一种用于人体脂肪的微生理平台：夹心式白色脂肪组织

这一突破性方法首次使我们能够在体外连续数周保持脂肪组织的存活与健康，从而用于脂肪生物学的研究。该技术的主要优势在于，组织在培养过程中可保持超过八周的稳定性，同时重现了包括周围天然脂肪基质支持细胞在内的脂肪微环境。首先，将ASC以约80%的融合度接种于组织培养板中。

对于每个所需的SWAT孔，分别在常规组织培养板上接种一个孔，并在相应尺寸的PNIPAAm包被的组织培养塑料板上接种一个孔。将ASC在37摄氏度、5% CO2条件下，使用完全培养基培养6至8天，每两天更换一次培养基。在进行SWAT接种前24小时，用实验室胶带将SWAT接种装置每个冲头的冲头盘边缘至少缠绕两圈，以防止明胶溶液泄漏。

在经过乙醇消毒的生物安全柜中，使用70%乙醇喷洒装有未加盖空15毫升锥形管的锥形管架，以及每个用胶带包裹的推杆，每消毒一个推杆后立即将其放入一个空管中。喷洒约6.3克金属垫圈，并将其与一对带钩镊子一同放置在管架上。然后关闭生物安全柜的窗板，打开紫外灯，以促进播种装置材料过夜干燥和灭菌。

当细胞达到100%融合度并呈现条纹状时，将0.75克明胶粉末加入10毫升HBSS中，并用100微升氢氧化钠调节溶液pH值。将明胶置于75摄氏度水浴中，每5分钟剧烈振荡试管一次，直至粉末完全溶解。

使用注射器滤器过滤均质的明胶溶液，并将明胶涂布于柱塞上。柱塞上贴有胶带的边缘将作为模具，使明胶在凝固过程中定型。待明胶完全凝固后，撕去胶带，用带钩镊子小心地从柱塞外缘移除明胶，注意保持柱塞中心区域残留的明胶表面完全水平，以最大化其与ASC膜片的接触面积。

将明胶从所有活塞上移除后，使用金属垫圈压住活塞，将其轻轻贴合到经PNIPAAm包被的ASC板上。在室温下孵育1.5小时后，将板转移至冰水浴中继续孵育1.5小时，以完成细胞片从PNIPAAm包被板表面的解离。随后，清洗PNIPAAm包被板的底部，去除任何非无菌水。

收到人脂肪组织后，为每个待接种的培养物向一个1.5毫升微量离心管中加入冷的细胞培养基。将脂肪组织的大块片段用无菌PBS洗涤三次，每次洗涤之间尽可能去除PBS。最后一次洗涤后，使用镊子和无菌剃刀将组织粗略剪碎，尽可能去除血管和筋膜，直至溶液呈黏稠液体状，且肉眼可见的白色脂肪组织片段尽可能少。

当达到适当的组织稠度后，使用经过改造的 P1000 微量移液器吸头，将适量的剪碎组织转移至每个预先准备好的 1.5 毫升离心管中，并轻轻混匀管内的组织碎块与培养基。接着，将每个 ASC 培养物中的培养基更换为等体积的白色脂肪组织溶液，并轻柔地将明胶推杆转移至基础 ASC 培养板中的白色脂肪组织混合液中。在显微镜下观察 PNIPAAm 涂层培养板中的单层细胞，确认细胞脱离情况，随后将培养板移至生物安全柜内 37 至 40 摄氏度的加热块表面。

然后加入 2 至 3 毫升预热的培养基，以孵育细胞并促进明胶融化。30 分钟后，轻轻将活塞从培养板表面移除，用相应的培养板盖盖住培养物，并将培养板放入细胞培养箱中。当明胶完全液化后，吸除培养基，并更换为适量的不含酚红的 M199 培养基，该培养基需添加胰岛素、地塞米松和抗生素。

经过7.5周的培养，SWAT细胞簇仍牢固地附着在单层细胞上，仅观察到个别脂肪细胞出现轻微的形态学变化。培养两周时，通过尼罗红染色清晰显示单房性脂肪细胞簇，证明这些细胞确实是具有完整细胞膜的脂肪细胞，而非人为假象、囊肿或死亡的脂肪细胞。对培养53天的SWAT进行碘化丙啶染色，以及对培养51天的SWAT进行油红O染色，结果均证实脂肪细胞即使在较晚期的时间点仍保持活性。

免疫细胞化学结果显示，SWAT中的成熟脂肪细胞标志物具有预期的蛋白质表达和定位，定量PCR表明关键脂肪细胞基因在转录水平表达。对SWAT培养物基础内分泌功能的评估显示，通过ELISA检测到其分泌瘦素；此外，在化学刺激下可诱导甘油释放。将SWAT培养的脂肪细胞进行异种移植后，移植10天即可观察到清晰可见且易于回收的脂肪沉积物，这些沉积物可被人类脂肪细胞标志物染色，但不被小鼠脂肪细胞标志物染色。

一旦掌握，该技术若操作得当，约需五小时即可完成。需要注意的是，应尽快处理原代组织，以尽量减少细胞死亡。在完成该操作后，还可进行其他方法，如实时定量 PCR、免疫染色或功能检测，以进一步探究脂肪细胞对各种药物或毒素的反应机制。

观看本视频后，您应能够充分理解如何开展SWAT培养，将其作为脂肪组织研究中稳定且可靠的平台。请务必注意，操作原代人体组织可能存在潜在危险，因此在进行该实验操作时，应始终采取相应预防措施，例如穿戴适当的个人防护装备（PPE），并在生物安全柜内处理组织样本。