原位显微镜技术用于生物过程中单细胞形态的实时测定

该方法可通过细胞形态学评估，帮助解答群体异质性的关键问题。原位显微技术可实现对培养条件、工艺产量和产品质量的研究。该技术的主要优势在于其原位测量能力，能够在无需取样、避免污染风险的情况下提供实时数据。

原位显微镜结合自动图像识别可提供除尺寸外关于细胞结构、形态及细胞聚集的额外信息。该方法还可用于测量细胞浓度。该技术已被证实为一种可靠的工具。

目前尚无其他方法能在如此短的时间内以如此低的样品制备投入提供相同的信息。该方法已适用于多种生物过程及微生物，包括丝状真菌SEG、微型过敏原及酵母。该探针需与计算机配合使用。

该设备包含一个带有高分辨率CCD相机的单杆探头。当细胞通过可调节的测量间隙时，相机会对其进行成像。光线从相机对面进入间隙，即采用透射照明方式。

使用涵盖预期范围的细胞浓度来设置硬件参数。开始准备离线测量。使用厚度计调整测量间隙。

然后旋转探针螺钉螺母，将测量间隙设置为预期最大细胞直径的5倍或10倍。在计算机上打开探针控制器软件。在软件中选择所需的探针，然后进入“操作”部分。

然后按“连接”。接下来，进入“探头控制”选项卡并打开它。通过按下播放按钮开始视频流。

将探头固定在三脚架上，并对每次测量执行以下步骤。使用探头时，在测量间隙处喷洒乙醇，并用光学纸小心擦拭去除任何灰尘或污物。

在电脑上使用实时预览功能，检查传感器玻璃表面是否无颗粒物。接着，在测量间隙中放入一张干燥的光学纸以进行对焦。旋转固定螺丝，手动调节焦距。

当测量间隙中纸张的单根纤维清晰可见时，停止调焦。现在取一支装有培养液的试管，将显微镜浸入培养液中，使测量间隙完全被细胞悬液覆盖。

使用固定螺丝微调细胞的焦距。完成对焦后，在整个实验过程中不得再次更改。返回软件以继续实验。

进入触发菜单。在触发菜单下设置帧率。离线测量建议使用1赫兹。

随后，进入“每触发帧数”字段，根据需要设置合适的数值以获得良好的统计结果，此处约为 200。同时，进入“常规”菜单。

在此处选择用于保存图像的目录。单击“开始图像触发采集”按钮以开始图像采集。轻轻移动管子，以在测量间隙中诱导流动。

使用实验首次运行的图像作为训练集。准备好开源软件 Fiji，将实验图像拖放到其窗口中。完成后，依次选择“分析”、“工具”，然后选择“ROI 管理器”。

接下来，选择一个选区工具。在图像中，选定一个处于焦点内的颗粒进行标注。使用选区工具在其周围绘制一个圆形。

点击“添加”将注释加入 ROI 管理器。接着，选择画笔工具并选取合适的像素尺寸，使用画笔工具进一步优化选区。

以相同方式在约15张图像上继续标记所有感兴趣的对象。保存已标注的文件，并将其用作训练集。当识别算法训练完成并准备就绪后，使用该算法可视化结果。

在结果分析器中，依次点击文件（File），然后选择导入文件（Import File）。随后，选择所需的结果文件，并点击“创建图表”（Create Chart）按钮继续。

选择分布图。这将显示培养物的形态分布。返回“创建图表”以选择敏感性图。

显示的信息有助于确定为获得所需准确度必须分析的细胞数量。在完成离线测量后，进行在线测量。对于在线测量，将探针直接连接至生物反应器。

连接后，正确地对装置进行灭菌。在控制面板中选择“监测”。有一个播放按钮用于开始图像采集，一个停止按钮用于结束采集。

按下播放按钮。在生物反应器处，开始接种培养物。摄像头将捕获细胞的视频，并自动识别细胞以进行分析。

监测可提供整个发酵过程中不同细胞形态的细胞大小和形状的在线数据。实时结果可以以多种格式呈现，也可导出以进行进一步分析。该酿酒酵母细胞直径的累积分布图即由采用此技术分析得到的数据生成。

该结果表明，自动细胞识别能够区分出芽细胞和非出芽细胞。实线代表培养三小时期间的分布情况，虚线代表同一培养过程在七小时的分布情况。

虚线表示在13小时采集的数据。标注过程耗时较长，但这是实现细胞鉴定所需精度的关键。通过此过程，如果测量时间短于过程动态变化时间，则可将实时测量用于过程控制。

该技术为将群体异质性测量作为微生物培养的工艺参数铺平了道路，可应用于从早期工艺开发到生产规模的各个阶段。