RNA原位杂交法定量分析小鼠脑切片中的替代前 mRNA 拼接方法
August 26th, 2018
本文介绍了一种利用短反义寡核苷酸检测小鼠脑部替代前 mRNA 拼接模式的原位杂交协议。
这种方法可以帮助回答选择性 pre-mRNA 剪接领域的关键问题。具体来说，它提供了一个稳健、灵敏的检测系统，用于原位检查组织切片中的选择性剪接模式。使用这种方法，可以同时分析复杂生物结构（如小鼠大脑）中包含的许多亚型的选择性剪接。
该技术的主要优点是它在 mRNA 原位杂交中使用休克抗静电外显子连接探针来产生亚型特异性杂交信号。构建信号放大技术提高了检测的灵敏度，以提供稳定的杂交信号。检测到的信号是逃逸特定探针的外显子包涵体，这些探针用于计算小鼠大脑不同解剖区域生命体征剪接的百分比。
在本研究中，以 NF1 外显子 23a 为例来说明测定系统的使用。然而，该系统可以适应分析许多替代外显子的表达模式。要开始小鼠脑切片 D 石蜡化，请在两个洗涤盘中加入 250 毫升二甲苯。
另外两个在通风橱内使用 250 毫升 100% 乙醇。将组织载玻片插入清洗架中。接下来，将清洗架放入含二甲苯的培养皿中，孵育 5 分钟，同时上下移动清洗架至少 3 次，然后对第二个二甲苯培养皿重复。
然后将架子放入含乙醇的培养皿中，以相同的上下动作孵育 2 分钟，然后对第二个乙醇培养皿重复此作。要干燥载玻片，请将架子从第二个乙醇培养皿中移出，并将其放入 60 摄氏度的培养箱中 5 分钟。使用疏水屏障笔在组织切片周围绘制 0.75 英寸 x 0.75 英寸的屏障，并在室温下风干 3 分钟。
打开杂交炉并将温度设置为 40 摄氏度。用蒸馏水完全润湿加湿纸后，将其放入湿度控制托盘中。然后将湿度控制盘插入杂交炉中。
将干燥的玻片放在工作台上后，用 5 到 8 滴过氧化氢溶液完全覆盖每张玻片上的组织切片。在室温下孵育 10 分钟。在吸水纸上轻敲玻片，一次一张以去除过氧化氢溶液，然后将玻片插入清洗架。
将架子浸入盛有水的洗涤盘中，同时上下移动 3 到 5 次以清洗载玻片。将 700 mL 1X 靶标去除处理液装满放在热板上的 1 升玻璃烧杯中，并用铝箔纸盖住。将温度计插入铝箔盖，打开热板，将高温加热 10 至 15 分钟。
一旦修复试剂的温度达到 98 摄氏度，将热板置于低温以保持温和的沸腾状态。接下来，小心地取下铝箔纸，将架子放入烧杯内。用箔纸盖住烧杯，孵育 15 分钟。
使用镊子将架子从烧杯转移到装有 200 毫升蒸馏水的洗涤皿中，并孵育 15 秒。15 秒后，将架子放入含有 100% 乙醇的洗涤皿中，孵育 3 分钟。从培养皿中取出架子，在 60 摄氏度下干燥 10 分钟。
将载玻片放在染色架上后，每张载玻片用 5 滴蛋白酶 3 覆盖组织切片。小心地将支架放入湿度控制托盘中，然后将托盘插入杂交炉中，在 40 摄氏度下孵育 30 分钟。从托盘中取出架子后，轻敲载玻片以去除多余的液体并将其插入清洗架中。
将架子放入装有蒸馏水的洗涤皿中，上下移动架子 3 到 5 次以清洗载玻片。为了准备原位杂交，将探针和 AMP 试剂在室温下孵育 30 分钟。将湿度控制托盘插入杂交炉并设置为 40 摄氏度。
对于探针杂交，从清洗架上取下载玻片并轻敲它们以去除多余的液体。将玻片放在染色架上。用铅笔用探针名称标记载玻片。
将三个相邻切割的脑组织载玻片与三个不同的神经纤维有丝分裂 1 型探针杂交在一起。因为有非常不同的亚型特异性探针，所以我使用相邻切割的组织切片。在杂交、扩增和信号检测步骤中，这些切片的处理方式必须完全相同，以确保计算中剪接百分比的准确性。
每个切片用四滴探针覆盖组织切片，一次一张幻灯片，以防止切片变干。然后将染色架放入湿度控制托盘中，将其插入 40 摄氏度的烤箱中两小时。接下来，将洗涤架放入装有 200 mL 1X 洗涤缓冲液的洗涤皿中。
然后在纸巾上轻敲每张玻片，一次一张，以去除多余的液体。并立即将每张玻片插入清洗架。在装有新鲜洗涤缓冲液的培养皿中室温孵育 2 分钟，同时上下移动架子 3 到 5 次，然后在新培养皿中重复洗涤。
对于信号放大，轻敲每张载玻片以去除多余的洗涤缓冲液，并将其放在染色架上。用四滴 AMP 零试剂覆盖每张玻片上的组织切片。接下来，将架子放入湿度控制托盘中，将托盘插入烤箱并在 40 摄氏度下孵育 30 分钟。
如本实验中先前所做的那样，用洗涤缓冲液洗涤载玻片两次。按照文本实验步骤中的说明，使用 AMP 试剂 1 到 6 重复信号放大步骤，并在每个步骤后洗涤玻片。对于信号检测，敲击从载玻片上去除多余的洗涤缓冲液，并将其放在染色架上。
接下来，在微量离心管中将 2 μL 固红 B 与 120 μL 固红 A 混合。将溶液添加到每张载玻片上的组织切片中，以完全覆盖它们。将染色架放入湿度控制托盘中，盖上托盘并在室温下孵育 10 分钟。
然后取出溶液并将玻片插入清洗架。将架子放在装有自来水的洗涤盘中清洗载玻片并重复洗涤。第二次洗涤后，轻拍吸水纸以去除多余的水分。
接下来，将架子放入含有 50% 苏木精染色溶液的培养皿中。上下移动机架数次。并在室温下孵育 2 分钟。
将架子转移到装有自来水的洗涤盘上。上下移动架子五次并重复洗涤，直到载玻片变得透明，而组织切片保持紫色。然后将架子转移到含有 0.02% 氨水的培养皿中。
上下移动机架 2 到 4 次，直到各部分变为蓝色。在染色皿中用自来水清洗载玻片 3 到 5 次。接下来，将架子放入培养箱中，在 60 摄氏度下孵育 15 分钟以干燥玻片。
完全干燥后，在每个载玻片上加入一滴封固剂以覆盖切片。然后，小心地将 24 x 50 毫米的盖玻片放在每张载玻片上的组织切片上。在室温下风干玻片 30 分钟后，继续进行数据采集。
为了计算外显子 23a 的剪接百分比或 PSI 值，计算皮层和海马 CA3 的三个子区域中的细胞和点的数量。使用三种不同的 NF1 特异性探针在 CD1 野生型小鼠的脑切片中进行 RNA 原位杂交测定。在皮层和海马体切片中观察到的红色点状点表示 NF1 总探针、包涵体特异性和跳过特异性探针的阳性信号。
然后对来自三个探头的 ISH 信号进行计数并用于计算 PSI。在 C57 黑色 6J 野生型小鼠和 C57 黑色 6J 突变小鼠的皮层中进行 RNA 原位杂交测定，其中外显子 23a 包含在所有细胞类型中。在 C57 黑色 6J 野生型小鼠的皮层中观察到的红色点状点表示 NF1 总探针、包涵体特异性和跳过特异性探针的阳性信号。
在 C57 黑色 6J 突变小鼠中，通过 NF1 总探针和包涵体特异性探针获得相似的信号。然而，当使用跳过特异性探针时，没有检测到信号，表明靶向外显子包含或跳过的两个探针是高度特异性的。由于同一组织载玻片上的多色标记尚不可用于此程序，因此在不同的组织载玻片上使用不同的探针。
为了获得准确的剪接百分比值，在整个过程中使用相邻切割的玻片并以完全相同的方式处理玻片非常重要。作为该程序的补充是免疫组织化学等措施，可以执行以回答有关差异表达剪接亚型的定位和功能的其他问题。
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概述
本文描述了一种利用短反义寡核苷酸进行原位杂交（ISH）的协议，用于检测小鼠脑切片中的替代性前信使RNA剪接模式。该方法允许同时分析复杂生物结构内各种亚型的剪接模式。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 分子生物学
背景
- 替代性前信使RNA剪接对于生成蛋白质多样性至关重要。
- 理解剪接模式可以提供对脑功能和疾病的洞察。
- 原位杂交技术对于在组织背景下研究剪接至关重要。
- 本研究聚焦于小鼠脑切片，以探索剪接变异。
研究目的
- 开发一种用于原位检测替代性剪接的敏感测定。
- 分析不同脑区的剪接模式。
- 增强对脑中剪接机制的理解。
使用的方法
- 利用短反义寡核苷酸进行原位杂交。
- 使用抗静电外显子结合探针进行异构体特异性信号。
- 信号放大技术以提高检测灵敏度。
- 分析各解剖区的外显子包含和剪接百分比。
主要结果
- 使用开发的方法实现了稳健的杂交信号。
- 成功检测到小鼠脑切片中的替代性剪接模式。
- 该技术允许同时分析多个剪接事件。
- 结果有助于理解神经组织中剪接的复杂性。
结论
- ISH协议为研究替代性剪接提供了一个有价值的工具。
- 研究结果增强了对脑中剪接机制的认知。
- 该方法可以促进对与剪接相关的神经系统疾病的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables spatially resolved quantification of alternative splicing events in complex tissues, addressing a critical gap in target validation where bulk RNA approaches mask cellular heterogeneity. By providing isoform-specific signals at single-cell resolution in anatomically defined brain regions, it supports mechanistic de-risking of splicing-dependent targets in neuroscience drug discovery. The ability to calculate percent spliced in (PSI) values from exon inclusion and skipping signals offers a quantitative, reproducible metric for assessing target engagement and pathway modulation in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking specific splice isoforms to cell-type-specific expression patterns in disease-relevant brain regions.
- Operational Value: Provides a robust, sensitive assay system for examining alternative splicing patterns in situ within tissue slices, reducing reliance on dissociated cell models that lose spatial context.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Uses shock anti-static exon junction probes to generate isoform-specific hybridization signals, enabling simultaneous analysis of multiple subtypes within complex biological structures.
- Operational Value: Signal amplification technology increases detection sensitivity, producing robust signals suitable for quantitative imaging and automated analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system analysis by mapping splicing patterns across anatomical areas such as cortex and hippocampus, supporting biomarker discovery for neuropsychiatric indications.
- Operational Value: Enables parallel processing of adjacently cut tissue sections under identical conditions, ensuring data accuracy for cross-sectional comparisons in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, where spatially resolved splicing data informs target selection and mechanistic understanding before assay development for high-throughput screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing cell-type-specific alternative splicing patterns that may be obscured in bulk tissue analyses.
- Screening: Generates quantitative, spatially resolved readouts (e.g., PSI values) that can inform assay design for splicing-modulating compounds.
- Analytics: Enables calculation of percent spliced in from exon inclusion and skipping signal counts, providing a normalized metric for comparing conditions across brain regions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by validating splicing changes in anatomically defined regions relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: The probe-based approach is adaptable to multiple alternative exons, positioning it as a reusable platform for splicing analysis across diverse targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking specific splice isoforms to defined anatomical locations, increasing confidence in target-disease relationships.
- Operational Value: Standardized protocol with built-in controls (e.g., adjacently cut slides, identical processing) enhances reproducibility across sites and users.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by providing spatially resolved efficacy and mechanism data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated splicing expression in disease-relevant neural circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA in situ hybridization, tissue sectioning, and quantitative image analysis for punctate dot counting.
- Dependent on hybridization ovens, humidity control trays, and reagent systems for probe hybridization, signal amplification, and detection (e.g., Fast Red).
- Necessitates standardization across teams for slide preparation, probe incubation, and washing steps to ensure comparability of PSI calculations.
- Adaptation to new exons requires design and validation of exon junction-specific probes, with sensitivity to target sequence accessibility.
- Practical limitation: Multi-color labeling is not currently available, requiring sequential analysis on separate slides, which increases tissue sectioning and processing demands.
