原位 测量与生物发光细菌细胞密度和光发射的相关性

该方法有助于解答生物发光领域中的关键问题，例如，寻找发光细菌产生最大发光强度的最佳生长条件，以及确定其调控机制。该技术的主要优势在于操作简便，可适用于多种菌株和生物体，同时具有简单且快速的调整可能性。

采用该方法可深入了解lux操纵子的特性，也可应用于其他系统，如细菌、环境报告系统或传感器。首先，从甘油菌种或转化平板中接种含lux操纵子的E.coli BL21细胞至100毫升含卡那霉素的LB培养基中，制备过夜培养物。

将培养物在37摄氏度、120转/分钟的条件下过夜培养。次日，用8毫升过夜培养物接种800毫升LB卡那霉素培养基。将培养物置于摇床培养箱中，在37摄氏度、120转/分钟的条件下继续培养，直至菌液密度达到OD600为0.6至0.8。

将孵育温度降至28摄氏度，并加入0.1毫摩尔的IPTG以诱导蛋白表达。随后观察细胞，直至其开始发光。根据文本方案配制培养基后，将发光细菌菌株划线接种于人工海水培养基琼脂平板上，在24至30摄氏度条件下过夜孵育。

取平板上的单菌落接种于100毫升人工海水中，制备过夜培养物。随后在24至30摄氏度、120转/分钟条件下过夜培养。次日，取8毫升过夜培养物接种于800毫升人工海水中。

将细菌细胞在24至30摄氏度、120 RPM条件下培养，并观察细胞直至其开始发光。将目标发光细菌菌株或改造的大肠杆菌菌株划线接种至琼脂平板，于28摄氏度过夜培养。从过夜培养的平板上挑取单菌落接种至3毫升培养基中，在28摄氏度、180 RPM条件下培养约一至两小时。

在650纳米处测定液体培养物1:10稀释液的细胞密度。然后计算OD650为0.05时1毫升培养液体积的比值和所需体积。用移液器将计算出的培养物和培养基体积加入到带有玻璃底的24孔黑色孔板中。

为了确保含有完整lux操纵子的pET28a载体不会丢失，并在改造后的E.coli菌株中得到表达，需向样品中加入一微升卡那霉素和一微升IPTG。然后盖上培养板盖，以避免测量过程中发生蒸发。最后，使用设定为28摄氏度的酶标仪，并按照文本方案中提供的程序脚本，每10分钟进行一次吸光度和生物发光检测，两次数据采集之间进行振荡。

该图比较了大肠杆菌BL21细胞、含有空pET28a载体的BL21细胞以及含有插入lux-rib操纵子的pET28a载体但未诱导的BL21细胞在OD650处的测量值。三种细胞在发光方面的参考测量均显示出具有迟滞期、对数生长期和稳定期的S形生长曲线，但均无光发射，只有最后一种样品在300分钟后出现光发射，这是由于T7启动子存在泄漏表达所致。在此，比较了在LB培养基或人工海水培养基中，于28摄氏度下大肠杆菌中表达的lux操纵子的生长曲线与发光强度，以及发光细菌菌株Photobacterium mandapamensis 27561的相应参数。

经改造的大肠杆菌菌株和潘氏嗜肺军团菌可在人工海水中及LB培养基中生长，并均表现出发光现象。但在LB培养基中，潘氏嗜肺军团菌完全不发光。值得注意的是，经改造的大肠杆菌菌株的最大发光强度高于天然发光细菌。

在本实验中，通过24小时监测基于大肠杆菌的lux-rib操纵子的基因表达，以分析其持续时间。发光持续了19.5小时，远长于其他细菌菌株；在那些菌株中，发光强度逐渐下降，10小时后发光已非常微弱。该技术建立后，为生物发光领域的研究人员探索大肠杆菌等模式生物中的lux操纵子铺平了道路。

观看本视频后，您应该能够充分理解如何操作和培养生物发光细菌。