Name: RNA原位杂交法定量分析小鼠脑切片中的替代前 mRNA 拼接方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 学习使用短反义寡核苷酸探针在小鼠脑切片中进行RNA原位杂交，定量分析替代前mRNA剪接模式。该方法结合信号放大技术，可同时检测多种剪接亚型，为神经科学研究提供高灵敏度工具。

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本工作得到了美国心脏协会 [资助号 0365274B 致 H.L.]、国家癌症研究所 [GI SPORE P50CA150964 致 Z.W.]、美国国立卫生研究院 [研究基础设施办公室共享仪器资助 S10RR031845 致凯斯西储大学光学显微成像中心] 以及中国国家留学基金管理委员会 [致 X.G.] 的支持。 
作者感谢理查德·李（Richard Lee）在光学显微成像核心设施中对切片扫描提供的帮助。

本研究所涉及的所有小鼠实验均已获得凯斯西储大学机构动物护理和使用委员会的批准。实验方案编号2016-0068（项目负责人：Hua Lou）的标题为“选择性pre-mRNA剪接在脊椎动物发育中的作用”。
注意：本方案中使用的所有仪器、试剂和耗材的信息均包含在材料表中。
1. 准备福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片
<ol>
	<li>通过颈椎脱位法处死1只CD1小鼠和1只C57BL/6J小鼠。使用手术剪和镊子小心剪开颅骨，用解剖铲取出脑组织。 
	注意：使用5月龄雄性CD1小鼠和3月龄雄性C57BL/6J小鼠，结果相似。
	<ol>
		<li>用PBS清洗脑组织。将整个脑组织置于50 mL含10%甲醛的溶液中，在室温（RT）下固定30小时。</li>
		<li>将固定液更换为PBS，于4 °C下在PBS中孵育过夜。按照标准操作流程18，使用二甲苯和石蜡对脑组织进行脱水和包埋。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用切片机将包埋组织切成5 µm切片。先将石蜡带放入室温水浴中，再转移至45 °C水浴中以展平切片带。
	<ol>
		<li>当切片带上的皱褶消失后，立即将其转移至载玻片上。在室温下将载玻片空气干燥过夜。使用前在60 °C下烘烤1小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 样品预处理
<ol>
	<li>脱蜡组织切片。在通风橱中进行这些步骤。
	<ol>
		<li>填充两个洗涤盘（图1A用250 mL新鲜二甲苯清洗两次，再用250 mL 100%乙醇清洗两次。将组织切片插入清洗架中（图1A）并按照指定的顺序和孵育时间将洗涤架放入洗涤盘中 表1.</li>
		<li>每次孵育期间，将洗涤架在洗涤皿中上下移动超过3次。每次孵育后，迅速将洗涤架转移至下一个洗涤皿中，以防止组织切片干燥。</li>
		<li>孵育步骤完成后，将装有玻片的洗涤架从洗涤皿中取出，放入60 °C的培养箱中5分钟，或直至玻片完全干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用疏水屏障笔在组织切片周围画一个 0.75’’ × 0.75’’ 的屏障。室温下静置晾干 3 分钟。</li>
	<li>预处理切片
	<ol>
		<li>准备试剂与仪器
		<ol>
			<li>打开杂交炉（图1B并将温度设置为40 °C，使用前预热30分钟。</li>
			<li>润湿加湿纸（图1E）用蒸馏水彻底冲洗，并将其放入湿度控制托盘中（图1D，左侧）。将湿度控制盘保留在杂交炉中。</li>
			<li>通过将630 mL去离子水加入70 mL的10x靶标修复试剂中，配制700 mL新鲜的1x靶标修复试剂2O至70 mL的10倍浓度靶标修复试剂。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>加入过氧化氢。
		<ol>
			<li>将脱蜡后的切片置于实验台上。向组织区域加入5–8滴过氧化氢，确保完全覆盖组织。室温孵育10分钟。</li>
			<li>将载玻片逐个在吸水纸上轻拍，以去除过氧化氢溶液。立即将载玻片插入洗涤架中，并将洗涤架移至盛有去离子水的洗涤皿中。2O.</li>
			<li>将染色架在蒸馏水中上下移动3至5次以清洗载玻片。将清洗架转移至盛有新鲜蒸馏水的洗涤皿中，再清洗一次载玻片。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行靶点回收
		<ol>
			<li>将一个1,000 mL玻璃烧杯置于加热板上。向烧杯中加入700 mL新鲜的1x Target Retrieval试剂，并用铝箔覆盖。通过铝箔盖将温度计插入烧杯中（图1C开启电热板，并调至高温加热10–15分钟。</li>
			<li>当修复液温度升至98 °C时，将加热板的温度控制从高温调至低温，以维持轻微沸腾状态。切勿沸腾超过15分钟。</li>
			<li>同时，小心打开锡箔纸，将装有切片的洗涤架放入修复液中。重新盖上烧杯，孵育15分钟。</li>
			<li>使用镊子将架子从烧杯中取出，放入盛有 200 mL dH₂O 的洗涤皿中2O 并冲洗 15 秒。</li>
			<li>将支架移至含有100%新鲜乙醇的清洗皿中，静置3分钟。取出载玻片，置于60 °C培养箱中干燥10分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>加入蛋白酶III
		<ol>
			<li>将载玻片放置在染色架上（图1D，右侧）。加入5滴蛋白酶III以覆盖组织。将支架小心放入湿度控制托盘中（图1D，左侧）并将托盘放入40°C杂交炉中，孵育30分钟。</li>
			<li>取出载物架，将托盘放回烤箱中。逐个轻敲载玻片以去除多余液体。将载玻片插入清洗架中，并将清洗架放入盛有去离子水的清洗皿中2O. 上下移动支架，清洗载玻片 3 至 5 次。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 原位杂交检测
<ol>
	<li>准备材料
	<ol>
		<li>将50倍洗涤缓冲液置于40 °C培养箱中预热20分钟。取2.94 L去离子水（dH2O）与60 mL 50倍洗涤缓冲液混合，配制成1倍洗涤缓冲液。</li>
		<li>通过将100 mL Gill苏木精I溶液加入100 mL去离子水（dH2O）中，配制50%苏木精染色液。通过将1.43 mL 1 N氢氧化铵加入250 mL去离子水（dH2O）中，配制0.02%（w/v）氨水。在容器中充分混匀。</li>
		<li>在使用前将探针和AMP 0–6试剂置于室温（RT）平衡30分钟。将湿度控制盘置于40 °C杂交炉中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>原位杂交（ISH）操作步骤 
	注意：为检测Nf1剪接异构体的表达水平并计算外显子23a的剪接包含率（PSI值），需使用三种不同的ISH探针，分别靶向包含外显子23a的异构体、不包含外显子23a的异构体，或同时靶向两种异构体（图2）。这些探针应用于相邻切片的组织切片上。为确保计算结果的准确性，三个组织切片在杂交、扩增和信号检测步骤中必须接受完全相同的处理。
	<ol>
		<li>探针杂交。
		<ol>
			<li>从洗涤架上取出载玻片，并轻敲去除多余液体。将载玻片放入染色架中。</li>
			<li>用铅笔在载玻片上标记探针名称。将三张相邻切取的脑组织切片（分别用于与三种不同的Nf1探针杂交）（图2）一同放置。后续所有步骤均需按相同的载玻片顺序进行。</li>
			<li>每张载玻片滴加4滴探针溶液，确保完全覆盖组织。每次处理一张载玻片，以防止切片干燥。将染色架放入湿度控制盘中，并置于40 °C烘箱内孵育2小时。</li>
			<li>用洗涤缓冲液清洗载玻片两次。每次清洗时，在染色皿中加入200 mL 1倍洗涤缓冲液，并放入洗涤架。逐张轻敲载玻片以去除多余液体，迅速将其插入洗涤架中。在室温下，将洗涤架在染色皿中上下移动3–5次，持续2分钟。</li>
			<li>第二次清洗时使用新鲜的洗涤缓冲液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>信号扩增。
		<ol>
			<li>轻敲去除载玻片上多余的洗涤缓冲液，并将其放入染色架中。每张载玻片滴加4滴AMP 0溶液，完全覆盖组织。将染色架放入湿度控制盘中，置于40 °C烘箱中孵育30分钟。</li>
			<li>按照上述方法，用洗涤缓冲液清洗载玻片两次。</li>
			<li>按照表2所示的顺序和条件，依次使用AMP 1–6重复此步骤。每次杂交后均需清洗载玻片两次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>信号检测
		<ol>
			<li>轻敲去除载玻片上多余的洗涤缓冲液，并将其放入染色架中。在微量离心管中，将2 µL Fast Red B加入120 µL Fast Red A中（比例为1:60）。充分混匀后，滴加至完全覆盖组织切片。 
			注意：Fast Red A/B混合液的总体积应根据组织切片的数量和大小进行调整。对于0.75英寸 × 0.75英寸的区域，每张切片使用120 µL即可。混合液需在配制后5分钟内使用，并避免暴露于直射阳光或紫外光下。</li>
			<li>盖上容器，室温孵育10分钟。将溶液转移至废液容器中，立即将载玻片插入洗涤架，并将架放入盛有自来水的洗涤皿中。再用新鲜自来水冲洗一次。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>载玻片复染
	<ol>
		<li>从自来水中取出洗涤架，迅速在吸水纸上轻敲以去除多余水分。将染色架浸入50%苏木精染色液中，并立即上下移动数次。室温孵育2分钟。</li>
		<li>将染色架重新放回盛有自来水的洗涤皿中。通过上下移动染色架并更换新鲜自来水，清洗3–5次，直至载玻片变得透明，而脑组织仍保持紫色。</li>
		<li>将染色架转移至盛有0.02%氨水的染色皿中。上下移动2–3次，直至组织变为蓝色。在染色皿中用新鲜自来水清洗载玻片3–5次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品封片
	<ol>
		<li>将染色架从染色皿转移至60 °C培养箱中，孵育至少15分钟，直至载玻片完全干燥。</li>
		<li>在载玻片上滴加40 µL封片介质，小心地将24 mm × 50 mm盖玻片覆盖在组织切片上。室温下空气干燥30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据收集与分析
注意：使用切片扫描仪以 40 倍放大倍率扫描图像。
<ol>
	<li>阳性与阴性对照
	<ol>
		<li>每次实验均需设置阳性与阴性对照（图3）。理想的阳性对照信号应在20-40倍放大下以点状小点清晰可见。</li>
		<li>使用小鼠（Mm）-PPIB-1ZZ作为阳性对照。该探针靶向常见的看家基因PPIB。阴性对照的标准为：在20倍显微镜视野下，每20个细胞中出现一个背景染色点可接受。</li>
		<li>使用DapB-1ZZ探针作为阴性对照。该探针靶向细菌基因dapB。这些对照探针已在多种原位杂交（ISH）检测中广泛应用19。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nf1外显子23a的可变剪接表达模式的信号检测与分析
	<ol>
		<li>由于杂交信号表现为点状小点，可通过手动计数点的数量。点的数量与特定探针所检测到的转录本水平呈正相关。注意：也可使用ImageJ或SpotStudio软件进行点的自动分析。</li>
		<li>使用三种探针分别杂交含外显子23a、不含外显子23a的异构体以及总的Nf1转录本（图2）。由于这三种探针无法同时使用，需采用三张相邻的脑组织切片，分别与每种探针进行杂交。
		<ol>
			<li>为计算外显子23a的剪接包含率（PSI），需在多个脑区中统计细胞数量和点的数量。针对每个感兴趣区域，应根据图4所示，在多个亚区域中总计超过400个细胞。</li>
			<li>对三种探针分别在相同亚区域收集数据。PSI的计算公式为：（外显子23a包含探针检测到的每细胞点数）/（外显子23a包含探针检测到的每细胞点数 + 外显子23a跳过探针检测到的每细胞点数）× 100%。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本通讯报道了使用BaseScope RNA原位杂交技术检测小鼠脑组织切片中反义链（AS）表达模式的方法。结果表明，长度短于50个核苷酸的反义链外显子-外显子连接探针能够稳健且特异性地靶向识别外显子包含和外显子跳跃异构体。此外，所获得的信号可用于计算替代外显子的PSI值。
在实验流程中测试了几种不同的变体。例如，通过冷冻切片机制备的冷冻组织切片经测试后证明也可成功用于本原位杂交（ISH）方案。但在这种情况下，步骤2.1中的脱蜡步骤需改为使用PBS洗涤OCT包埋剂5分钟。此外，尽管使用ACD公司提供的杂交炉非常方便，但使用设定在40 °C的普通培养箱，结合免疫组织化学用的玻片染色盒，也能获得相当的结果。关键是在整个操作过程中，通过在盒内放置湿润的滤纸以保持湿度。
该实验步骤存在一定的局限性。目前尚无法在同一张组织切片上进行多色标记，因此不同的探针只能用于相邻切片的不同组织切片上。为了获得准确的 PSI 值，必须确保每张组织切片的探针杂交、信号扩增和检测的孵育时间完全一致。未来若能实现在同一张组织切片上使用多色探针（如 RNAsco...

可变剪接（AS）是前体mRNA成熟过程中常见的现象。在此过程中，一个外显子可能在成熟mRNA中被差异性地包含或排除。因此，通过可变剪接，单个基因可以产生多种mRNA，进而编码不同的蛋白质产物。据估计，92–94%的人类基因经历可变剪接1,2。由基因突变导致的异常可变剪接模式与多种疾病相关，包括肌萎缩侧索硬化症、强直性肌营养不良和癌症3,4。因此，研究并深入理解可变剪接的调控机制，对于寻找人类疾病的新疗法具有重要意义。
可变剪接（AS）通常以细胞类型特异性的方式进行调控。确定特定基因在特定生物系统中的可变剪接表达模式具有重要意义。然而，当研究对象为包含多种不同类型细胞的复杂器官（如脑或心脏）时，这一任务变得复杂。在此情况下，理想的检测体系是RNA 原位 原位杂交（ISH）使用组织切片，从而可同时在多种细胞类型中检测特定基因的可变剪接表达模式。事实上，外显子特异性探针已被用于评估可变外显子的表达水平5,6,7然而，这种方法并不适用于AS模式分析，原因如下：首先，传统的ISH方法通常使用长于300 bp的探针，而脊椎动物内部外显子（非首个或末个外显子）的平均长度为170个核苷酸8,9第二，当使用外显子特异性探针检测内部可变剪接外显子的剪接模式时，探针仅能检测到包含该外显子的mRNA异构体，而无法检测到缺失该外显子的mRNA异构体，因此计算该可变外显子的“剪接入百分比”（percent spliced in, PSI）值较为复杂。此外，传统的荧光原位杂交（ISH）通常将ISH与免疫染色结合使用，这会降低检测的效率和稳健性。例如，在一项研究应激诱导的乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE）mRNA剪接异构体转换的实验中，地高辛（digoxigenin）被标记至ISH探针中，并通过抗地高辛抗体进行检测；另一种方法是使用生物素标记的探针，再通过碱性磷酸酶/链霉亲和素偶联物及碱性磷酸酶底物进行检测。10两种方法均未采用任何扩增策略来提高检测灵敏度，因此难以检测低水平表达的mRNA转录本。因此，需要一种更简单且更可靠的原位杂交（ISH）检测系统来分析AS表达模式。 原位.
BaseScope 是最近基于 RNAscope 平台开发的，后者是一种已建立且广泛应用的原位杂交（ISH）检测系统。这两种检测系统均采用靶标特异性的扩增技术，以提高检测的灵敏度11,12区别在于靶序列的长度，BaseScope的靶序列可短至50个核苷酸，而RNAscope的靶序列长度为300–1,000个核苷酸。因此，可以设计靶向外显子-外显子连接区域的探针，以检测特定的可变剪接mRNA异构体。在本研究中，建立了一种检测神经纤维瘤病1型（neurofibromatosis type 1, NF1）选择性剪接（AS）表达模式的实验流程。Nf1) 外显子23a，同一实验室深入研究过的可变外显子13,14,15,16,17小鼠脑切片中的表达模式。结果表明，BaseScope 是研究表达模式的理想系统 Nf1 外显子23a 原位由于该检测系统可被用于分析多个可变外显子的可变剪接表达模式，因此它为可变剪接研究提供了一种强大的新工具。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>杂交炉</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>241000ACD</td><td></td></tr><tr><td>湿度控制盘（带盖）</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310012</td><td></td></tr><tr><td>染色架</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310017</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>Fisher Scientific</td><td>1160049SH</td><td></td></tr><tr><td>Imperial III 通用培养箱</td><td>Lab-Line</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>切片扫描仪</td><td>Leica</td><td>SCN400</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;预处理试剂盒&lt;/strong&gt;</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>322381</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000899</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 III*</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000901</td><td></td></tr><tr><td>10x 靶标修复液</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2002555</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope 检测试剂盒</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>332910</td><td></td></tr><tr><td>AMP 0</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001814</td><td></td></tr><tr><td>AMP 1</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001815</td><td></td></tr><tr><td>AMP 2</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001816</td><td></td></tr><tr><td>AMP 3</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001817</td><td></td></tr><tr><td>AMP 4</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16229B</td><td></td></tr><tr><td>AMP 5-RED</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16229C</td><td></td></tr><tr><td>AMP 6-RED</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001820</td><td></td></tr><tr><td>Fast RED-A</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001821</td><td></td></tr><tr><td>Fast RED-B</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16230F</td><td></td></tr><tr><td>50x 洗涤缓冲液</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>阴性对照探针- 小鼠 DapB-1ZZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701021</td><td></td></tr><tr><td>阳性对照探针- 小鼠 (Mm)-PPIB-1ZZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701081</td><td></td></tr><tr><td>对照切片-小鼠 3T3 细胞团</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310045</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加湿纸</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310015</td><td></td></tr><tr><td>洗涤架</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>9837976</td><td></td></tr><tr><td>洗涤皿</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>LWS20WH</td><td></td></tr><tr><td>疏水屏障笔</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片，24 mm × 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12--545-F</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氢氧化铵</td><td>Fisher Scientific</td><td>002689</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇 (EtOH)</td><td>Decon Labs</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF94-4</td><td></td></tr><tr><td>苏木精 I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>17012359</td><td></td></tr><tr><td>封片介质</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher Scientific</td><td>173942</td><td></td></tr></tbody></table>

利用rna对小鼠脑切片中pre-mrna选择性剪接进行定量分析 原位 杂交实验

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

选择性剪接（AS）发生在超过90%的人类基因中。选择性剪接外显子的表达模式通常以细胞类型特异性的方式进行调控。AS表达模式通常通过RT-PCR和RNA-seq分析从细胞群体中分离的RNA样本进行检测。原位检测特定生物结构中的AS表达模式可通过使用外显子特异性探针的RNA原位杂交（ISH）实现。然而，ISH在这一特定用途上的应用受到限制，因为可变外显子通常太短，难以设计外显子特异性探针。本报告描述了BaseScope技术的应用，该技术是最近开发的一种在RNA ISH中使用短反义寡核苷酸的技术，用于分析小鼠脑切片中的AS表达模式。以神经纤维瘤病1型（Nf1）的第23a外显子为例，说明短的外显子-外显子连接探针在小鼠脑切片的RNA ISH分析中可产生强而特异的杂交信号。更重要的是，使用包含和跳过外显子特异性探针所检测到的信号可可靠地计算小鼠脑不同解剖区域中Nf1第23a外显子的“包含百分比”（percent spliced in）值。本文提供了AS分析的实验方案和计算方法。结果表明，BaseScope为原位评估AS表达模式提供了一种强大的新工具。

使用三种小鼠品系进行BaseScope原位杂交实验：CD1野生型小鼠、C57BL/6J野生型小鼠，以及在C57BL/6J背景下的Nf123aIN/23aIN突变小鼠，该突变小鼠由于人工构建的剪接位点突变，导致外显子23a在所有细胞类型中均被包含14,15。
首先，使用公司提供的试剂对原位杂交（ISH）检测系统进行测试：载玻片上含有3T3细胞，以及阴性和阳性ISH探针。如图3所示，使用阴性对照探针时未检测到信号，而使用阳性对照探针时检测到大量点状信号。
接下来，使用小鼠脑切片和特异性针对 Nf1 的探针...

一个 原位 描述了一种使用短反义寡核苷酸在小鼠脑切片中检测前体mRNA可变剪接模式的原位杂交（ISH）方案。

利用RNA对小鼠脑切片中pre-mRNA选择性剪接进行定量分析 原位 杂交实验

可变剪接（AS）发生在超过90%的人类基因中。可变剪接外显子的表达模式通常以细胞特异性的方式受到调控……

该方法有助于解答可变前体mRNA剪接领域的关键问题。具体而言，它提供了一种稳健且灵敏的检测系统，用于在组织切片中原位检测可变剪接模式。利用该方法，可在包含于复杂生物结构（如小鼠脑组织）中的多种亚型中同时分析可变剪接事件。该技术的主要优势在于利用针对mRNA原位杂交的抗静电冲击外显子连接探针，产生特定剪接异构体的杂交信号。通过构建信号放大技术，提高了检测灵敏度，从而获得稳定的杂交信号。所检测到的信号来自外显子包含区域，利用特异性探针可计算小鼠脑部不同解剖区域中剪接事件在体内的百分比。本研究以 NF1 基因的第 23a 外显子为例，说明该检测系统的使用方法。然而，该系统也可适用于分析多种可变外显子的表达模式。开始小鼠脑组织切片 D 的脱蜡时，用 250 毫升二甲苯填充两个洗涤皿。另取两个装有250毫升100%乙醇的容器置于通风橱中。将组织切片插入清洗架中。随后，将清洗架放入盛有二甲苯的容器中，孵育5分钟，期间上下移动清洗架至少3次，并用第二个二甲苯容器重复此步骤。然后将架子放入盛有乙醇的培养皿中，以相同的上下运动方式孵育两分钟，随后用第二个乙醇培养皿重复此步骤。为干燥载玻片，将架子从第二个乙醇培养皿中取出，放入60摄氏度的培养箱中干燥五分钟。使用疏水屏障笔在组织切片周围画一个0.75英寸×0.75英寸的屏障，室温下空气干燥三分钟。打开杂交炉并将温度设置为40摄氏度。用蒸馏水彻底浸湿加湿纸后，将其放入湿度控制托盘中。然后将湿度控制托盘插入杂交炉内。将干燥的载玻片放置于实验台上后，每张载玻片上的组织切片完全覆盖5至8滴过氧化氢溶液。室温孵育10分钟。逐张将载玻片在吸水纸上轻拍，以去除过氧化氢溶液，随后将载玻片插入洗涤架中。将载片架浸入盛有水的洗涤皿中，上下移动3到5次以清洗载片。取一个1升的玻璃烧杯置于加热板上，加入700毫升1倍浓度的目标去除液，并用铝箔覆盖。将温度计穿过铝箔插入烧杯中，打开加热板，调至高温加热10到15分钟。当修复液温度升至98摄氏度时，将加热板调至低温以维持轻微沸腾状态。随后，小心移去锡箔，将染色架放入烧杯中。用锡箔覆盖烧杯，并孵育15分钟。使用镊子将架子从烧杯转移至含有 200 毫升蒸馏水的洗涤皿中，孵育 15 秒。15 秒后，将架子放入含有 100% 乙醇的洗涤皿中，孵育 3 分钟。将架子从皿中取出，并在 60 摄氏度下干燥 10 分钟。将切片放置于染色架上后，每张切片覆盖五滴蛋白酶3。小心将染色架放入湿度控制盘中，并将盘子放入杂交炉内，在40摄氏度下孵育30分钟。从盘中取出染色架后，轻敲切片以去除多余液体，随后将其插入洗涤架中。将支架放入盛有蒸馏水的洗涤皿中，上下移动3至5次，以清洗载玻片。为进行原位杂交，将探针和AMP试剂在室温下孵育30分钟。将湿度控制托盘插入杂交炉中，并设定温度为40摄氏度。进行探针杂交时，将载玻片从洗涤架上取下，并轻拍以去除多余液体。将载玻片放置在染色架上。用铅笔在载玻片上标记探针名称。将三张相邻切取的脑组织切片放在一起，用于与三种不同的神经纤维有丝分裂类型一探针进行杂交。由于存在多种不同的同工型特异性探针，我采用相邻切取的组织切片。这些切片在杂交、扩增和信号检测步骤中必须完全一致地处理，以确保剪接百分比计算的准确性。每个组织切片上滴加四滴探针，一次处理一张载玻片，以防止切片干燥。然后将染色架放入湿度控制盘中，并置于40摄氏度的烘箱内孵育两小时。接着，在一个盛有200毫升1X洗涤缓冲液的洗涤皿中放入洗涤架。然后依次将每张载玻片在纸巾上轻拍，以去除多余的液体，并立即将每张载玻片插入洗涤架中。将装有新鲜洗涤缓冲液的培养皿置于室温下，将架体上下移动3至5次，孵育2分钟，然后在新的培养皿中重复洗涤一次。为了信号扩增，轻敲每张载玻片以去除多余的洗涤缓冲液，并将其放置在染色架上。在每张载玻片的组织切片上覆盖四滴AMP零试剂。接着，将染色架放入湿度控制盘中，将盘子放入烘箱，在40摄氏度下孵育30分钟。用洗涤缓冲液将玻片洗涤两次，操作方法与本实验之前步骤相同。按照文本方案中的描述，使用AMP试剂一至六重复信号放大步骤，并在每一步之后洗涤玻片。进行信号检测时，轻敲玻片以去除多余的洗涤缓冲液，然后将其放置在染色架上。接下来，在微量离心管中将两微升快红B与120微升快红A混合。将混合液加入每张载玻片上的组织切片，使其完全覆盖。将染色架放入湿度控制盘中，盖上盖子，在室温下孵育10分钟。然后移除溶液，将玻片插入清洗架中。将清洗架放入盛有自来水的清洗皿中清洗玻片，并重复清洗一次。第二次清洗后，轻敲吸水纸以去除多余的水分。接下来，将架子放入含有50%苏木精染色液的染色缸中，上下移动数次，然后在室温下孵育两分钟。将染色架转移至含有自来水的清洗皿中。上下移动染色架5次，并重复清洗直至载玻片变得透明，而组织切片仍保持紫色。然后将染色架转移至含有0.02%氨水的器皿中。上下移动载架两到四次，直至切片变为蓝色。在染色缸中用自来水冲洗载片三到五次。接着，将载架放入孵育箱中，在60摄氏度下孵育15分钟以干燥载片。完全干燥后，在每张载玻片上滴加一滴封片剂以覆盖组织切片。然后，小心地将一块24 × 50毫米的盖玻片盖在每张载玻片的组织切片上。室温下静置空气干燥30分钟后，即可进行数据采集。为了计算外显子23a的可变剪接百分比（PSI值），需对大脑皮层的三个亚区以及海马CA3区域中的细胞数量和点状信号数量进行计数。使用三种不同的NF1特异性探针，在CD1野生型小鼠的脑切片上进行RNA原位杂交实验。在皮层和海马切片中观察到的红色点状信号，分别代表NF1全长探针、包含特异性探针对应的阳性信号以及跳过特异性探针对应的阳性信号。随后对三个探针的ISH信号进行计数，并用于计算PSI。在C57 black 6J野生型小鼠和C57 black 6J突变型小鼠的皮层中进行RNA原位杂交实验，其中突变型小鼠在所有细胞类型中均包含外显子23a。在C57 black 6J野生型小鼠皮层中观察到的红色点状斑点，表明NF1总探针、包含特异性探针和跳跃特异性探针均产生阳性信号。在 C57 黑色 6J 突变小鼠中，NF1 全长探针和包含特异性探针获得的信号相似。然而，当使用跳跃特异性探针时未检测到信号，表明靶向外显子包含或跳跃的两个探针均具有高度特异性。由于目前该实验程序尚无法在同一组织切片上进行多色标记，因此在不同组织切片上使用不同的探针。为了获得准确的剪接百分比值，重要的是使用相邻切下的切片，并在整个过程中以完全相同的方式处理切片。此外，还可结合免疫组织化学等方法，以进一步探究差异表达剪接异构体的定位和功能等相关问题。

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科研

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Genetics

遗传学

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由于前体mRNA具有瞬时性，因此难以分离和研究 体内.  此处，我们介绍一种新型的 体外...

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使用寡核苷酸探针进行原位杂交研究大鼠脑切片中的RNA表达

来源：Jolly, S.，等．在小鼠脑切片中联合使用双重荧光原位杂交与免疫标记检测三个基因的表达．J. Vis. Exp.

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小鼠胚胎干细胞中基因间/基因内增强子RNA定量的计算分析流程

学习使用短反义寡核苷酸探针在小鼠脑切片中进行RNA原位杂交，定量分析替代前mRNA剪接模式。该方法结合信号放大技术，可同时检测多种剪接亚型，为神经科学研究提供高灵敏度工具。

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