突触处的FM染料循环：高钾去极化、电刺激与光敏通道蛋白刺激的比较
2018年5月24日
突触小泡（SV）循环是神经元突触处细胞间通讯的核心机制。FM染料的摄取与释放是定量检测SV内吞和外吐的主要方法。本文中，我们比较了在果蝇（Drosophila）神经肌肉接头（NMJ）模型突触上驱动FM1-43循环的所有刺激方法。
本实验的总体目标是利用荧光FM染料，在果蝇幼虫神经肌肉接头的活体标本上观察突触小泡的胞吞和胞吐循环过程。该方法有助于回答神经科学领域的一些关键问题，例如哪些基因对突触小泡循环功能至关重要？该技术的主要优势在于，可通过三种不同类型的刺激——高钾去极化、电刺激或光遗传学手段，在活体标本中光学追踪小泡循环过程。
开始此操作时，将与lexoflor 647偶联的抗HRP抗体加入解剖用盐水中。接着，将涂有弹性体的盖玻片放入解剖室，然后加入含有HRP抗体的解剖液，用于在解剖过程中标记神经肌肉接头的突触前终末。使用细毛刷将一只爬行的三龄幼虫从培养瓶中的食物上转移至涂有弹性体的盖玻片上。
然后用嘴产生负压，吸取少量胶水填充玻璃微量移液器尖端。接着用镊子将幼虫背侧朝上放置，通过嘴施加正压，将一滴胶水从移液器中推出，将幼虫头部粘附在涂有弹性体的盖玻片上。对幼虫后端重复此操作，确保幼虫身体在两处胶水固定点之间被拉直绷紧。
使用剪刀在后部做一毫米的水平切口，并沿背侧中线做垂直切口。然后轻轻移除覆盖在肌肉上的背侧气管、肠道、脂肪体及其他内脏器官。对四个体壁瓣重复粘贴操作，确保在水平和垂直方向上轻轻拉伸身体。
随后，提起腹神经索，用剪刀小心地切断运动神经，并完全移除腹神经索。用无钙盐溶液替换灌流用的生理盐水，以终止突触小泡循环。进行电刺激时，使用微电极拉制仪制备吸液移液管，以获得所需的锥度和尖端尺寸。
随后，使用微电极拉制仪对微电极尖端进行火焰抛光，以便在吸附单根运动神经时形成紧密贴合。将吸管电极滑入安装在显微操作器上的电极夹持器中，该夹持器连接一根长而柔韧的塑料管和一个注射器。接下来，将含有FM染料的标本置于显微镜载物台上，并升高载物台，直至幼虫和吸管电极均处于焦点位置。
然后使用注射器产生的负压，通过吸电极吸取一段已切断的运动神经，该神经支配所选的半节段。随后，使用选定的参数刺激运动神经，以驱动突触小泡内吞及FM 143染料的摄取。此时实验中最关键的步骤是将单根运动轴突紧密地吸入吸电极内。
这可能需要多次尝试和调整。一旦找到合适的吸吮电极，应在所有待比较的条件下使用同一个电极，以确保刺激强度的一致性。对于FM染料卸载实验，将同一运动神经吸入同一电极中，然后刺激该运动神经以激活突触小泡的胞吐作用并释放FM 143染料。
对于通道视紫红质刺激，使用同轴电缆将蓝色LED连接至可编程刺激器，并将LED放入相机接口中。利用显微镜的变焦功能，将蓝色LED光束聚焦到含有FM染料的标本上。此步骤中最关键的操作是确保LED设置保持恒定，并且在所有待比较条件下，均照射每个动物的相同部位，以保证刺激强度的一致性。
启动光刺激，并使用计时器追踪预设的光遗传学刺激持续时间。当计时器结束时，迅速移除FM染料溶液，并替换为无钙任氏液以终止突触囊泡循环。在FM染料卸载过程中，启动光刺激，并使用计时器追踪预设的光遗传学刺激持续时间。
当计时周期结束后，迅速移除 FM 染料溶液，并将样本置于无钙盐水中以终止突触小泡（SV）循环。为定量分析荧光图像，在 ImageJ 中打开图像，依次点击“图像”、“堆栈”、“Z 投影”，生成最大强度投影；然后使用抗 HRP 647 通道，进入“图像”、“调整”、“阈值”，拖动顶部工具栏直至仅神经肌肉接头（NMJ）被高亮显示。使用魔棒工具，点击神经肌肉接头（NMJ）区域。
如果神经肌肉接头（NMJ）不连续，请按住 Shift 键并选中所有部分。然后将图像切换至 FM 143 染料通道，进入“分析”菜单，选择“测量”，以获取荧光强度值。对同一神经肌肉接头的未加载图像重复上述步骤。
荧光染料FM 143可通过光转化生成氧化型DAB电子致密沉淀，从而通过透射电子显微镜（TEM）进行观察。以下是光转化方法的示意图，用于在依赖活动的FM 143染料加载后标记果蝇神经肌肉接头（NMJ）。这是一张代表性的野生型突触小体在静息状态下的透射电镜图像，显示了大量大小均一的突触囊泡（SVs）。
这些图像显示了用高钾盐溶液去极化刺激五分钟的突触末梢，未进行光转化或进行了FM 143光转化的情况。此处可观察到大量内吞同源结构。这些图像还显示了使用神经负压电极以20赫兹电刺激五分钟的突触末梢，未进行光转化或进行了FM 143光转化的情况。
请注意，载有染料的囊泡比邻近未载染料的囊泡明显更暗。观看本视频后，您应能够充分掌握幼虫胶腺解剖操作，以及如何利用高钾去极化、电刺激和光遗传学通道视紫红质刺激进行FM染料的加载与卸载。自从Fei-Mao首次合成FM染料以来，这些多功能染料已被广泛用于研究不同囊泡池的活动依赖性动员，以区分网格蛋白介导的内吞作用，并研究诱发性、自发性和微小突触活动。
在整个实验过程中需要考虑许多因素。例如，外部钙离子浓度、所使用的刺激方法类型，以及在染料摄取和释放步骤中加载和卸载 FM 染料的时间长短。在设计您自己的实验时，请仔细考虑这些因素。
祝你好运！
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概述
本研究利用荧光FM染料探究果蝇幼虫神经肌肉接头处突触小泡（SV）的循环过程。通过高钾去极化、电刺激和光遗传学等多种刺激方法，对突触小泡的内吞和外吐作用进行定量评估。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 突触传递
- 荧光成像
背景
- 突触小泡循环对于神经元突触处的细胞间通讯至关重要。
- FM染料摄取与释放是检测突触小泡循环的主要方法。
- 本研究利用果蝇神经肌肉接头（NMJ）作为模型系统。
- 理解突触机制有助于解答神经科学中的基本问题。
研究目的
- 比较不同的刺激技术以驱动FM1-43循环。
- 鉴定参与突触小泡循环的关键基因。
- 在活体样本中通过光学方法追踪囊泡循环过程。
使用的方法
- 果蝇幼虫神经肌肉接头的活体制备。
- 使用荧光FM染料追踪评估突触囊泡循环。
- 三种刺激方法的比较：电刺激、光遗传学刺激和钾离子去极化。
- 关键步骤包括用于制备的解剖操作，以及应用无钙任氏液以终止突触囊泡循环。
- 使用ImageJ进行图像分析，以定量荧光测量结果。
主要结果
- 该研究证实了每种刺激方法在分析突触囊泡循环中的有效性。
- 荧光强度的差异凸显了活动依赖性的囊泡行为。
- FM染料可通过光转化实现透射电镜下的增强可视化。
- 研究结果为突触传递背后的机制过程提供了深入见解。
结论
- 本研究有助于深入理解神经肌肉接头处突触小泡循环的机制。
- 研究结果为探索基因对突触行为影响的进一步研究奠定了基础。
- 该研究的意义延伸至神经元可塑性及突触传递的潜在机制。
常见问题
行业重要性概要
理解突触小泡循环机制对于神经退行性疾病研究中的靶点验证至关重要，因为在这些疾病中，突触前功能障碍参与了病理生理过程。能够对刺激方法进行定量比较，有助于通过分离突触前释放动力学来降低治疗假设的机制风险。该方法通过将遗传扰动与疾病相关系统中功能性小泡池行为关联起来，从而在早期发现阶段提供可预测的信心。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过在突触功能障碍的遗传模型中定量分析活动依赖性囊泡循环，验证治疗假设。
- 操作价值：通过直接测量突触前内吞和外排速率，实现功能靶点的有效验证。
- 预测价值：通过区分能够修复囊泡循环缺陷的化合物与仅影响神经元整体健康的化合物，支持项目组合的筛选决策。
筛选与检测方法开发
- 检测准备：采用标准化的FM染料摄取/释放方案，制备经过验证的生物系统，用于后续化合物筛选。
- 定量输出：获取荧光强度测量数据，支持剂量-反应分析及阳性结果确认。
- 平台复用：建立可重复使用的成像工作流程，兼容共聚焦显微镜和电子显微镜，实现多模态验证。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：将果蝇神经肌肉接头（NMJ）作为机制模型，用于研究与人类神经退行性疾病相关的保守突触通路。
- 转化连续性：通过将染料循环缺陷与行为学或电生理表型相关联，实现从发现到临床前验证的转化衔接。
- 基于风险评估的推进：利用囊泡循环数据，结合靶点结合与功能挽救情况，为继续或终止研究提供决策依据。
流程与工作流整合
该方法通过提供功能读出结果，补充遗传学和生化检测，可整合到早期发现工作流程中，支持从靶点识别到先导化合物优化的推进。
- 发现生物学：通过将基因操作与突触囊泡动力学的可测量变化相联系，支持假设验证。
- 筛选：通过可重复的刺激方案（高K⁺、电刺激、光遗传学刺激），实现检测标准化，获得可量化的囊泡循环数据。
- 分析：提供基于荧光的读出信号以及适用于透射电镜的光转化技术，支持高通量、多模态的数据分析。
- 转化研究：通过在遗传模型中关联突触囊泡循环缺陷与运动输出或存活表型，连接机制与表型。
- 企业级复用：建立可扩展的成像平台，适用于多种突变品系和刺激条件下的纵向研究。
运营与企业影响
- 科学价值：通过提供囊泡池动员的直接光学读出，减少突触靶点验证中的机制模糊性。
- 操作价值：通过在不同实验室间标准化解剖、刺激和成像流程，确保实验可重复性。
- 战略价值：通过在神经保护化合物筛选中实现假阳性的早期检测，提高资本使用效率。
- 项目组合影响：基于在疾病相关模型中囊泡循环功能恢复的情况，支持对靶点进行风险调整后的优先排序。
实施注意事项
- 可靠的样品制备与成像需要具备果蝇遗传学、神经解剖学和荧光显微镜技术方面的专业知识。
- 依赖共聚焦显微镜、刺激设备（如吸吮电极、LED系统）以及图像分析软件（ImageJ）的可用性。
- 为确保不同实验条件和实验室之间的结果可比性，需在不同研究团队间对刺激参数（持续时间、强度）进行标准化。
- 在扩展至其他模式系统时，需考虑突触大小、可及性及遗传操作难易程度的差异，可能需要进行适应性调整。
- 存在染料泄漏、光毒性以及样品生理状态变异等实际限制因素，必须通过设置重复实验和对照组加以控制。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Larval Glue Dissection
2:36
Electrical Stimulation: FM Dye Loading and Unloading
4:08
Channelrhodopsin Stimulation: FM Dye Loading and Unloading
5:21
Fluorescence Quantification
6:12
Results: Synaptic Ultrastructure with FM Dye Photoconversion to Mark Vesicles
7:22
Conclusion
