Name: 成像 FITC-葡聚糖作为胞吐作用调节的记者 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: 了解使用FITC-葡聚糖作为报告分子进行活细胞成像以区分调节性胞吐作用模式的方法。该技术操作简单、对细胞干扰小，适用于肥大细胞及其他分泌细胞的研究。

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我们感谢U. Ashery博士慷慨赠送cDNA。我们感谢G. Mass博士、L. Mittleman博士、M. Shaharbani博士和Y. Zilberstein博士 &#160;萨克勒&#160;细胞的 &amp;#38; 分子影像中心在显微镜技术方面提供的宝贵协助。&#160;本工作由美国-以色列双边科学基金会（资助号 2013263，授予 R. Sagi-Eisenberg、I. Hammel 和 S.J. Galli）、以色列科学基金会（由以色列科学院创立，资助号 933/15，授予 R. Sagi-Eisenberg）以及美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 U19 AI 104209 和 R01 AR067145（授予 S.J. Galli）提供支持。

1. 准备工作
<ol>
	<li>制备 RBL 培养基
	<ol>
		<li>将 500 mL 低葡萄糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）与 56 mL 胎牛血清（FBS）、5.5 mL 青霉素-链霉素-制霉菌素溶液、5.5 mL 200 mM L-谷氨酰胺溶液混合。最终得到含 10% FBS、100 µg/mL 链霉素、100 单位/mL 青霉素、12 单位/mL 制霉菌素和 2 mM L-谷氨酰胺的低葡萄糖 DMEM 培养基。</li>
		<li>使用孔径为 0.22 µm 的真空滤器过滤培养基，并于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RBL 细胞的维持
	<ol>
		<li>在 10 cm 培养皿中将 RBL 细胞培养至最大 90% 汇合度。若细胞状态良好，应呈纺锤形，偶见突起。</li>
		<li>进行细胞传代时，吸除培养基，加入 2 mL 胰蛋白酶/EDTA 溶液 B，于 37 °C、5% CO2 的湿润环境中孵育 5–10 分钟。</li>
		<li>待细胞脱落后，用移液器加入 2 mL 培养基以中和胰蛋白酶，并按 1:2 至 1:10 的比例传代细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备 20 倍浓度 Tyrode 缓冲液
	<ol>
		<li>在双蒸水（DDW）中配制含 54 mM KCl、20 mM MgCl2、2.74 M NaCl 和 8 mM NaH2PO4 的 20 倍浓度储备液。充分混匀后于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 用于活细胞显微镜观察的 RBL 细胞培养
<ol>
	<li>制备 FITC-葡聚糖溶液。
	<ol>
		<li>每 1 mL 培养基中加入 1 mg FITC-葡聚糖粉末（150 K）混合。对于一个完整的带腔盖玻片，准备 3 mL。</li>
		<li>使用孔径为 0.22 µm 的醋酸纤维素注射器滤器过滤已溶解的 FITC-葡聚糖溶液。</li>
		<li>加入小鼠 IgE，使其终浓度为 1 µg/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于成像的 RBL 细胞接种
	<ol>
		<li>成像前一天，吸除培养皿中的培养基，并加入 2 mL 胰蛋白酶/EDTA 溶液 B。在 37 °C、含 5% CO2 的湿润环境中孵育 5–10 分钟。待细胞脱落后，加入 2 mL 培养基以中和胰蛋白酶活性。</li>
		<li>使用血细胞计数板对 RBL 细胞进行计数，并根据需要加入培养基调整体积，使细胞浓度达到 7.5 x 105/mL。</li>
		<li>向已预先加入新鲜含 FITC-葡聚糖的培养基的带腔盖玻片中加入 10 µL 细胞悬液（此操作可在每个腔室中接种 7.5 x 103 个细胞）。</li>
		<li>将 RBL 细胞在 37 °C、含 5% CO2 的湿润环境中培养过夜。细胞应保持在亚融合状态，以确保细胞彼此分离，便于在显微镜下单独识别每个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RBL 细胞转染——可选步骤。
	<ol>
		<li>如需对胞吐事件与其他荧光标记蛋白联合成像，请参见 Azouz et al.67 中关于 RBL 细胞的转染方案。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 胞吐作用的活细胞显微观察
<ol>
	<li>溶液的配制：
	<ol>
		<li>通过将储备液以1:20的比例稀释于去离子水（DDW）中，配制终浓度的Tyrode缓冲液，并添加20 mM Hepes（pH 7）、1.8 mM CaCl2、1 mg/mL BSA和5.6 mM葡萄糖。</li>
		<li>在Tyrode缓冲液中新鲜配制20倍浓度的促分泌试剂[以本实验为例，含1 µg/mL二硝基苯酚偶联人血清白蛋白（DNP-HAS (Ag)），对应1倍浓度为50 ng/mL]。</li>
		<li>将粉末溶于Tyrode缓冲液中，配制400 mM氯化铵溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞的准备。
	<ol>
		<li>用移液器吸去腔室盖玻片中的培养基，并用300 µL预热至37 °C的Tyrode缓冲液冲洗腔室3次。最后，向腔室中补充300 µL预热至37 °C的Tyrode缓冲液。</li>
		<li>将腔室盖玻片放入显微镜的培养箱腔室内，确保腔室稳定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显微镜的设置
	<ol>
		<li>为选择待追踪的兴趣区域，打开荧光光源（传统上使用汞灯），并选择合适的荧光滤光片（观察FITC-葡聚糖时应选择绿色荧光染料对应的滤光片）。当兴趣区域处于焦平面且位于视野中央后，关闭光源以避免光漂白和光毒性。 
		注意：部分细胞内摄入的FITC-葡聚糖可能仍保留荧光信号，这是因为FITC-葡聚糖也可能被分选至溶酶体以外的区室，如内体。</li>
		<li>开启适合FITC激发的照明光源。若使用激光显微镜，则打开488 nm激光器。发射光应收集在500 – 550 nm范围内（FITC的发射峰位于510 – 520 nm）。</li>
		<li>使用共聚焦显微镜时，将针孔开至最大。这有助于降低激光功率，避免光漂白和光毒性，同时确保能够捕捉到细胞所有焦平面上的胞吐事件。</li>
		<li>校准图像采集之间的时间间隔。
		<ol>
			<li>不同细胞在调控性胞吐的动力学上可能存在差异68。针对复合胞吐的特异性成像，建议时间间隔至少为5秒。但一般而言，为实现快速成像，应确保单帧图像的采集时间尽可能短。</li>
			<li>使用激光扫描共聚焦显微镜时，设置扫描方向为双向扫描，不启用平均扫描，分辨率设为512 × 512（推荐设置；后两项设置也有助于最小化光漂白和光毒性）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胞吐过程的成像。
	<ol>
		<li>根据细胞类型或促分泌剂的不同，对细胞进行相应时长的成像。在IgE/Ag激活的RBL细胞中，大多数胞吐事件发生在激活后15 – 20分钟内。</li>
		<li>为激活细胞，向腔室中加入16 µL的20倍浓度促分泌剂溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确认细胞内FITC-葡聚糖的存在。
	<ol>
		<li>为确认FITC-葡聚糖在分泌颗粒（SGs）中的存在及其定位，轻轻向腔室中加入16 µL氯化铵溶液（注意不要移动腔室，以免失焦），最终浓度为20 mM。这将引起分泌颗粒的碱化，从而解除FITC荧光的淬灭，该过程在数秒内即可发生。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无竞争性财务利益

本文介绍了如何通过追踪加载到分泌颗粒（SGs）中的FITC-葡聚糖的荧光，特异性地捕捉复合型胞吐事件。该方法通过设置显微镜每15秒采集一次图像，确保仅记录持续时间较长的事件，从而排除对应于完全胞吐或“亲吻即走”（kiss-and-run）胞吐的短暂事件。为验证该方法，我们证明了在RBL细胞中表达且对复合型胞吐至关重要的Rab5亚型被敲低后，无法再捕获到FITC-葡聚糖释放的事件，而细胞的整体分泌能力并未受到影响。
该方法最显著的缺点是仅适用于含有酸性分泌颗粒（SGs）的细胞。然而，该方法最突出的优点是仅需将细胞与FITC-葡聚糖进行简单孵育，无需转染操作。其他用于研究调控性胞吐作用的pH敏感报告分子，通常涉及与囊泡内货物蛋白或SG膜蛋白融合的荧光素（phlourin）——一种pH敏感型GFP变体（如NPY-phlourin、β-己糖胺酶-phlourin和synapto-phluorin48,49,50</s...

调节性胞吐是分泌细胞在特定刺激下释放预先合成货物的主要机制。这些货物预先形成并被隔离于分泌囊泡中，在刺激传递释放信号之前一直储存于其中，以待分泌。不同类型的信号可能引发不同模式的调节性胞吐，或多种调节性胞吐模式可同时发生。目前已知三种主要的调节性胞吐模式：全融合胞吐，即单个分泌颗粒与质膜完全融合；“亲吻-逃逸”式胞吐，即分泌颗粒与质膜发生瞬时融合后随即被回收；以及复合性胞吐，其特征是在与质膜融合之前（即多颗粒胞吐）或融合过程中（即顺序性胞吐）发生多个分泌颗粒之间的同型融合1。复合性胞吐被认为是货物释放最广泛的模式2，因为它能够快速释放内容物，包括那些位于远离质膜位置的分泌颗粒中的物质。复合性胞吐已在外分泌细胞和内分泌细胞3,4,5,6,7,8,9以及免疫细胞中被观察到。在嗜酸性粒细胞10,11,12和中性粒细胞13等免疫细胞中，复合性胞吐可实现快速而强烈地释放效应分子，以清除入侵的病原体（如细菌或寄生虫）。肥大细胞（MCs）利用复合性胞吐在固有免疫反应、过敏性休克&#160;及其他过敏反应中高效释放预先储存的炎症介质14,15,16,17。由于不同胞吐模式可能同时发生18,19，因此在实时条件下区分它们，或识别其各自的融合机制，已成为研究其潜在机制的一大挑战。
本文介绍了一种基于活细胞成像的方法，通过将FITC-葡聚糖加载到细胞中，可实时追踪胞吐事件，并区分其不同模式。特别是，该方法能够特异性地监测复合型胞吐作用。
FITC-葡聚糖是pH敏感性荧光素FITC与葡聚糖多糖的偶联物。已有研究表明，荧光标记的葡聚糖可通过小胞饮作用20,21和大胞饮作用22,23进入细胞。随着内吞囊泡逐渐成熟为溶酶体，FITC-葡聚糖被发现可在溶酶体内蓄积且无明显降解。然而，由于FITC是一种高度pH敏感的荧光基团24，而溶酶体腔呈酸性，因此当FITC-葡聚糖到达溶酶体时，其荧光会发生淬灭24。因此，将葡聚糖确立为靶向溶酶体的运输货物，结合FITC的pH敏感性，为FITC-葡聚糖在溶酶体外排研究中的应用奠定了基础25,26,27,28,29。
在多种细胞类型中，包括肥大细胞（MCs）、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、细胞毒性T细胞、黑色素体等，分泌颗粒（SGs）表现出溶酶体的特征，被归类为溶酶体相关细胞器（LROs）或分泌性溶酶体30,31。由于LROs具有酸性的腔内pH值，FITC-葡聚糖可用于可视化其胞吐过程，这是因为LROs外排后所处环境的pH升高。事实上，FITC-葡聚糖已被用于监测肥大细胞中的胞吐作用18,32,33。在该方法中，将FITC-葡聚糖加入细胞培养体系，细胞通过胞饮作用将其摄入并分选至分泌颗粒中。当其位于细胞内时，由于处于类似溶酶体的酸性环境中，FITC的荧光被淬灭。然而，当分泌颗粒与质膜融合并暴露于细胞外环境时，颗粒内pH上升，FITC-葡聚糖恢复荧光，从而可通过活细胞显微镜简单地追踪胞吐事件。本文中，我们对该方法进行了优化，以实现对复合型胞吐过程的特异性追踪。
此前已有另外两种方法用于追踪复合型胞吐作用。电子显微镜是首个用于表征胞吐结构并提示存在不同胞吐模式的方法。特别是，在胰腺腺泡细胞34以及肥大细胞（MCs）35,36,37中观察到&#34;分泌通道&#34;的现象，由此提出了复合型胞吐的假说。然而，尽管电子显微镜具有高分辨率，能够揭示融合的囊泡结构，但它无法追踪这些囊泡融合的动态过程，因此无法确定所观察到的结构是对应于复合型胞吐过程中的分泌颗粒（SG）融合，还是胞吐后颗粒被内吞再回收过程中发生的融合。这一局限性可通过其他可在活细胞中测量胞吐作用的技术加以克服，例如全细胞膜电容的膜片钳记录11,13,38,39或对释放介质进行安培法检测40。然而，膜片钳技术需要特殊的实验装置，且可能不适用于所有类型的细胞。安培法检测仅在被释放的 cargo 物质非常接近电极时才能有效追踪胞吐事件。因此，活细胞成像技术相较于这些方法具有优势，因为它不仅能够实现实时追踪胞吐过程，还能快速、简便地获取整个细胞的实验数据。
通过活细胞显微镜追踪FITC-葡聚糖相较于其他基于活细胞成像的方法具有一些优势。例如，一种广泛应用的方法是全内反射荧光显微镜（TIRFM），用于观察载有荧光SG探针或表达荧光蛋白标记的SG货物或膜蛋白的细胞26,41,42,43。该方法的优势在于能够特异性监测紧邻质膜（本文中称为“贴壁区域”）发生的事件，即胞吐事件。然而，这同时也是该方法的局限性，因为仅能对紧贴盖玻片且靠近显微镜物镜的细胞部分进行成像44。此类贴壁区域是否真正代表整个细胞膜表面，目前仍有争议45,46,47。在这方面，使用pH敏感性染料（如FITC-葡聚糖）结合标准荧光显微镜或针孔开放的共聚焦显微镜，可实现对整个细胞的成像，从而捕捉该细胞中发生的全部胞吐事件。
用于通过全细胞成像或全内反射荧光显微镜（TIRFM）研究调控性胞吐作用的其他pH敏感报告分子包括与phlourin（一种pH敏感型GFP变体）融合的分泌颗粒（SG）内容物或SG膜蛋白。实例包括NPY-phlourin、β-hexoseaminidase-phlourin和synapto-phluorin48,49,50,51,52。尽管这些探针的表达可能更接近分泌颗粒的内源组成，但其需要转染细胞，因此可能不适用于难以转染的细胞类型。因此，在研究难以转染的细胞或在需要多种基因操作的实验条件下，使用可直接添加至细胞培养基中的化合物（如FITC-dextran）具有优势。与另一种曾用于活细胞显微镜下追踪胞吐过程的pH敏感性染料吖啶橙（acridine orange, AO）相比，FITC-dextran也具有优势53,54,55,56,57,58。研究表明，AO可诱导囊泡发生光解，产生并不对应实际分泌过程的假性闪光信号27。相比之下，FITC-dextran能更真实地反映分泌事件，这可能归因于其光诱导产生的活性氧水平较低27。
值得注意的是，研究胞吐作用的另一种方法是通过追踪染料从外部培养基经由融合孔进入分泌颗粒（SG）的过程，该融合孔在胞吐过程中开放。在此方法中，将染料与分泌刺激物一同加入外部培养基中。当融合孔开放时，染料即扩散进入分泌颗粒59,60。该方法的一个显著优势在于，可通过使用不同尺寸的染料来估算融合孔的大小。例如，可使用不同分子量（MW）且连接不同荧光染料的葡聚糖作为细胞外染料，能够进入分泌颗粒的最大尺寸葡聚糖即对应融合孔的大小59,61,62,63,64。此外，该方法无需使用pH敏感探针。然而，其显著缺点是信噪比非常低，因为在图像采集过程中，培养基中含有大量染料，导致背景信号过高。
总体而言，使用FITC-葡聚糖作为胞吐作用的标记物克服了以往报道方法中的多个缺点，例如信噪比、毒性、动态追踪以及操作复杂性。
本文描述了使用FITC-葡聚糖来监测RBL-2H3肥大细胞系（以下简称RBL，最初由Eccleston et al.65建立，并由Barsumian et al.66进一步克隆）在免疫球蛋白E（IgE）/抗原（Ag）激活条件下的化合物胞吐作用。

<table><tbody><tr><td>DMEM低糖培养基</td><td>Biological Inducties</td><td>01-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>12657</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-制霉菌素溶液</td><td>Biological Inducties</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM 溶液&amp;nbsp;</td><td>Biological Inducties</td><td>03-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记葡聚糖 150K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46946-500MG-F</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA溶液B</td><td>Biological Inducties</td><td>03-052-1A</td><td>使用前于37 &amp;deg;C水浴中预热</td></tr><tr><td>顶部抽真空式0.22 &amp;micro;m孔径滤器&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430769-1EA</td><td></td></tr><tr><td>醋酸纤维素注射器滤器，0.22 &amp;micro;m孔径</td><td>Sartorius</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>带腔室盖玻片&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Corning组织培养处理培养皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>抗DNP单克隆IgE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8406</td><td></td></tr><tr><td>DNP-HSA（抗原）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6661&amp;nbsp;</td><td>避免直接光照</td></tr><tr><td>HEPES缓冲液 1M，pH 7.4</td><td>Biological Inducties</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>MERK</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>BDH Laboratories</td><td>284515V</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>MERK</td><td>1145</td><td></td></tr><tr><td>PIPES二钾盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108321-27-3</td><td></td></tr><tr><td>醋酸钙水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114460-21-8</td><td></td></tr><tr><td>四水合醋酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸钾（L-谷氨酸钾盐一水合物）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>MERK</td><td>6346</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>MERK</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>MERK</td><td>105833</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MERK</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔仪&amp;nbsp;</td><td>BTX</td><td>ECM830</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜，Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>LSM 5 Pascal, Axiovert 200M</td><td>用于图3。配备电子温控&lt;br/&gt; 气流培养箱</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜，Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800, Axio Observer.Z1 /7</td><td>用于图2。配备GaAsP检测器和电子温控&lt;br/&gt; 气流培养箱</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜，Leica</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td>用于图1。配备Leica HyD检测器和顶置式培养箱（Okolab）</td></tr><tr><td>RBL-2H3细胞</td><td></td><td></td><td>RBL-2H3细胞由Reuben P. Siraganian实验室构建。参见参考文献67</td></tr></tbody></table>

成像fitc-葡聚糖作为调控性胞吐作用的报告分子

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

调节性胞吐是一种通过分泌囊泡（SGs）储存的货物在分泌刺激信号作用下被释放的过程。调节性胞吐是细胞间通讯的基础，也是多种细胞分泌神经递质、激素、炎症介质及其他化合物的关键机制。目前已知至少存在三种不同的调节性胞吐机制：全融合胞吐，即单个分泌囊泡与质膜完全融合；亲吻式胞吐，即单个分泌囊泡与质膜发生瞬时融合；以及复合型胞吐，即多个分泌囊泡在与质膜融合之前或之后彼此融合。细胞所采用的调节性胞吐类型通常由分泌刺激的类型决定。然而，在许多细胞中，单一的分泌刺激可同时激活多种调节性胞吐模式。尽管调节性胞吐在不同细胞类型和物种中广泛存在且具有重要功能，但决定不同分泌模式的机制在很大程度上仍未明确。研究调节性胞吐不同模式的主要挑战之一，在于难以区分这些模式并对其进行独立探究。本文介绍使用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的葡聚糖作为胞吐报告分子，并结合活细胞成像技术，根据胞吐事件的强度和持续时间，区分调节性胞吐的不同途径，重点聚焦于复合型胞吐过程。

图1a 示意性地展示了FITC-葡聚糖如何作为调节性胞吐作用的报告分子，并重现不同类型的胞吐事件。首先，细胞与FITC-葡聚糖共孵育，后者通过胞饮作用被内化并分选至分泌颗粒（SGs）。由于肥大细胞（MCs）的分泌颗粒属于溶酶体相关细胞器（LROs），其内部低pH环境会抑制FITC的荧光，因此在图中表现为黑色颗粒（A-C，I）。当细胞受到分泌刺激剂触发，分泌颗粒与质膜融合，形成融合孔，质子外流导致分泌颗粒内部碱化。因此，FITC恢复其荧光信号（A，II）。在完全胞吐过程中，分泌颗粒膜完全塌陷并融入质膜，FITC-葡聚糖迅速扩散至培养基中，表现为持续时间较短（小于5秒）的荧光事件（A，III）。在“亲吻即走”（kiss-and-run）型胞吐事件中，分泌颗粒膜仅瞬时与质膜融合，形成短暂存在的融合孔，因此仅出现短暂的荧光爆发；随后分泌颗粒迅速脱离，其腔内快速重新酸化，荧光随之消失（B，III-IV）。最后，在复合型胞吐过程中，一系列分泌颗粒依次相互融合（继发性颗粒融合）并同时与质膜融合，且融合孔保持开放状态。结果导致更...

本文详细介绍了一种用于活细胞成像检测调控性胞吐作用的方法。该方法利用可积聚于溶酶体相关细胞器中的异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-dextran）作为报告分子。这一简便的方法还可用于区分难以进行遗传操作的细胞中不同模式的调控性胞吐作用。

成像FITC-葡聚糖作为调控性胞吐作用的报告分子

调节性胞吐是一种在分泌触发信号作用下，将储存于分泌颗粒（SGs）中的货物分子释放出来的过程。调节性...

该方法可通过使研究人员能够区分活细胞中不同的胞吐模式，从而帮助解答调控性胞吐研究中的关键问题。该技术的主要优势在于操作简便，且对细胞的干扰极小。尽管该方法可为肥大细胞的胞吐过程提供见解，但也可应用于其他分泌细胞，如中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。首先，根据文本方案配制 20 倍浓度的 Tyrode's 缓冲液储备液。接着，将 3 毫克 FITC-葡聚糖粉末与 3 毫升培养基混合。使用醋酸纤维素注射器滤器对溶解的 FITC-葡聚糖进行过滤。然后，加入小鼠IgE，使其浓度达到每毫升1微克。成像前一天，吸出培养皿中的培养基，加入2毫升胰蛋白酶EDTA溶液B。随后，将培养皿孵育5至10分钟。待细胞脱落后，向培养皿中加入2毫升培养基以中和胰蛋白酶。然后，使用血细胞计数板对RBL细胞进行计数。用培养基调整细胞悬液体积，使细胞浓度达到每毫升750,000个细胞。接着，取10微升细胞悬液加入含有新鲜FITC-葡聚糖补充培养基的腔室盖玻片中，将RBL细胞在其中培养过夜。首先，根据文本方案配制终末的台罗德缓冲液。然后，用新配制的缓冲液配制20倍分泌刺激剂试剂。将氯化铵粉末溶解于台罗德缓冲液中，制备400毫摩尔的氯化铵溶液。接下来，吸出腔室盖玻片中的培养基，加入 300 微升预热的台罗德缓冲液。重复洗涤过程两次后，向腔室中补充 300 微升台罗德缓冲液。随后，将带腔室的盖玻片放入显微镜的培养箱腔室内，并确保腔室稳定。打开荧光光源并选择合适的荧光滤光片。当目标区域位于视野中央且聚焦清晰后，关闭光源。随后，开启488纳米激光器，并收集约500至550纳米波长范围内的发射光。接下来，校准图像采集之间的时间间隔。将扫描方向设置为双向，不进行平均处理，打开针孔，并将分辨率为512×512。随后，根据特定细胞类型或分泌刺激剂的要求，对细胞进行适当持续时间的成像。然后向腔室中加入16 µL分泌刺激溶液，并继续拍摄。最后，为确认FITC-葡聚糖存在于分泌颗粒中的位置，轻柔地向腔室中加入16 µL氯化铵溶液。在本方案中，FITC-葡聚糖被用作报告分子，用于活细胞成像中调控性胞吐作用的观察。成像FITC-葡聚糖的释放可捕捉化合物胞吐过程的时序性特征。在向培养基中加入氯化铵后，FITC-葡聚糖变得可见，并与标记mRFP的神经肽Y共定位，后者在RBL细胞中作为分泌颗粒的报告分子。在实施该操作时，需注意在成像过程中尽量减少激光对细胞的照射，以降低细胞毒性。这可以通过使用低激光功率和短的采集时间来实现。由于与其他类型的调控性胞吐事件相比，复合型胞吐事件持续时间更长，因此我们可以通过设置较长的采集时间间隔，明确地捕捉到复合型胞吐现象。

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成像 FITC-葡聚糖作为胞吐作用调节的记者

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本文介绍了一种利用突触小泡蛋白2-pHluorin构建体和全内反射荧光显微镜技术研究神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动态的方法。同时报道了图像处理与数据分析的策略。...

使用TIRFM和pH敏感型GFP探针评估SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动态：细胞成像与数据分析

我们介绍了一种通过与可使内吞细胞器产生通透性的试剂共孵育的简单方法，将蛋白质和细胞不可渗透的小分子递送至培养的哺乳动物细胞中。...

通过与内体裂解试剂dfTAT共孵育将蛋白质、多肽或细胞不可渗透的小分子递送至活细胞

利用对pH敏感的荧光蛋白——超 ecliptic...

利用pHluorin标记的受体监测亚细胞定位与转运

采用多孔微孔板的自动化检测方法具有显著优势，可通过单次实验评估多种条件，从而有效鉴定信号通路调控因子。本文中，我们将已建立的大胞饮囊泡成像与定量检测方案优化为适用于96孔微孔板的格式，并提供了利用多功能酶标仪进行自动化操作的全面流程说明。...

用于荧光标记巨胞饮体定量的自动化成像与分析

在本研究中，向小鼠给予荧光素异硫氰酸酯标记的（FITC）葡聚糖 通过 口服灌胃以评估肠道通透性 体内...

利用荧光素异硫氰酸酯标记的葡聚糖评估小鼠肠道屏障完整性

测量囊泡释放动力学的能力有助于深入了解神经传递的一些基本机制。在此，我们利用红色荧光染料FM...

使用FM染料标记法测量神经元中的胞吐作用

了解使用FITC-葡聚糖作为报告分子进行活细胞成像以区分调节性胞吐作用模式的方法。该技术操作简单、对细胞干扰小，适用于肥大细胞及其他分泌细胞的研究。

成像FITC-葡聚糖作为调控性胞吐作用的报告分子

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