脱氢酶活性的详细实验方案。乳酸脱氢酶是决定摄入的葡萄糖通过有氧还是无氧糖酵解途径转化为能量的关键因素。将含有乳酸和NAD的溶液加入冷冻组织切片中。具有高乳酸脱氢酶活性的细胞会将提供的乳酸转化为丙酮酸，同时将提供的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）转化为NADH并释放一个质子；该反应可通过硝基四氮唑蓝还原为甲臜而被检测，甲臜呈现为蓝色沉淀物。我们描述了在小鼠皮肤中监测乳酸脱氢酶活性的详细步骤。应用此方案，我们发现皮肤中静息态毛囊干细胞的乳酸脱氢酶活性较高。将该方案应用于培养的小鼠胚胎干细胞时，结果显示胚胎干细胞的染色强度高于小鼠胚胎成纤维细胞。对新鲜分离的小鼠主动脉进行分析，发现染色主要出现在垂直于主动脉走向的平滑肌细胞中。本方法可用于在冷冻或新鲜组织中对产生质子的酶活性进行空间定位分析。

我们此前已报道过相关结果 原位 小鼠皮肤中的活性检测20如图所示 图3我们观察到，按照上述步骤操作时，毛囊基底部的毛囊干细胞表现出高水平的乳酸脱氢酶活性。这些结果通过皮肤毛囊干细胞的荧光激活细胞分选得到验证，并对分选后的细胞进行活性检测，进一步确认了干细胞区室中乳酸脱氢酶的高活性。
根据我们发现毛囊干细胞具有高乳酸脱氢酶活性的结果，我们进一步拓展了对培养的胚胎干细胞的研究。作为饲养层的小鼠胚胎成纤维细胞被单独分析，或在与胚胎干细胞共培养的条件下进行分析。为分析培养的细胞，吸除培养基后，细胞经短暂固定，随后按照上述方法与乳酸脱氢酶染色液孵育。我们观察到胚胎干细胞中的乳酸脱氢酶活性显著高于小鼠胚胎成纤维细胞（图4）。
<p class="jove_content" ...

我们描述了一种用于在组织样本中直接绘制能够生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NAD(P)H）+ H+ 的酶类其酶活性空间分布的实验方案。

在空间和时间上绘制酶活性图谱对于理解正常组织和疾病中细胞行为的分子基础至关重要。原位……

该方法有助于回答生物学领域中的关键问题，例如酶在组织不同位置的活性。该技术的主要优势在于，它能够使研究人员直接在组织样本中检测酶活性。开始此操作时，使用动物毛发修剪器去除小鼠的毛发。使用剪刀在背部皮肤上做切口。然后，提起皮肤并将其剪除。接着，用冷冻剂化合物填充冷冻模具。使用尖头镊子将皮肤组织放入冷冻模具中。摆放皮肤组织时，应使皮肤从表皮、真皮、皮下组织至肌肉的横切面可见。如果可能，将实验组和对照组小鼠的组织一同包埋在同一冷冻模具中，以便后续切片至同一张载玻片上并同时进行处理。注意避免产生气泡。将冷冻模具置于冰桶内干冰块的平坦表面上。如需储存，将冷冻模具转移至-80摄氏度超低温冰箱中。样本可在冷冻保存约三个月，而不会出现明显的酶活性损失。进行切片时，使用设定为负20摄氏度的冷冻切片机，将组织切成7至10微米厚的切片，以获得最佳的皮肤形态学结构。在此过程中，需准备一组待检测的载玻片，包括一张不加NAD的对照载玻片、另一张不加底物乳酸的对照载玻片，以及一张来自先前已检测过的冷冻组织块的阳性对照载玻片。用4%甲醛对载有皮肤切片的玻片进行短暂固定，持续五分钟。随后用PBS洗涤玻片。接着，在适当大小的离心管中将NADP、PMS、氯化硝基四氮唑蓝和乳酸等试剂涡旋混匀，用于乳酸脱氢酶活性染色。接下来，配制第二种溶液，其中包含除 NAD 外的所有试剂。随后，配制第三种溶液，其中包含除乳酸外的所有试剂。将载玻片浸入染色液或对照溶液中孵育时，需同时将载玻片放入溶液中。然后，在37°C的避光湿润环境中孵育。观察染色液由无色变为蓝色的过程。当样品达到理想的蓝色程度后，移除染色液并用PBS冲洗，以终止反应。随后，当玻片达到适当的蓝色程度时，对玻片进行复染。使用使细胞核呈红色或绿色的复染剂可与福尔马林沉淀物产生的蓝色形成良好对比。然后，用 aqueous 或 non-aqueous 封片介质封片。根据盖玻片的大小，一至三滴封片介质即足够。随后在光学显微镜下观察载玻片。以10X、20X和40X放大倍数拍摄实验组和对照组样本以及所有阴性对照的图像。随着与染色液孵育时间的延长，染色强度会逐渐增强。如图所示，在毛囊基底部的毛囊干细胞中观察到高水平的乳酸脱氢酶活性。未添加乳酸底物的对照样品未显示染色。这些发现通过皮肤毛囊干细胞的荧光激活细胞分选得以证实，并通过分选后细胞的检测确认了干细胞区室中存在较高的乳酸脱氢酶活性。基于毛囊干细胞具有较高乳酸脱氢酶活性的研究结果，研究人员对培养的胚胎干细胞进行了检测。同时分析了作为饲养层的小鼠胚胎成纤维细胞，分别在与胚胎干细胞共培养或单独培养条件下的情况。与小鼠胚胎成纤维细胞相比，在不同时间点观察到胚胎干细胞中乳酸脱氢酶活性较高。该染色方案也应用于新鲜分离的组织。小鼠主动脉被分离出来。样品用含有0.5% Triton X的Hank's平衡盐溶液孵育10分钟，随后

mapping-metabolism-monitoring-lactate-dehydrogenase-activity-directly

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

映射代谢: 直接在组织中监测乳酸脱氢酶活性

本视频介绍了一种利用乳酸脱氢酶酶对细胞裂解液中乳酸进行比色测定的方法。该酶可将乳酸转化为丙酮酸，同时将NAD转化为NADH，后者与四氮唑染料反应生成有色产物，可通过分光光度法测定以定量乳酸含量。...

测试样品中乳酸含量的比色测定法

本视频演示了乳酸脱氢酶（LDH）检测法，用于测定待测物质对人肺组织精准切片的细胞毒性作用及其对细胞膜完整性的影​​响。该检测可对样本中的细胞死亡或损伤程度提供定量评估。...

通过乳酸脱氢酶检测法评估肺组织切片中的细胞毒性和膜完整性

动态核极化结合后续样品溶解技术已实现对生物系统中代谢过程的实时研究。超极化[1-13C]丙酮酸用于研究前列腺癌细胞系中的乳酸脱氢酶活性 体外.

超极化13C代谢磁共振波谱与成像

本文介绍了一种可用于在显微镜下可视化并定量分析细胞和组织中脱氢酶活性及其动力学、功能和亚细胞定位的实验方案。...

代谢定位：通过定量酶细胞化学与组织化学方法测定细胞和组织中脱氢酶活性

本文介绍了一种在哺乳动物细胞中测量整体自噬捕获活性的简单且经过充分验证的实验方案。该方法基于定量分析可沉淀细胞组分中乳酸脱氢酶（LDH）所占的比例，并将其与细胞总LDH水平进行比较。...

乳酸脱氢酶封存检测——一种测定哺乳动物细胞大分子自噬封存活性的简单可靠方法

本文介绍了测量线粒体耗氧量（营养能量学的核心概念）以及质子漏（线粒体生成ATP效率低下的主要原因）的方法。这些结果可解释营养利用过程中30%的能量损失，有助于评估线粒体功能。...

测量荷斯坦奶牛肝脏线粒体耗氧量和质子泄漏动力学以估算线粒体呼吸

本文介绍了一系列检测方法，用于独立于哺乳动物细胞消耗分子氧能力之外直接测量其线粒体功能。...

不依赖氧气的哺乳动物线粒体功能检测方法

本文介绍了一种利用基因编码的基于 Förster 共振能量转移的传感器，在果蝇幼虫脑离体标本中可视化单羧酸盐、葡萄糖和 ATP...

可视化单羧酸盐及其他相关代谢物在 离体果蝇实验 利用基因编码传感器研究幼虫大脑

本文详细描述了从骨髓、脾脏和梗死心脏中提取巨噬细胞的方法，并进一步评估活细胞中代谢通量的实验流程。...

分析 离体 脾脏和心脏巨噬细胞及骨髓单核细胞中的代谢流

本方案将定制的生物反应器系统与超极化¹³C核磁共振波谱技术相结合，用于实时测量活细胞中的丙酮酸代谢，从而提高代谢研究和药物筛选应用中的可重复性和动力学准确性。...

使用超极化13C核磁共振对活细胞进行实时代谢检测

了解如何在组织样本中直接检测乳酸脱氢酶活性，以绘制酶活性的空间分布图。该方法使用冷冻切片和NAD(P)H显色反应，帮助研究人员精确定位毛囊干细胞等区域的代谢活动。

绘制代谢图谱：在组织中直接监测乳酸脱氢酶活性

探索更多视频