Name: 猕猴免疫缺陷病毒感染 CD4+ T 细胞单细胞定量的 mRNA 和表面蛋白的表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: 了解单细胞定量mRNA和表面蛋白表达技术，用于分析猕猴免疫缺陷病毒感染的CD4+ T细胞。该方法可同时检测96个基因和18种表面蛋白，揭示病毒感染细胞的独特特征。

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作者谨此感谢美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）疫苗研究中心（VRC）流式细胞术核心实验室以及军事人类疫苗计划（MHRP）流式细胞术核心实验室在FACS仪器和分选设备的维护与运行方面提供的支持；感谢Maria Montero、Vishakha Sharma和Kaimei Song提供的专业技术协助；感谢Michael Piatak, Jr.（已故）在SIV qPCR检测设计方面的帮助；以及感谢Brandon Keele和Matthew Scarlotta提供SIV分离株序列。本文所表达的观点仅为作者立场，不应被解释为代表美国陆军或美国国防部的立场。本研究在经国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证的设施中，依照批准的动物使用方案开展，符合《动物福利法》及其他与动物相关并涉及动物实验的联邦法规，并遵循美国国家研究委员会（NRC）2011年版《实验动物护理与使用指南》中所述的原则。

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本研究工作由亨利·M·杰克逊军事医学进步基金会与美国国防部（DOD）之间的合作协议（W81XWH-07-2-0067）资助。文中观点仅为作者意见，不应被解释为代表美国陆军或国防部的立场。研究在经AAALACi认证的机构内依照批准的动物使用方案开展，遵循《动物福利法》及其他与动物实验相关的联邦法规和条例，并遵守《实验动物护理与使用指南》（美国国家研究委员会出版物，2011年版）中所述原则。

本文所述方案称为tSCEPTRE，通过多参数流式细胞术对单细胞表面蛋白进行定量，并结合高度多重的逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测单细胞mRNA表达水平，将这两种技术相结合，能够在高通量条件下获得单细胞转录组与蛋白质组的高维度联合图谱。我们利用该方法鉴定此前难以捕获的SIV感染细胞。 体内，并描述差异表达的宿主基因和蛋白质。该方案可针对任何可通过表面蛋白、mRNA 或二者组合来区分的特定细胞群体进行适应性调整。所述方法依赖于精确的单细胞分选及流式细胞术数据记录，结合商业化的 qPCR 试剂和多重实时 PCR 仪器。所得结果为对单细胞水平下蛋白与基因表达数据的高灵敏度、定量评估。
其他已报道的方法可实现单细胞水平上蛋白与基因表达的关联分析1,25,26,27索引式FACS分选联合RNA测序已成功应用于造...

许多胞内病原体依赖宿主细胞的机制进行复制，通常会改变宿主细胞的生物学特性，或靶向特定的宿主细胞亚群，以最大化其传播机会。因此，细胞生物学过程常常受到干扰，对宿主整体健康造成有害影响。深入了解病毒与其复制所依赖的宿主细胞之间的相互作用，有助于阐明疾病机制，从而推动更优疗法和感染预防策略的开发。实现这一目标的关键在于拥有能够直接分析宿主-病原体相互作用的分析工具。单细胞分析是唯一能够明确将特定细胞表型归因于特定基因型或感染状态的方法1。例如，病原体感染通常会引发宿主细胞的直接和间接变化。因此，必须将被感染细胞与其未感染的对应细胞区分开来，才能判断宿主细胞的变化是由直接感染引起，还是由继发效应（如广泛性炎症）所致。此外，对于许多病原体（如SIV和人类免疫缺陷病毒HIV），宿主细胞感染会经历多个阶段，例如早期、晚期或潜伏期，每个阶段可能具有不同的基因和蛋白表达谱2,3,4,5。对细胞混合物进行整体分析将无法捕捉这种异质性6。相比之下，高通量的单细胞多因子分析能够同时量化病毒和宿主基因的表达，为解析感染特异性的细胞扰动（包括不同感染阶段之间的差异）提供了有效手段。此外，在生理相关条件下分析宿主-病原体相互作用，对于识别感染个体中实际发生的生物学事件至关重要。因此，可直接用于ex vivo样本的方法最有可能真实反映in vivo的生物学过程。
SIV 和 HIV 靶向 CD4+ T细胞中，它们可拮抗宿主的抗病毒反应 &#34;限制&#34; 因子并下调抗原呈递分子，以建立有效感染并逃避免疫监视7,8,9,10,11若不进行治疗，该感染将导致大量CD4细胞丢失+ T细胞，最终导致获得性免疫缺陷综合征（AIDS）12在抗逆转录病毒治疗的情况下，潜伏感染的细胞储存库可持续数十年，构成治愈策略的重大障碍。了解这些细胞的特性对于 在体内 HIV/SIV感染的细胞有可能揭示在致病和持续感染中起关键作用的宿主细胞特征。然而，这一研究面临巨大挑战，主要由于感染细胞频率极低，且缺乏能够有效识别这些细胞的试剂。转录病毒RNA的细胞估计仅占CD4+ 血液和淋巴组织中的T细胞13,14,15在抑制性治疗下，潜伏感染的细胞频率甚至更低，仅为10-3–10-7 16,17,18病毒蛋白染色检测方法在研究中表现良好 体外 感染（例如细胞内Gag）的检测效果欠佳，原因是背景染色率为0.01–0.1%，与感染细胞的频率相当或更高13,14. 使用经过充分验证的SIV/HIV Env特异性单克隆抗体对Env蛋白进行表面染色也已被证明存在困难，原因可能类似。近期，一些新型工具致力于通过引入针对gag RNA的特异性检测方法或采用替代性成像技术，以提高表达Gag的细胞的检出能力14,15,19然而，此类方法在对每个细胞进行的定量测量数量上仍然存在局限性。
本文所述方法具有以下两点：（1）通过高灵敏度和特异性的病毒基因定量qPCR，直接在体外（ex vivo）识别单个病毒感染细胞；（2）对每个感染（及未感染）细胞定量多达18种表面蛋白和96个基因的表达。该方法结合了流式细胞术（FACS）对单个细胞表面蛋白的检测，随后立即裂解细胞，并利用Biomark系统进行多重靶向qPCR以分析基因表达。集成流体回路（IFC）技术可同时对96个样本中的96个基因进行多重定量，通过包含9,216个独立qPCR反应腔室的矩阵实现。活细胞的FACS分选过程记录了高通量的蛋白丰度数据，同时完整保留转录组，供后续立即开展分析。为识别病毒感染细胞，qPCR分析中包含了针对剪接和未剪接病毒RNA（vRNA）的特异性检测，并结合一组用户自定义的检测，总计最多可达96个基因，达到当前IFC所能容纳的最大检测数量。每个细胞所获得的基因表达与蛋白信息通过孔位实现关联。我们此前已在其他文献中报道过该分析的结果20。本文则提供了更为详细的方法学指南，以及对SIV感染的CD4+ T细胞进一步的表型描述。
该方法被称为tSCEPTRE，可应用于任何对荧光标记抗体具有反应性且转录组与现有qPCR检测兼容的活细胞群体悬液。例如，该方法可用于表征稀有细胞或难以通过表面蛋白标志物区分的细胞中基因和蛋白表达的差异。样品制备依赖于使用商业化抗体的标准染色方案。具备单细胞分选能力的流式细胞仪也可商业化获取，但处理具有感染性的活细胞时需要额外的生物安全防护措施。通过孔位记录每个细胞的单细胞蛋白表达谱，即本文所述的索引式分选（indexed sorting），是现有商业化FACS分选软件的常见功能。本文未描述对目标细胞群体间差异表达宿主基因的计算分析方法，但提供了参考文献以查阅先前已发表的相关方法。

<table><tbody><tr><td> &lt;p&gt;&lt;strong&gt;RNA提取及PCR试剂与耗材&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Genemate 96孔半裙边PCR板&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BioExpress/VWR&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;T-3060-1&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;粘性PCR板封膜&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;ThermoFisher&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;AB0558&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Armadillo 384孔PCR板&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;ThermoFisher&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;AB2384&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;MicroAmp 光学粘性膜&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Applied Biosystems/ThermoFisher&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;4311971&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;DEPC 水&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;优质生物&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;351-068-101&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;玻璃蒸馏水&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Teknova&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;W3345&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Invitrogen/ThermoFisher&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;11732088&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;SUPERase-In Rnase抑制剂&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Invitrogen/ThermoFisher&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;AM2696&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Platinum Taq&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Invitrogen/ThermoFisher&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;10966034&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;dNTP混合液&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Invitrogen/ThermoFisher&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;18427088&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;ROX 参比染料（若与试剂盒分开提供）&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Invitrogen/ThermoFisher&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;12223012&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;DNA悬浮缓冲液&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Teknova&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;T0223&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;RNAqueous 试剂盒&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Invitrogen/ThermoFisher&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;AM1931&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;&lt;strong&gt;未列入表2的TaqMan基因表达检测&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;CD6&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;应用生物系统公司/赛默飞世尔科技&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Hs00198752_m1&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;TLR3&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;应用生物系统公司/赛默飞世尔科技&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Hs1551078_m1&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;&lt;strong&gt;Biomark 试剂&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;对照管线流体试剂盒&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Fluidigm&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;89000021&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;TaqMan Universal PCR Mix&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Applied Biosystems/ThermoFisher&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;4304437&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;检测加载试剂&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Fluidigm&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;85000736&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;样品上样试剂&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Fluidigm&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;85000735&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;动态阵列 96.96（芯片）&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Fluidigm&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BMK-M-96.96&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;&lt;strong&gt;FACS 试剂&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;SPHERO COMPtrol 羊抗小鼠（lambda）&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Spherotech公司&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;CMIgP-30-5H&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;CompBeads Anti-Mouse Ig,k&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BD Biosciences&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;51-90-9001229&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;带滤网盖的5 ml聚苯乙烯管&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;FALCON&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;352235&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Aqua Live/Dead 染色&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Invitrogen/ThermoFisher&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;L34976&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;稀释1:800&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;小鼠抗人CD3 BV650 克隆SP34-2&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BD Biosciences&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;563916&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;稀释1:40&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;小鼠抗人 CD4 BV786 克隆 L200&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BD Biosciences&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;563914&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;稀释1:20&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;小鼠抗人 CD8 BUV496 单克隆抗体 RPA-T8&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BD Biosciences&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;564804&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;稀释1:10&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;小鼠抗人 CD28 BV711 克隆 CD28.2&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Biolegend&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;302948&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;稀释1:20&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;小鼠抗人 CD95 BUV737 克隆 DX2&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BD Biosciences&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;564710&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;稀释1:10&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;小鼠抗人 CD14 BV510 单克隆抗体 M5E2&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Biolegend&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;301842&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;稀释1:83&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;小鼠抗人 CD16 BV510 克隆 3G8&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Biolegend&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;302048&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;稀释1:167&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;小鼠抗人 CD20 BV510 单克隆抗体 2H7&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Biolegend&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;302340&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;稀释1:37&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;抗CD38-R PE 克隆 OKT10&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;非人灵长类试剂资源&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;N/A&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;稀释1:100&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;小鼠抗人 CD69 BUV395 克隆 FN50&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BD Biosciences&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;564364&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;稀释1:10&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;小鼠抗人 HLA-DR APC-H7 克隆 G46-6&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BD Biosciences&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;561358&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;稀释1:20&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;小鼠抗人 ICOS Alexa Fluor 700 单克隆抗体 C398.4A&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Biolegend&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;313528&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;稀释1:80&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;BioPrptect 密封 containment enclosure&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Baker&lt;/p&gt; </td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;BD FACS Aria&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BD Biosciences&lt;/p&gt; </td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;ProtoFlex Dual 96孔PCR系统&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;应用生物系统公司/赛默飞世尔科技&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;4484076&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Quant Studio 6 qPCR 仪器&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Applied Biosystems/ThermoFisher&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;4485694&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;IFC 控制器 HX&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Fluidigm&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;IFC-HX&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Biomark HD&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Fluidigm&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BMKHD-BMKHD&lt;/p&gt; </td><td></td></tr></tbody></table>

从恒河猴中分离的猴免疫缺陷病毒感染的 cd4+ t 细胞中 mrna 和表面蛋白表达的单细胞定量分析

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

单细胞分析是解析细胞异质性群体的重要工具。稀有细胞的鉴定与分离往往具有挑战性。为应对这一难题，研究人员开发了一种结合索引式流式细胞术与高通量多重定量聚合酶链式反应（qPCR）的方法。该方法旨在鉴定并表征存在于恒河猴体内的猴免疫缺陷病毒（SIV）感染细胞。通过荧光激活细胞分选（FACS）定量表面蛋白，并通过qPCR定量mRNA，利用病毒基因表达识别病毒感染细胞，再结合宿主基因与蛋白的检测，构建多维度的细胞图谱。我们将该方法命名为靶向单细胞蛋白-转录联合评估技术（targeted Single-Cell Proteo-transcriptional Evaluation，tSCEPTRE）。实施该方法时，首先使用针对表面标志物的荧光标记抗体对活细胞进行染色，这些标志物用于FACS分离特定细胞亚群和/或后续的表型分析。随后对单个细胞进行分选，并立即裂解，进行多重逆转录（RT）、PCR预扩增，以及最多96个转录本的高通量qPCR检测。FACS检测数据在分选时记录，并通过孔位信息与基因表达数据关联，从而生成整合的蛋白与转录图谱。为直接在体外研究SIV感染细胞，通过qPCR检测多种病毒RNA分子以识别感染细胞。多种病毒转录本的组合及其表达量为将感染细胞划分为病毒生命周期不同阶段（如 productive 与 non-productive 阶段）提供了依据。此外，将SIV+细胞的tSCEPTRE分析结果与来自同一样本的未感染细胞进行比较，以评估宿主基因与蛋白的差异表达。该分析揭示了既往未被充分认识的感染细胞间病毒RNA表达的异质性，以及在单细胞分辨率下体内SIV介导的转录后基因调控机制。tSCEPTRE方法适用于任何可通过表面蛋白标志物、宿主或病原体基因表达，或其组合进行鉴定的细胞群体分析。 离体通过qPCR检测多种病毒RNA种类来鉴定细胞。病毒转录本的种类及其表达量共同为将细胞分类至病毒生命周期的不同阶段提供了依据（例如， productive versus non-productive）。此外，对SIV+ 细胞与来自同一样本的未感染细胞进行比较，以评估宿主基因和蛋白的差异表达。分析揭示了感染细胞间先前未被充分认识的病毒RNA表达异质性，以及单细胞分辨率下的体内SIV介导的转录后基因调控。 体内 单细胞分辨率下的SIV介导的转录后基因调控。tSCEPTRE方法适用于任何可通过表面蛋白标志物、宿主或病原体基因，或其组合的表达来鉴定的细胞群体的分析。

整个实验方案的工作流程如图1所示。根据分选细胞的数量，该流程分为两种形式：有限稀释法或单细胞分选，具体如文中所述。图2展示了对2倍系列稀释RNA进行引物-探针验证分析的示例。图3展示了用于识别潜在SIV+细胞的设门策略。图4展示了在有限稀释分选的细胞中，针对看家基因GAPDH 进行的质量控制qPCR结果，包括成功、次优和失败的示例。图5展示了四种SIV RNA亚型以及在感染细胞中差异表达的恒河猴基因的单细胞定量表达水平。图6通过流式细胞术检测，展示了SIV RNA+ CD4+ T细胞表面蛋白表达谱的代表性双变量图、直方图和散点图。<st...

本文描述了一种在单细胞水平上对外周血单个细胞（ex vivo）同时定量96个基因和18种表面蛋白表达水平的方法，可用于鉴定病毒感染细胞与未感染细胞之间差异表达的基因和蛋白。我们应用该方法研究从中国台湾恒河猴中分离的SIV感染的CD4+ T细胞。

从恒河猴中分离的猴免疫缺陷病毒感染的 CD4+ T 细胞中 mRNA 和表面蛋白表达的单细胞定量分析

单细胞分析是解析细胞异质性群体的重要工具。稀有细胞的鉴定与分离具有较大挑战性。为应对这一难题，研究人员开发了一种结合索引式流式细胞术与高通量多重定量聚合酶链式反应（qPCR）的方法。该方法旨在鉴定并表征存在于恒河猴体内的猴免疫缺陷病毒（SIV）感染细胞。通过荧光激活细胞分选（FACS）定量表面蛋白，以及通过qPCR定量mRNA，可依据病毒基因表达识别病毒感染细胞，并结合宿主基因与蛋白检测，构建多维度特征谱。我们将该方法命名为靶向单细胞蛋白-转录组联合分析（targeted Single-Cell Proteo-transcriptional Evaluation, tSCEPTRE）。实施该方法时，首先使用针对表面标志物的荧光标记抗体对活细胞进行染色，用于FACS分离特定细胞亚群和/或后续表型分析。随后对单个细胞进行分选，立即裂解，进行多重逆转录（RT）、PCR预扩增，以及最多96个转录本的高通量qPCR检测。FACS检测数据在分选时记录，并通过孔位信息与基因表达数据关联，从而生成整合的蛋白与转录谱。为直接在体外研究SIV感染细胞，通过qPCR检测多种病毒RNA分子以鉴定感染细胞。多种病毒转录本的组合及其表达量为将感染细胞划分为病毒生命周期的不同阶段（如 productive 与 non-productive 阶段）提供了依据。此外，将SIV+细胞的tSCEPTRE分析结果与来自同一样本的未感染细胞进行比较，以评估宿主基因与蛋白的差异表达。分析揭示了感染细胞间此前未被充分认识的病毒RNA表达异质性，以及在单细胞分辨率下体内SIV介导的转录后基因调控机制。tSCEPTRE方法适用于任何可通过表面蛋白标志物、宿主或病原体基因表达，或其组合进行鉴定的细胞群体的分析。

该方法有助于回答宿主-病原体相互作用领域中的关键科学问题，例如：被高效感染的细胞具有哪些独特特征？哪些宿主辅助因子能够促使病毒建立高效感染？以及如何在治疗干预中靶向这些细胞？本技术的主要优势在于，它能够在单细胞水平上同时提供蛋白质和 mRNA 的定量测量，且大多数试剂均可从商业渠道获得。细胞分选操作的演示将由迈克尔·埃勒博士实验室流式细胞术核心 facility 的高级技术员 Matthew Creegan 完成。首先，在指定的预扩增分子生物学工作区中，将96种基因表达检测引物加入无RNase和DNase的离心管中，配制检测反应液，确保每种引物的终浓度为180纳摩尔的正向和反向引物。加入DNA悬浮缓冲液，将检测反应液稀释至适当浓度。针对每个预期使用的96乘96芯片阵列，将每种检测反应液各6微升移取至96孔PCR板的指定孔中，然后用封口膜密封该PCR板。开始对活细胞进行表面染色时，在组织培养生物安全柜中，首先按照文本方案制备补偿样品以及荧光抗体混合液的总工作液。将冻存的细胞在37摄氏度水浴中解冻两分钟。随后，将5至2毫升细胞悬液加入含有12毫升PBS的15毫升离心管中。在25摄氏度下以500 G离心三分钟，然后吸除PBS，并将沉淀重悬于3毫升新鲜PBS中。将此混合液转移至一个5毫升聚苯乙烯管中。再次在25摄氏度下以500 G离心三分钟。吸出上清液，留下约10微升残留的PBS。接下来，将最多2000万个洗涤后的细胞重悬于80微升抗体混合液中。在25摄氏度避光孵育20分钟。此后，加入三毫升 PBS。在 500 ×g 下离心三分钟，并吸除上清液。将细胞充分重悬于 300 至 500 微升 PBS 中。使用移液器将该溶液通过35微米尼龙细胞筛帽过滤。随后将细胞置于冰上，并避光保存直至分选。返回PCR前工作站后，首先根据文本方案中的说明，在一个无RNase、无DNase的无菌管中配制RT预扩增反应混合液。使用多通道移液器，将 10 微升该反应混合液加入所需数量的 96 孔 PCR 分选收集板中。用粘性封膜密封反应板，然后将反应板置于预冷的 96 孔铝块上。随后，根据文本方案中所述建立细胞分选门控策略，并准备流式细胞分选仪。输入适当的仪器设置，以指定分选到每个孔中的细胞数量和细胞亚群。移除粘性封膜，然后将细胞通过流式细胞分选（FACS）分选至预先准备好的96孔PCR收集板中。使用新的粘性封膜重新密封板孔。立即涡旋振荡重新封膜的反应板，然后在4 °C条件下以2000 ×g离心1分钟。将反应板放入预热至50 °C的PCR仪中，50 °C孵育15分钟，随后95 °C孵育2分钟。最后，进行18个循环的扩增：95 °C变性15秒，60 °C退火4分钟。扩增结束后，在PCR后处理工作站中，将5 µL cDNA转移至新的96孔PCR板中，加入20 µL DNA悬浮缓冲液。首先，通过向每个孔中加入四微升的引物-探针混合液来准备qPCR检测板。接下来，将2X引物-探针混合板中的每种检测引物-探针溶液各取四微升转移至qPCR板中。将qPCR检测板保持在4摄氏度。将引物注射器中的控制液注入芯片的两个进样阀中。取下板下方的保护塑料膜。将芯片放置在IFC控制器上，使缺口一侧位于A1位置，然后选择并运行引物程序。对于每个微流控芯片，将 50 微升样品加载试剂与 500 微升 PCR 预混液混合，以制备实时反应混合液。将 4.4 微升该反应混合液移液至新指定为样品板的 96 孔 PCR 板的每个孔中。接着，将 3.6 微升先前稀释的 cDNA 移液至样品板的每个孔中。此后，从检测板中转移五微升至芯片缺口侧的对应孔中。从样本板中转移五微升至芯片另一侧的对应孔中。将加载好的芯片插入IFC控制器，并运行load mix程序。接下来，将芯片转移至 BioMark 平台，并按照文本方案中所述设置仪器，然后将芯片运行文件保存至指定文件夹。芯片运行完成后，打开实时 PCR 分析软件，选择“文件”菜单中的“打开”，以打开 chiprun.bml 文件。在软件窗口的左上角，找到芯片浏览器和芯片运行摘要。在芯片运行摘要下，点击检测器设置。在任务下，点击新建并选择容器类型 SBS 板和容器格式 SBS 96。单击映射旁边带有省略号的按钮，然后选择 M96-Assay-SBS96.dsp。单击分析视图。在任务下的 qPCR 选项卡中，为线性导数选择基线校正，为用户检测器选择 CT 阈值法。在 CT 阈值选项卡中，勾选“自动初始化”复选框，然后点击“分析”按钮。在分析视图的右上象限中，点击第二个标签页“结果表格”。从下拉菜单中选择“热图视图”，带有数据的热图将随之显示。在热图下方，点击阈值和对数图。通过点击热图上代表各检测项目的列，并根据需要拖动阈值，手动调整每个检测器的循环阈值（CT），使其与扩增曲线的指数相交。完成后，点击“分析”。接下来，将 qPCR 数据导出为 csv 文件。将 qPCR 数据从 BioMark 计算机传输至您的桌面。将数据导入电子表格或统计分析软件，并根据芯片上的样本和检测位点位置对结果进行映射。创建一个新列，并使用条件公式根据病毒基因的表达情况将细胞分组。在“分析”下选择“以 Y 拟合 X”，并绘制基因表达相对于组别的图表。然后，使用 FlowJo 9 版本打开对应于 96 孔板的 FACS 分选生成的 FCS 文件。在高亮显示文件名后，选择平台、事件数门控，并创建索引分选门控。单个细胞将按行显示。选中全部96个细胞，然后选择工作区、导出，选择所有已补偿的基线值。在数据下选择 FCS 文件，点击导出，并选择一个指定文件夹。将各个细胞的新 FCS 文件拖入一个新的 FlowJo 工作区。选中所有细胞，然后点击由西格玛按钮表示的“添加统计”，选择均值以及所有荧光参数。打开表格编辑器，然后选中第一个单元格的所有楼层，并将其拖动到表格编辑器窗口中。在此窗口中，单击“创建并查看表格”。随后，通过复制粘贴或单击“保存并启动应用程序”按钮，将结果复制并输出至统计分析软件中。通过孔板编号和孔位，在 JMP 软件中将单细胞 FACS 数据与 qPCR 数据进行整合。最后，对整合后的数据进行图形化和统计学分析。在本研究中，采用多参数流式细胞术对单细胞表面蛋白进行定量，并结合高度多重的逆转录定量 PCR（RTqPCR）对单细胞 mRNA 表达进行定量分析。图中显示的是经FACS分选的恒河猴CD4阳性T细胞的单细胞定量病毒基因表达。Tat/rev阳性N阴性细胞中tat/rev RNA的拷贝数少于深绿色所示的N阳性细胞，这与感染早期阶段一致，即在病毒RNA部分剪接并输出细胞核之前。在tat/rev阳性N阳性细胞中，未剪接Gag-RNA的高丰度与晚期 productive 感染阶段一致，此时大量基因组RNA被表达并包装进入出芽的病毒颗粒。该三变量图显示了单个细胞的病毒基因、宿主基因和宿主表面蛋白的表达情况，表明尽管 CD4 和 CD3 的转录本得以维持，但在呈绿色的 tat/rev 阳性细胞中，表面 CD4 和 CD3 蛋白的表达量降低。掌握该技术后，可在两到三天内完成实验。观看本视频后，您应能够充分理解如何开展靶向单细胞蛋白-转录联合分析，以研究病毒感染细胞中差异表达的基因和蛋白相关问题。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

猕猴免疫缺陷病毒感染 CD4+ T 细胞单细胞定量的 mRNA 和表面蛋白的表达

一种结合原位四聚体染色与原位杂交（ISTH）的技术，能够实现病毒特异性CD8+...

一种可同时原位可视化病毒特异性CD8+ T细胞与病毒感染细胞的技术 In situ

我们展示了多色流式细胞术在恒河猴中对CD4+和CD8+...

多色流式细胞术分析恒河猴的细胞免疫应答

本视频展示了一种利用肽-主要组织相容性复合物I类（pMHC-I）四聚体来表征特异性针对猴免疫缺陷病毒（SIV）的CD8+记忆T细胞的方法。pMHC-I四聚体是由四个MHC-I分子与SIV特异性肽段结合并偶联荧光染料所形成的复合物。这些四聚体可特异性地结合SIV特异性的CD8+...

一种用于分析SIV特异性CD8+记忆T细胞的肽-MHC-I四聚体染色技术

本文介绍了一种优化的实验方案，用于计数和表征恒河猴抗艾滋病病毒的CD8+ T细胞。该文章不仅对HIV免疫学领域具有重要价值，也适用于其他已知CD8+...

通过肽-MHC-I 四聚体染色法分析恒河猴中猴免疫缺陷病毒特异性 CD8+ T 细胞

此处，我们介绍一种结合了 原位 使用MHC四聚体染色结合免疫组织化学技术确定组织中抗原特异性T细胞的定位、表型及数量。该方案用于分析抗原特异性CD8 T细胞在组织中相对于其他细胞类型和结构的空间分布及表型特征。...

原位 MHC-四聚体染色及定量分析以确定组织中抗原特异性CD8 T细胞的位置、丰度和表型

我们描述了一种处理接受抗逆转录病毒治疗的慢性HIV感染者支气管肺泡灌洗液及其配对的外周血的方法，以评估肺部HIV储存库。这些方法可获得高纯度的CD4 T细胞和肺泡巨噬细胞，随后可用于通过超敏聚合酶链式反应进行免疫表型分析以及HIV...

支气管肺泡灌洗液及配对血液样本中肺泡巨噬细胞和CD4+ T细胞免疫表型分析与HIV储存库评估的处理方法

我们概述了一项为期9天的实验方案，用于转导并扩增恒河猴外周血单个核细胞，可获得数量充足、目的基因共表达效果优良的细胞，适用于细胞疗效输注研究。...

九天内实现原代T细胞的转导与扩增并维持中央记忆表型

本文介绍了一种荧光成像方法的实验方案，即多重免疫荧光细胞检测法检测DNA、RNA和蛋白质（MICDDRP），该方法能够同时在单细胞水平上以荧光方式可视化不同种类和链型的病毒蛋白及其核酸。该方法可广泛应用于多种研究体系。...

单细胞多重荧光成像技术用于可视化病毒核酸与蛋白质并监测HIV、HTLV、HBV、HCV、寨卡病毒和流感病毒感染

我们提出了一种利用CRISPR/Cas9和重组腺相关病毒6型对恒河猴原代B细胞进行培养和基因编辑的方法，用于B细胞治疗的研究。...

食蟹猴原代B细胞的基因编辑

我们介绍了一种利用逆转录病毒转导技术制备抗原特异性小鼠T细胞的实验方案...

小鼠T细胞中T细胞受体的逆转录病毒转导

了解单细胞定量mRNA和表面蛋白表达技术，用于分析猕猴免疫缺陷病毒感染的CD4+ T细胞。该方法可同时检测96个基因和18种表面蛋白，揭示病毒感染细胞的独特特征。

从恒河猴中分离的猴免疫缺陷病毒感染的 CD4⁺ T 细胞中 mRNA 和表面蛋白表达的单细胞定量分析

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