Necroptosis MLKL 介导的血浆膜破裂特征
2018年8月7日
我们报告的方法, MLKL 介导的等离子膜破裂在 necroptosis 包括常规和共聚焦活细胞显微成像, 扫描电镜, 核磁共振基脂结合。
这些方法可以帮助回答有关假激酶混合谱系激酶结构域样或 MLKL 在坏死性凋亡中的作用的关键问题，例如脂质结合中的膜易位和透化。这些技术的主要优点是它们直接暗示 MLKL 是坏死性凋亡中质膜破裂的执行者。活细胞成像彻底改变了细胞死亡研究领域，尤其是对于 MLKL 介导的坏死性凋亡。
核磁共振是一种强大的技术，用于监测脂质与蛋白质的结合，如此处所示的 MLKL。首先将 5 次 10 至第四个 MLKL 敲除小鼠胚胎成纤维细胞或 MEF 接种，这些 MLKL 的执行结构域融合到寡聚化盒和 Venus 在 24 孔板中补充的 1 毫升 DMEM 中，用于它们在细胞培养箱中孵育过夜。第二天早上，用多西环素处理细胞 12 小时以诱导转基因的表达，然后添加补充有 FK506 结合蛋白二聚体和膜不渗透性绿色荧光染料的标准 DMEM 以诱导坏死性凋亡。
为了监测细胞死亡，将板放在哺乳动物组织培养箱中的适当成像装置中，然后打开成像系统软件。选择 Schedule Upcoming Scans 选项卡，然后在 Physical Layout 选项卡中选择托盘、容器、扫描类型和扫描模式。在 Properties 选项卡中选择 fast fluorescence ，然后单击 Timeline 窗口以及时间点总数和采集频率以添加扫描时间。
然后，单击 使用 开始图像采集。要量化坏死性凋亡，请选择 Tasks 窗格，然后将鼠标光标悬停在多个图像的背景上，以设置对象计数新分析，并在背景级别之上使用固定分割阈值。然后，选择 Previewing 以检查当前图像中的荧光对象，并根据需要优化阈值级别。
可以通过观察板上的多个孔并使用软件上的预览功能来仔细选择阈值。请注意，要对板中的所有孔使用相同的阈值设置。要整合绿色荧光计数，请在 Launch New Analysis 选项卡下选择时间范围和要分析的孔，然后输入分析任务名称。
然后，单击 Okay 并双击作业名称以导出数据，以便在适当的绘图软件程序中进行其他分析。对于通过核磁共振波谱或 NMR 对 MLKL 进行脂质结合，使用密封注射器将每毫升 1 毫克的目标磷脂分装到干净的玻璃样品瓶中，用于单独的 NMR 滴定系列，并将样品瓶置于氩气或氮气气流下 5 至 30 分钟。必须从保存在干冰上的库存中快速分配氯仿或甲醇等挥发性溶剂的脂质，以最大限度地减少由于溶剂蒸发而导致的样品间脂质浓度不一致。
在蒸发期结束时，使用大镊子将样品瓶排列在 Buchner 烧瓶底部。用橡胶塞密封烧瓶，并将连接到真空管路的塑料管连接起来，以便在温和的真空下过夜排空样品瓶内容物，以去除任何残留的有机物。第二天早上，向每个带有脂质膜的玻璃样品瓶中加入补充有适当实验浓度去污剂的 NMR 缓冲液，并在水浴中对样品瓶进行超声处理长达 30 分钟，每 10 分钟停止一次超声处理，以检查脂质膜的溶解度。
超声处理结束时，让样品瓶冷却 15 分钟，并在去污剂阳性 NMR 缓冲液中对脂质去污剂胶束进行连续稀释，以 1：1 的比例对混合物进行超声处理，以获得所需的浓度系列。分别在去污剂阴性和去污剂阳性 NMR 缓冲液中制备蛋白质和添加剂的对照和参考 NMR 样品，在去污剂阳性缓冲液中向每个脂质稀释液中添加蛋白质和添加剂。然后，将适当体积的样品转移到适当尺寸的 NMR 管中，并将样品加载到 NMR 仪器上。
在表达融合转基因的多西环素预孵育细胞二聚体介导的寡聚化后 1 小时内，可以观察到 MLKL 敲除 MEF 的完全坏死性凋亡。这种快速动力学坏死性凋亡支持 MLKL 作为质膜破裂的假定执行者的作用，导致在处理细胞外围的二聚体和维纳斯编码后一到两分钟内产生血浆膜相关的维纳斯点，并在两到三分钟内逐渐使细胞变圆。在快速坏死性凋亡下，细胞形态从正常的细长形状变为圆形和肿胀，在寡聚化后 5 分钟内发生，在 10 分钟时部分破裂，并在 20 分钟时用消失的胞质溶胶广泛分解。
通过 NMR 波谱监测的体外脂质结合实验揭示了脂质结合后 MLKL 执行结构域蛋白的主要结构变化，将抑制支撑区域从闭合的 N 螺旋置换到开放和固有无序的构象，以及两种构象异构体混合物的每残基信息。还可以监测给定样品中闭合和开放构象异构体的百分比，为 MLKL 执行结构域与磷脂的相互作用提供支持证据，并表明 MLKL 与质膜之间存在直接联系。因此，在尝试使用该程序定量细胞死亡时，重要的是要了解并记住 DNA 结合染料比正常基因编码的荧光蛋白具有更高的阈值荧光。
因此，它们可以并行使用。另请注意，胶束脂质对温度敏感，因此可能需要优化 NMR 样品温度。因此，在该程序之后，可以使用其他技术，如全内反射显微镜和电子显微镜，以解决细胞破裂在经历坏死性凋亡的细胞上发生的速度以及破裂位于质膜上的位置。
此外，可以进行微量热泳以正交验证 MLKL 与胶束脂质的结合。本视频中描述的技术为坏死性凋亡领域的研究人员探索 MLKL 作为质膜破裂执行者的作用铺平了道路。不要忘记，使用氯仿可能非常危险，并且在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套和在通风良好的地方工作。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本研究提出了表征坏死性细胞死亡过程中MLKL介导的质膜破裂的方法。技术包括活细胞显微镜、扫描电子显微镜和基于NMR的脂质结合分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 神经科学
- 细胞死亡机制
背景
- MLKL是一种涉及坏死性细胞死亡的假激酶。
- 理解MLKL在膜转位和通透化中的作用至关重要。
- 活细胞成像推进了细胞死亡的研究。
- NMR有效用于研究蛋白质-脂质相互作用。
研究目的
- 阐明MLKL在坏死性细胞死亡中的作用。
- 展示各种成像技术的有效性。
- 提供研究MLKL介导的膜破裂的协议。
使用的方法
- 常规和共聚焦活细胞显微镜成像。
- 扫描电子显微镜。
- 基于NMR的脂质结合分析。
- 涉及MLKL敲除小鼠胚胎成纤维细胞的细胞培养技术。
主要结果
- MLKL被认为是质膜破裂的执行者。
- 活细胞成像有效地捕捉了MLKL介导的坏死性细胞死亡。
- NMR成功监测了脂质与MLKL的结合。
- 该研究为进一步研究提供了详细的实验协议。
结论
- 所概述的方法对研究坏死性细胞死亡很有价值。
- MLKL作为膜破裂中的关键角色得到强化。
- 未来的研究可以在这些技术的基础上探索细胞死亡机制。
常见问题
Executive Industry Relevance
MLKL-mediated necroptosis represents a critical node in inflammatory cell death pathways relevant to autoimmunity, neurodegeneration, and oncology portfolios. Quantitative characterization of MLKL's membrane translocation and lipid binding enables mechanistic de-risking and target validation for therapeutic strategies modulating necroptosis. These methods provide predictive confidence for advancing discovery programs targeting regulated cell death.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Directly implicates MLKL as the executioner of plasma membrane rupture, clarifying pathway function.
- Enables mechanistic de-risking by visualizing MLKL redistribution and membrane permeabilization.
- Supports target validation through quantitative lipid-binding and conformational analysis.
Screening & Assay Development
- Establishes live-cell imaging and fluorescence quantification for robust necroptosis readouts.
- Standardizes segmentation thresholds and analysis pipelines for reproducible assay outputs.
- Facilitates screening of modulators affecting MLKL-lipid interactions and membrane rupture.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanistic findings with disease-relevant models of inflammatory cell death.
- Enables continuity from molecular mechanism to preclinical validation of necroptosis inhibitors or activators.
- Provides quantitative endpoints for translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
These protocols integrate from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and quantitative screening of necroptosis modulators.
- Discovery Biology: Enables direct testing of MLKL function and pathway engagement via imaging and NMR.
- Screening: Provides standardized, quantitative fluorescence and lipid-binding assays for compound evaluation.
- Analytics: Delivers per-residue conformational and binding data to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects mechanistic insights to disease models for risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Offers reusable imaging and NMR workflows for broader regulated cell death research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in necroptosis pathway targeting and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes imaging and NMR protocols for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for necroptosis-targeted assets and enhances capital efficiency.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of inflammatory and cell death pathway programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, fluorescence quantification, and NMR spectroscopy.
- Demands access to advanced microscopy and NMR instrumentation with analytical software.
- Necessitates cross-team standardization of segmentation thresholds and assay conditions.
- Adaptation may be needed for different cell types or lipid compositions.
- Temperature sensitivity and hazardous solvent handling must be managed per protocol guidance.
