利用氢氘交换质谱法定义Hsp33的氧化还原调控型分子伴侣活性并绘制其构象变化

本文所展示的工作流程有助于加深我们对氧化应激条件下分子伴侣在细胞中作用的理解。具体而言，该流程有助于阐明在蛋白质去折叠条件下，分子伴侣如何防止蛋白质发生聚集。通过这两种不同技术的结合，可深入了解定域化分子伴侣的活性特征。

它还可用于研究其他蛋白质的相互作用，例如酶的相互作用以及蛋白质动态。该方法的可视化演示至关重要，因为它涉及多种仪器的使用，对于新用户而言可能具有挑战性。首先，将先前解冻的蛋白质样品离心，以去除聚集体。

然后加入 5 mM DTT 和 20 µM 氯化锌，将样品在 37 °C 下孵育至少 1.5 小时。为去除 DTT，使用 40 mM 磷酸钾缓冲液平衡脱盐柱：将缓冲液完全充满柱子，使其自然滴出。用镊子轻轻下压柱中白色圆盘滤膜，并将其取出。

用磷酸钾缓冲液重新填充层析柱，并在1000 × g条件下离心3分钟。离心后，将层析柱转移至一支洁净的离心管中，缓慢将蛋白质样品加至柱子中央。在1000 × g条件下离心2分钟，使不含DTT的蛋白质进入穿流液中。

现在检测蛋白质浓度，并在280纳米处测量其吸光度。将一半的蛋白质样品分装成若干 aliquot。在厌氧条件下孵育这些aliquot 20分钟，以彻底去除氧气。

然后用塑料膜密封管子，并将样品置于低温条件下保存。接着，向剩余的蛋白样品中加入新配制的5毫摩尔过氧化氢，在40摄氏度下振荡孵育3小时。离心后检测蛋白浓度，然后将氧化后的蛋白分装成若干份，并在低温条件下保存。

通过将12微摩尔柠檬酸合酶在40毫摩尔HEPES和4.5摩尔盐酸胍中孵育过夜，制备变性底物。次日，打开荧光分光光度计软件并进入时间进程测量界面。将激发狭缝宽度设为2.5纳米。

激发波长设为360纳米。发射波长设为360纳米。发射带宽设为5纳米。

将数据间隔设为 0.5 秒。将温度设置为 25 摄氏度。通过向石英比色皿中加入 1600 µL 的 40 mM HEPES 溶液来制备样品。

将比色皿插入荧光分光光度计的样品室中，使样品达到设定温度。设置搅拌速度为600 rpm，开始测量直至基线稳定。为检测无分子伴侣存在时柠檬酸合酶的聚集情况，于测量开始120秒后加入10微升变性的柠檬酸合酶。

然后继续测量1200秒。若需测量在Hsp33存在条件下的柠檬酸合酶聚集情况，可在测量开始60秒后加入Hsp33。再过60秒后，加入10 µL变性的柠檬酸合酶，并继续测量1200秒。

接下来，上传数据文件，使用 Kfits 进行数据分析和噪声去除。为去除噪声，请选择分析参数，使用自动最佳模型，并选择“噪声始终高于信号”。通过绿色和红色可调节线条手动去除明显的异常值，绿色线条上方和红色线条下方的噪声将被过滤掉。

随后，设定基线和拟合曲线。应用噪声阈值后，下载处理后的数据。通过在43摄氏度下将柠檬酸合酶以1:1.5的比例加入Hsp33，制备蛋白质底物复合物样品。

至少分四步进行操作，每次加入后在43摄氏度下孵育15分钟，以促进复合物形成。将样品在4摄氏度下以16000 × g离心30分钟，以去除任何聚集体。然后将样品置于150 µL玻璃插件中，并转移至样品瓶内。

然后将它们放入相应的托盘中。将缓冲液 H 和 D 置于 25 摄氏度下，样品和淬灭缓冲液置于 0 至 2 摄氏度下。接着，手动开启质谱仪的所有冷却单元。

当所有冷却系统均达到目标温度后，手动启动高效液相色谱泵和上样泵。打开控制这两台泵的软件，以及控制质谱仪的软件，并确保质谱仪处于待机状态。随后，断开高效液相色谱出口阀与质谱源之间的连接。

首先用三重清洗液冲洗系统，然后用缓冲液B冲洗，最后用缓冲液A冲洗。随后将胃蛋白酶柱插入系统。在用稳定流速和稳定压力冲洗系统后，将HPLC出口阀插入质谱源，并开启质谱仪。

现在打开软件。建立一个运行序列，并输入所有时间点、样品名称及在样品盘中的位置，以及缓冲液的名称和位置。运行结束后，通过将非氘代对照样品导入软件分析，来评估样品的肽段覆盖度。

将数据导入 HDX Workbench 软件，并使用该软件分析结果。保存选定的肽段，继续进行氘代摄取分析。化学变性会导致柠檬酸合酶在不利的缓冲条件下，因完全变性蛋白的重新折叠而迅速发生聚集。

另一方面，热诱导的聚集是由于天然折叠底物发生相对缓慢的去折叠所致。在这两种变性形式中，加入氧化态的Hsp33完全抑制了聚集，使360纳米处的读数降至可忽略水平。而还原态Hsp33对柠檬酸合酶的稳定性无任何影响，其聚集曲线与未添加分子伴侣时测得的曲线相似。

伴侣蛋白Hsp33在结合与未结合其底物柠檬酸合酶时的氘代模式揭示了该伴侣蛋白C端氧化还原开关结构域内存在一个客户蛋白相互作用位点。还原态的Hsp33具有完全有序的结构，但在感知到氧化应激时才发挥功能。尽管还原态的结合与未结合Hsp33产生相似的肽段氘代曲线，氧化态Hsp33在结合与未结合状态下则显示出30%的氘代差异，其中结合蛋白的特定区域表明存在别构阻碍效应。

建立方法后，散射实验可在数小时内完成，而DHEX方法若操作得当，则可在两到四天内完成。在进行该实验时，重要的是要提前规划。需注意，所述条件（如温度、孵育时间及缓冲液）均针对特定蛋白质，必须针对每种蛋白质进行优化。

通过该实验流程，还可进一步采用交联或沉淀等其他方法，以补充研究分子伴侣与其底物之间的相互作用。总之，该技术为结构生物学领域的研究人员探索分子伴侣中的蛋白质可塑性开辟了道路。