利用RNA对小鼠脑切片中pre-mRNA选择性剪接进行定量分析 原位 杂交实验

该方法有助于解答可变前体mRNA剪接领域的关键问题。具体而言，它提供了一种稳健且灵敏的检测系统，用于在组织切片中原位检测可变剪接模式。利用该方法，可在包含于复杂生物结构（如小鼠脑组织）中的多种亚型中同时分析可变剪接事件。

该技术的主要优势在于利用针对mRNA原位杂交的抗静电冲击外显子连接探针，产生特定剪接异构体的杂交信号。通过构建信号放大技术，提高了检测灵敏度，从而获得稳定的杂交信号。所检测到的信号来自外显子包含区域，利用特异性探针可计算小鼠脑部不同解剖区域中剪接事件在体内的百分比。

本研究以 NF1 基因的第 23a 外显子为例，说明该检测系统的使用方法。然而，该系统也可适用于分析多种可变外显子的表达模式。开始小鼠脑组织切片 D 的脱蜡时，用 250 毫升二甲苯填充两个洗涤皿。

另取两个装有250毫升100%乙醇的容器置于通风橱中。将组织切片插入清洗架中。随后，将清洗架放入盛有二甲苯的容器中，孵育5分钟，期间上下移动清洗架至少3次，并用第二个二甲苯容器重复此步骤。

然后将架子放入盛有乙醇的培养皿中，以相同的上下运动方式孵育两分钟，随后用第二个乙醇培养皿重复此步骤。为干燥载玻片，将架子从第二个乙醇培养皿中取出，放入60摄氏度的培养箱中干燥五分钟。使用疏水屏障笔在组织切片周围画一个0.75英寸×0.75英寸的屏障，室温下空气干燥三分钟。

打开杂交炉并将温度设置为40摄氏度。用蒸馏水彻底浸湿加湿纸后，将其放入湿度控制托盘中。然后将湿度控制托盘插入杂交炉内。

将干燥的载玻片放置于实验台上后，每张载玻片上的组织切片完全覆盖5至8滴过氧化氢溶液。室温孵育10分钟。逐张将载玻片在吸水纸上轻拍，以去除过氧化氢溶液，随后将载玻片插入洗涤架中。

将载片架浸入盛有水的洗涤皿中，上下移动3到5次以清洗载片。取一个1升的玻璃烧杯置于加热板上，加入700毫升1倍浓度的目标去除液，并用铝箔覆盖。将温度计穿过铝箔插入烧杯中，打开加热板，调至高温加热10到15分钟。

当修复液温度升至98摄氏度时，将加热板调至低温以维持轻微沸腾状态。随后，小心移去锡箔，将染色架放入烧杯中。用锡箔覆盖烧杯，并孵育15分钟。

使用镊子将架子从烧杯转移至含有 200 毫升蒸馏水的洗涤皿中，孵育 15 秒。15 秒后，将架子放入含有 100% 乙醇的洗涤皿中，孵育 3 分钟。将架子从皿中取出，并在 60 摄氏度下干燥 10 分钟。

将切片放置于染色架上后，每张切片覆盖五滴蛋白酶3。小心将染色架放入湿度控制盘中，并将盘子放入杂交炉内，在40摄氏度下孵育30分钟。从盘中取出染色架后，轻敲切片以去除多余液体，随后将其插入洗涤架中。

将支架放入盛有蒸馏水的洗涤皿中，上下移动3至5次，以清洗载玻片。为进行原位杂交，将探针和AMP试剂在室温下孵育30分钟。将湿度控制托盘插入杂交炉中，并设定温度为40摄氏度。

进行探针杂交时，将载玻片从洗涤架上取下，并轻拍以去除多余液体。将载玻片放置在染色架上。用铅笔在载玻片上标记探针名称。

将三张相邻切取的脑组织切片放在一起，用于与三种不同的神经纤维有丝分裂类型一探针进行杂交。由于存在多种不同的同工型特异性探针，我采用相邻切取的组织切片。这些切片在杂交、扩增和信号检测步骤中必须完全一致地处理，以确保剪接百分比计算的准确性。

每个组织切片上滴加四滴探针，一次处理一张载玻片，以防止切片干燥。然后将染色架放入湿度控制盘中，并置于40摄氏度的烘箱内孵育两小时。接着，在一个盛有200毫升1X洗涤缓冲液的洗涤皿中放入洗涤架。

然后依次将每张载玻片在纸巾上轻拍，以去除多余的液体，并立即将每张载玻片插入洗涤架中。将装有新鲜洗涤缓冲液的培养皿置于室温下，将架体上下移动3至5次，孵育2分钟，然后在新的培养皿中重复洗涤一次。

为了信号扩增，轻敲每张载玻片以去除多余的洗涤缓冲液，并将其放置在染色架上。在每张载玻片的组织切片上覆盖四滴AMP零试剂。接着，将染色架放入湿度控制盘中，将盘子放入烘箱，在40摄氏度下孵育30分钟。

用洗涤缓冲液将玻片洗涤两次，操作方法与本实验之前步骤相同。按照文本方案中的描述，使用AMP试剂一至六重复信号放大步骤，并在每一步之后洗涤玻片。进行信号检测时，轻敲玻片以去除多余的洗涤缓冲液，然后将其放置在染色架上。

接下来，在微量离心管中将两微升快红B与120微升快红A混合。将混合液加入每张载玻片上的组织切片，使其完全覆盖。将染色架放入湿度控制盘中，盖上盖子，在室温下孵育10分钟。

然后移除溶液，将玻片插入清洗架中。将清洗架放入盛有自来水的清洗皿中清洗玻片，并重复清洗一次。第二次清洗后，轻敲吸水纸以去除多余的水分。

接下来，将架子放入含有50%苏木精染色液的染色缸中，上下移动数次，然后在室温下孵育两分钟。

将染色架转移至含有自来水的清洗皿中。上下移动染色架5次，并重复清洗直至载玻片变得透明，而组织切片仍保持紫色。然后将染色架转移至含有0.02%氨水的器皿中。

上下移动载架两到四次，直至切片变为蓝色。在染色缸中用自来水冲洗载片三到五次。接着，将载架放入孵育箱中，在60摄氏度下孵育15分钟以干燥载片。

完全干燥后，在每张载玻片上滴加一滴封片剂以覆盖组织切片。然后，小心地将一块24 × 50毫米的盖玻片盖在每张载玻片的组织切片上。室温下静置空气干燥30分钟后，即可进行数据采集。

为了计算外显子23a的可变剪接百分比（PSI值），需对大脑皮层的三个亚区以及海马CA3区域中的细胞数量和点状信号数量进行计数。使用三种不同的NF1特异性探针，在CD1野生型小鼠的脑切片上进行RNA原位杂交实验。在皮层和海马切片中观察到的红色点状信号，分别代表NF1全长探针、包含特异性探针对应的阳性信号以及跳过特异性探针对应的阳性信号。

随后对三个探针的ISH信号进行计数，并用于计算PSI。在C57 black 6J野生型小鼠和C57 black 6J突变型小鼠的皮层中进行RNA原位杂交实验，其中突变型小鼠在所有细胞类型中均包含外显子23a。在C57 black 6J野生型小鼠皮层中观察到的红色点状斑点，表明NF1总探针、包含特异性探针和跳跃特异性探针均产生阳性信号。

在 C57 黑色 6J 突变小鼠中，NF1 全长探针和包含特异性探针获得的信号相似。然而，当使用跳跃特异性探针时未检测到信号，表明靶向外显子包含或跳跃的两个探针均具有高度特异性。由于目前该实验程序尚无法在同一组织切片上进行多色标记，因此在不同组织切片上使用不同的探针。

为了获得准确的剪接百分比值，重要的是使用相邻切下的切片，并在整个过程中以完全相同的方式处理切片。此外，还可结合免疫组织化学等方法，以进一步探究差异表达剪接异构体的定位和功能等相关问题。