Name: Necroptosis MLKL 介导的血浆膜破裂特征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 了解坏死性凋亡中MLKL介导的质膜破裂特征，利用活细胞显微镜、扫描电子显微镜和核磁共振脂质结合分析技术。该方法为研究细胞死亡机制提供了详细的实验方案。

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1. 克隆与细胞系构建
<ol>
	<li>从人 MLKL cDNA 中 PCR 扩增对应于氨基酸残基 1-140 的 NBB 区域（NBB140），用于与二聚化结构域 2x FK506 结合蛋白（2xFKBP 或 2xFV）及 Venus 荧光蛋白进行同框的标准限制性内切酶克隆，插入强力霉素（Dox）诱导型逆转录病毒载体 pRetroX-TRE3G 中，以获得 NBB140-2xFV-Venus（表 1，图 1A-B）。</li>
	<li>通过瞬时转染表达 SV40 大抗原的质粒，使来自 Green 实验室提供的相应小鼠的原代 mlkl-/- 或 ripk3-/- mlkl-/-&#160;小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）永生化。在约 1–2 周内筛选永生化细胞，并在 DMEM 培养基中培养，该培养基添加 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和链霉素、1 mM 丙酮酸钠及非必需氨基酸，在标准组织培养箱中 37 °C、5% CO2 条件下维持培养。</li>
	<li>用含有反向四环素控制的转录激活因子（rtTA）的逆转录病毒（该病毒由含杀稻瘟菌素抗性基因的质粒表达，即我们改造的质粒）转导 SV40 永生化的 mlkl-/- MEFs，并以 5 μg/mL 杀稻瘟菌素处理 1 周，以筛选稳定表达 rtTA28 的细胞。</li>
	<li>用含有嵌合型 MLKL 的 Dox 诱导型逆转录病毒载体（pRetroX-NBB140-2xFV-Venus-puro）转导表达 rtTA 的 MEFs，并在转导后 2 天开始使用 4 μg/mL 嘌呤霉素筛选 1 周。</li>
</ol>
2. MLKL介导的坏死性凋亡的活细胞显微成像
<ol>
	<li>培养皿 mlkl-/- 表达 NBB 的 MEFs140-2xFV-Venus，以每孔50,000个细胞的密度接种于24孔板中（每孔1 mL），过夜培养（图2A）。使用活细胞染色进行自动细胞计数（参见 材料表).</li>
	<li>用多西环素（Dox，0.5 μg/mL）处理细胞12小时，以诱导NBB的表达140-2xFV-Venus</li>
	<li>除使用25 nM FKBP二聚化剂（Dim）诱导坏死性凋亡外，还需&#160;25 nM 膜非通透性绿色荧光染料（参见 材料表在标准DMEM中（见1.2）。发生坏死性凋亡的细胞因质膜完整性受到NBB破坏而摄取染料140介导的破裂。实验需进行三到四次重复。</li>
	<li>使用单色或双色成像系统监测坏死性凋亡（参见 材料表），将容器置于哺乳动物组织培养孵育箱内相应的成像装置中。</li>
	<li>打开软件（参见 材料表）并在任务列表下选择“计划 upcoming 扫描”标签页。 
	注意: 本方案适用于单色成像系统，但也有类似的软件可供使用&#160;双色系统</li>
	<li>选择 &#34;托盘，容器，扫描类型&#34;，以及 &#34;扫描模式&#34; 在 &#34;物理布局&#34; 标签和 &#34;快速荧光&#34; 在“属性”选项卡中。</li>
	<li>加入 &#34;扫描时间&#34; 通过点击 &#34;时间线&#34; 窗口以及时间点总数和采集频率（通常每 0.5 小时至 1 小时采集一次，持续 6 小时至 12 小时，或每 5 分钟采集一次以监测快速动力学的坏死性凋亡），然后通过选择开始图像采集 &#34;应用&#34; （红色按钮）</li>
	<li>使用图像分析软件量化坏死性凋亡（参见 材料表) 通过从以下选项中选择 &#34;任务窗格&#34;, &#34;基于背景水平以上固定分割阈值的物体计数新分析&#34;，可通过将鼠标光标悬停在分析所用的多幅图像的背景区域上确定。</li>
	<li>通过选择使用当前图像进行预览来检查荧光物体，并根据需要调整阈值水平。</li>
	<li>通过打开整合绿色荧光计数&#160;的 &#34;启动新分析&#34; 选项卡，选择 &#34;时间范围&#34;，选择要分析的孔，输入 &#34;分析任务名称&#34;，然后按压 &#34;好的&#34;.</li>
	<li>从以下位置访问分析后的数据 &#34;分析任务&#34; 双击相应作业名称，然后在图形/导出窗口中导出，以便在外部绘图软件中进行进一步分析（参见 材料表).</li>
	<li>以每毫米绿色荧光阳性（+ve）计数定量数据2 或通过汇合度对计数进行归一化，并将数据表示为绿色荧光阳性细胞数/汇合度。</li>
	<li>可选步骤：在实验终点时，用 100 nM 的膜通透性绿色荧光染料对细胞进行染色（参见 材料表将数据归一化为坏死性凋亡细胞的百分比，即终点时绿色荧光值与绿色荧光值的比值。</li>
</ol>
3. MLKL 介导的细胞膜转位与通透化的活细胞共聚焦显微镜成像
<ol>
	<li>培养皿 mlkl-/- 表达 NBB 的 MEF 细胞140-2xFV-Venus，以每孔20,000个细胞的密度接种于经50 µg/mL纤连蛋白预处理的玻璃底4孔显微镜培养皿中（每孔0.5 mL）&#160;在37 °C的PBS中孵育30分钟，并继续孵育约12小时（图2B).</li>
	<li>用多西环素（Dox，0.5 μg/mL）处理细胞约 12 小时，以诱导 NBB 的表达140-2xFV-Venus</li>
	<li>通过加入含25 nM Dim的新鲜培养基（1 mL/孔）孵育以诱导NBB的坏死性凋亡140-2xFV-Venus 激活及向质膜的转位</li>
	<li>将培养室置于倒置显微镜平台上的旋转盘式激光扫描共聚焦显微镜中，该显微镜配备环境控制装置和63倍1.4数值孔径物镜，使用选定软件开始成像采集（参见 材料表).</li>
	<li>初始化软件，选择 &#34;聚焦&#34; 图标和YFP滤光片配置（激发波长515 nm）。</li>
	<li>找到视野和焦平面，并使用聚焦维持系统 &#34;确定焦点&#34; 表。</li>
	<li>开始采集时，选择 &#34;捕获&#34; 制表，随后设定滤光片配置、合适的EMCCD相机曝光时间与增强增益，以及时间序列采集参数，包括采集间隔和采集时长。</li>
	<li>监测荧光NBB的细胞内重新分布140-2xFV-Venus蛋白在坏死性凋亡过程中的变化，通过使用515 nm激光每10秒采集一次图像，利用EMCCD相机进行成像（视频 1). 
	注意：荧光蛋白成像过程中需关注光漂白问题。Venus 是抗光漂白能力较强的荧光蛋白之一。29如果使用对光漂白更敏感的荧光蛋白，则每隔30秒或更长时间成像一次，以允许在成像时间点之间信号恢复。</li>
	<li>监测 NBB 与质膜的结合140-2xFV-Venus 在坏死性凋亡过程中，使用配备自动TIRF滑块、100X 1.4 NA物镜和EMCCD相机的显微镜，通过全内反射荧光（TIRF）显微镜技术，每10秒对3.3步骤中制备的样品进行一次成像视频 2）。按照步骤 3.5–3.7 操作，但根据样品和显微镜腔室底部玻璃的厚度，在 TIRF 聚焦选项卡中调整 TIRF 角度。 
	注意：在TIRF分析中，可使用LCK-C-RFP等质膜标记物作为质膜定位的对照。</li>
	<li>通过与高斯函数的负归一化二阶导数进行卷积（Marr算法），执行图像处理以增强图像质量。</li>
</ol>
4. 电子显微镜
<ol>
	<li>将表达 NBB140-2xFV-Venus 的 mlkl-/- MEF 细胞以每 150 mm 等离子体包被培养皿 500 万个细胞的密度接种，并培养 12 小时（图 3）。</li>
	<li>加入多西环素（0.5 μg/mL）处理细胞，诱导 NB1-140-2xFV-Venus 表达 12 小时。</li>
	<li>加入 25 nM 同源二聚化剂处理 5 分钟，以诱导 NBB140-2xFV-Venus 的激活及其向细胞膜的转位。该时间点依据活细胞成像中观察到的坏死性凋亡动力学确定。</li>
	<li>移除培养基&#160;，使用预热至 37 °C 的 10 mL 含 2.5% 戊二醛和 2% 多聚甲醛的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）固定细胞。</li>
	<li>用刮棒收集样品，于 500 x g 离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>在含 1.5% 亚铁氰化钾的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液中，使用还原态 2% 四氧化锇于室温后固定样品 1.5 小时。四氧化锇是透射电子显微镜（TEM）中广泛使用的染色剂，可增强对比度。我们在对发生坏死性凋亡的细胞进行扫描电镜（SEM）分析前，先采用 TEM 进行初步观察。</li>
	<li>在 500&#160;x g 条件下，用超纯水清洗样品 5 次，每次 5 分钟，随后在缓冲液（见步骤 4.6）、水和乙醇中使用自动处理仪进行清洗。弃去上清液。</li>
	<li>对于扫描电镜（SEM）分析，使用 1% 醋酸铀和天冬氨酸铅重金属染色剂对先前固定的样品进行染色31。</li>
	<li>通过梯度酒精和环氧丙烷溶液对样品进行脱水处理。</li>
	<li>将样品包埋于硬树脂32 中，制备树脂块。</li>
	<li>切取 0.5 μm 厚的切片，以确定正确的分析区域。</li>
	<li>在样品表面镀上一层超薄的导电金属膜（铱）。</li>
	<li>对样品进行成像与分析（图 3）。定量分析时，使用电子显微镜在 5 keV 下扫描暴露细胞的树脂块表面，获取低倍率图像。</li>
	<li>可通过扫描电镜或图像软件获取的多个视野图像进行细胞观察，也可利用软件将多个视野拼接为一幅连续图像30。通过所选软件生成高分辨率拼接图，可据此评估约 100 个细胞中发生坏死性凋亡的细胞比例（见 材料表）。 
	注意：通过扫描电镜评估坏死形态时，需将正常细胞特征与前坏死或坏死表型的进展进行比较。这些特征包括细胞膜的改变，如微绒毛消失、细胞变平、出现大小在 10 nm 至 1 µm 范围内的破裂，或在至少 30–40% 的胞质区域中细胞器结构的丧失。</li>
</ol>
5. 通过核磁共振（NMR）光谱法检测MLKL的脂质结合
<ol>
	<li>准备 15N标记的NBB1-156 通过标准的蛋白质表达与纯化方法，如先前所述24.</li>
	<li>将500 µg 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸肌醇铵盐（18:0 PI）和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰-(1'-肌-肌醇)铵盐（18:1 PI）溶解于500 µL冰浴预冷的&#160;CHCl3 每种终浓度为 1 mg/mL。</li>
	<li>将1 mg/mL的18:0和18:1 PI在超声水浴中进行超声处理1分钟&#160;室温下孵育至少1分钟，或在冰水混合物中孵育最长5分钟。</li>
	<li>将1 mg/mL的18:0和18:1 PI分别分装至洁净的玻璃小瓶中，用于各自的核磁共振滴定实验系列（图4使用玻璃气密注射器转移有机溶剂中的脂质。
	<ol>
		<li>取132 µL浓度为1 mg/mL的18:1 PI（摩尔质量 = 880.137 g/mol）的CHCl溶液3 最终重悬体积为 1,200 µL，浓度为 125 µM。 
		注意：对于5 mm NMR管，准备系列稀释体积的 &#62;1,000 µL 且最终 NMR 样品体积为 &#62;500 µL。对于3 mm NMR管，制备系列稀释体积的 &#62;300 µL 和最终的 NMR 样品体积 &#62;150 µL</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将1 mg/mL的猪脑L-α-磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸铵盐溶于20:9:1的CHCl₃/CH₃OH/HCl（氯仿/甲醇/盐酸）混合溶剂中3/甲醇/H2O（脑组织 PI(4,5)P₂）2) 转移至洁净的玻璃小瓶中。</li>
	<li>将小瓶置于氩气（Ar）或氮气（N₂）气流下2）以中等流速吹扫，使有机溶剂蒸发，避免溅到玻璃小瓶壁上。5 至 30&#160;对于10–200 µL的有机溶剂体积，通常只需数分钟即可。</li>
	<li>使用大号镊子将玻璃小瓶置于布氏烧瓶或真空烧瓶底部，用橡胶塞密封，并连接通向真空管线的塑料管。在温和真空条件下抽气过夜，以去除残留有机物。</li>
	<li>用惰性气体覆盖脂质薄膜分装样品，密封后于-20 °C保存，一个月内使用；如需长期保存，则置于-80 °C。</li>
	<li>制备不含去垢剂（-Det）的核磁共振（NMR）样品缓冲液，其中含有 20 mM NaxHyPO4 pH 6.8，10% D2O 和含去垢剂（+Det）的 20 mM NaxHyPO4 pH 6.8，10% D2O，0.34 mM 正十二烷基-β-D-麦芽糖吡喃苷（DDM）。</li>
	<li>将 +Det 缓冲液加入含有脂质膜的玻璃小瓶中，达到所需浓度后，在水浴中超声处理最多 30 分钟，每超声 10 分钟后暂停，进行目视检查。 
	注意：超声处理可能会使样品升温。在最终蛋白样品复性前，需于室温下冷却15分钟。</li>
	<li>在含去垢剂的缓冲液（+Det buffer）中，通过超声处理1:1混合物，对脂质-去垢剂胶束进行系列稀释，以获得目标浓度梯度。从125 µM脂质浓度开始，经过三次重复稀释，依次得到62.5 µM、31.3 µM和15.6 µM的脂质浓度，均处于0.34 mM DDM条件下。</li>
	<li>分别在含去垢剂（-Det）和不含去垢剂（+Det）的缓冲液中制备蛋白质及添加剂的对照和参考核磁共振（NMR）样品。将蛋白质和添加剂分别加入至+Det缓冲液中各稀释浓度的脂质溶液中。 
	注意：对于 15N NBB156加入蛋白质至终浓度为 40 µM，并补充 2 mM 氘代二硫苏糖醇以保持半胱氨酸残基处于还原状态。</li>
	<li>将适量体积的样品转移至5 mm或3 mm核磁共振管中（参见步骤5.4中的说明）。</li>
	<li>手动将样品装入核磁共振仪，或在自动化平台（如SampleCase进样器）中进行排列。</li>
	<li>使用标准脉冲程序采集复合核磁共振谱 1H质子谱作为质量控制，随后进行二维 1H-15N相关谱图，采用横向弛豫优化谱（TROSY）或快速异核多量子相干（SOFAST-HMQC）方法33. 
	注意：使用 3 mm NMR 管进行 1H 测定时需要 64 次扫描15N TROSY（约3小时）或 1H-15N SOFAST-HMQC（约90分钟）。对于5 mm NMR样品管，扫描次数减半。</li>
	<li>处理后的二维核磁共振谱图可添加至 CARA 数据库34 供用户选择用于分析或其他软件。</li>
	<li>通过标注每种蛋白质状态的三个分散良好且分辨清晰的2D核磁共振共振峰来分析软件。记录在含有NBB的每种缓冲条件下这六个峰的峰强度156 (图5A）。
	<ol>
		<li>使用 CARA 准备批次整合列表（单击主菜单标题 &#34;光谱 | 设置所有采集光谱的批处理列表并进行分析&#160;使用单个峰归属文件（点击主菜单标题 &#34;峰 | 导入峰列表”……并选择一个用户自定义的 .peaks 文件，其中包含总共 6 个峰，每种蛋白质状态各 3 个。</li>
		<li>调整设置（&#34;整合器 | 调谐峰模型&#34; …）X轴宽度为0.06 ppm，Y轴宽度为0.30 ppm（点击主菜单标题 &#34;整合器 | 调谐峰模型&#34; …) 然后在两个菜单选项中记录最终输出（1. 单击主菜单标题 &#34;整合器 | 批量整合列表&#34;) （2. 单击主菜单标题 &#34;峰 | 导出积分表&#34;) (图5B). 
		注意：NBB 中残基 M21、V53 和 L105 的主链酰胺共振信号已被指认156&#160;闭合支架状态。通过三维核磁共振实验，将开放支架状态指定给残基G130和A141的骨架酰胺共振以及W133的侧链ε质子共振24.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过计算参考样品三个大括号振幅的平均值，并确定两个参考样品之间的归一化因子，对来自不同磁体或不同样品条件的样品进行归一化处理，以实现直接比较。计算NBB的缩放振幅156 使用归一化因子对共振信号进行校正，并将负振幅设为零（表2). 
	示例： 1) 不同磁体样品的比较：磁体 A，NBB156+DDM 和磁铁 B，NBB156+DDM。2）去垢剂比较：0.34 mM DDM 与 1.7 mM DDM。</li>
	<li>针对每个共振峰，通过将闭合或开放构象的分数除以所有含游离NBB光谱的最小至最大振幅范围，计算其标准化比例156 以及完全张开的NBB支架156 在去垢剂中</li>
	<li>将归一化的核磁共振信号强度对脂质浓度作图，并比较开环构象NBB的分数156 在不同条件下（图5C）。 
	注意：或者，可通过分析闭合臂构象的比例随脂质浓度的变化来比较脂质与NBB的结合情况156我们更倾向于采用前一种分析方法，因为它更快，并能更好地反映与脂质完全结合的组分比例。</li>
</ol>

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</ol>

我们提供了多种技术的实验方案，这些技术联合使用可证明MLKL是介导细胞膜破裂的假定执行者24。除了用于解析调控MLKL介导的坏死性凋亡的调控网络外，这些技术也可独立应用于其他合适的生物系统的表征。从实际应用角度看，这些技术属于中低通量的发现工具。
我们常规使用NBB140-2xFV-Venus介导的坏死性凋亡的活细胞成像，以及由其他MLKL构建体诱导的坏死性凋亡，通过定点突变和小分子化学探针来系统解析MLKL在坏死性凋亡中的调控机制。特别是，我们及其他研究团队已证实，包含NBB最小区域的人源和鼠源MLKL构建体均能在人源和鼠源细胞系中介导坏死性凋亡。已有报道指出，MLKL介导的坏死性凋亡存在一个限制因素，即RIPK3与MLKL相互作用的物种特异性，这导致在TNF、smac模拟物和caspase抑制剂联合刺激的上游信号激活下，不同物种之间无法发生交叉反应25,35,<sup c...

鉴定坏死性凋亡的遗传组分促进了利用动物模型来研究坏死性凋亡在生理和疾病中的作用1,2,3,4,5。在小鼠中敲除RIPK3或MLKL对发育和成体稳态影响甚微，提示坏死性凋亡对生命并非必需3,6。此外，某些物种本身缺乏RIPK3或MLKL基因，进一步支持坏死性凋亡在动物中非必需的观点7,8。另一方面，通过在实验室诱导多种病理状态来挑战这些基因敲除动物模型，已揭示坏死性凋亡在炎症、天然免疫和病毒感染中具有重要作用9,10,11,12。
坏死性凋亡可通过多种方式激活，这些方式涉及不同的天然免疫传感器信号通路，最终均导致RIPK3的活化1,13,14。活化的RIPK3继而磷酸化并激活MLKL3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18。其中研究最为深入且可能最为复杂的RIPK3激活途径涉及死亡受体的配体结合，该信号通路根据下游信号复合物的组成不同，可分别诱导凋亡或坏死性凋亡1。当信号通路倾向于通过RIPK1传导时，便会招募RIPK3，从而引发坏死性凋亡19,20。当胱天蛋白酶8（caspase 8）被药理学抑制或基因敲除时，该结果更容易发生；caspase 8是一种假定的坏死性凋亡内源性抑制因子，通常可抑制坏死性凋亡的发生。RIPK1通过结合并激活RIPK3发挥作用。另一种激活坏死性凋亡的途径是通过Toll样受体TLR3/TLR4信号通路，该通路通过含有TIR结构域的干扰素-β诱导适配蛋白（TRIF）招募并激活RIPK321。还有一种导致细胞发生坏死性凋亡的方式是通过激活DNA感受器DAI，后者可直接结合并激活RIPK322。
MLKL 是一种胞质蛋白，由 N 端螺旋束（NB）结构域和 C 端假激酶结构域（psKD）组成，二者通过一个调节性连接区（brace region）相连3。在正常细胞中，MLKL 存在于胞质中，被认为与 RIPK3 形成无活性的复合物14。坏死性凋亡的激活会触发 RIPK3 对 MLKL 假激酶结构域激活环的磷酸化，也可能磷酸化 NB 结构域和连接区的其他位点3,15,23。磷酸化诱导 MLKL 发生构象改变，导致其从 RIPK3 上解离14。目前尚不完全清楚的构象变化使连接区从 psKD 上释放出来24。该连接区包含两条螺旋，通过其 C 端螺旋介导 MLKL 寡聚化，形成假定的三聚体25。连接区的 N 端螺旋抑制 NB 结构域的活性，而 NB 结构域对细胞膜通透化至关重要24,26。单独存在的 NB 结构域足以诱导质膜通透化和坏死性凋亡16,24,27。NB 的促坏死性凋亡活性已在缺乏 MLKL 的小鼠胚胎成纤维细胞（mlkl-/- MEFs）中重建。NB 是一个脂质结合结构域，优先结合磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸（PIP2）。我们提出 MLKL 激活的逐步机制：连接区的寡聚化通过 NB 与 PIP2 极性头部基团的弱相互作用，促进 MLKL 向质膜募集24。在膜上，NB 结构域暴露出另一个高亲和力的 PIP2 结合位点，该位点在非活性 MLKL 中被连接区所遮蔽。总体而言，NB 与 PIP2 的多重相互作用破坏了质膜的稳定性，最终导致膜破裂，但这些事件的分子机制尚未阐明。
在此，我们展示用于表征MLKL作为坏死性凋亡执行者功能的具体方法24特别是，我们聚焦于MLKL最小的功能结构域——N端结构域与连接臂（NBB）。该结构域受连接臂介导的抑制调控，可通过强制性二聚化被激活，从而引发细胞膜破裂和坏死性凋亡。我们介绍了可诱导表达系统，并结合药物诱导的FKBP介导的强制性二聚化方法，用于经历坏死性凋亡的细胞的活细胞成像和电子显微镜观察。此外，我们还阐述了我们的 体外 NBB与磷脂酰肌醇（PIPs）相互作用的核磁共振分析

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;克隆与细胞系构建&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pRetroX-TRE3G</td><td>Clontech</td><td>631188</td><td></td></tr><tr><td>Tet-On 转录激活质粒</td><td></td><td></td><td>Llambi &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;, 2016</td></tr><tr><td>小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）mlkl-/-</td><td></td><td></td><td>Dillon &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;, 2014</td></tr><tr><td>盐酸杀稻瘟菌素S</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP2647100 CAS#3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;细胞死亡定量与活细胞显微成像&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>多西环素</td><td>Clontech</td><td>631311 CAS# 24390-14-5</td><td></td></tr><tr><td>B/B 同源二聚化剂 AP20187</td><td>Takara</td><td>635059 CAS# 195514-80-8</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;核磁共振（NMR）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 N 氯化铵</td><td>剑桥同位素实验室</td><td>NLM-467-10 CAS# 12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>氘代DTT</td><td>剑桥同位素实验室</td><td>DLM-2622-1</td><td></td></tr><tr><td>重水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>617385-1 CAS# 7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>正十二烷基-&amp;beta;-D-麦芽糖吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>D310 CAS# 69227-93-6</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（脑组织，猪）（铵盐）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046X CAS# 383907-42-4</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰肌醇（铵盐）（18:0 PI）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850143 CAS# 849412-67-5</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-肌醇)（铵盐）（18:1）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850149 CAS# 799268-53-4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;专用设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte FLR 或 ZOOM</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td></td><td>活细胞显微成像</td></tr><tr><td>Helios NanoLab 660 DualBeam&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td>电子显微镜</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td>http://www.essenbioscience.com</td><td>成像分析</td></tr><tr><td>FEI MAPS</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>https://www.fei.com/software/maps/</td><td>透射电镜分析</td></tr><tr><td>TopSpin v3.2</td><td>Bruker BioSpin</td><td>http://www.bruker.com</td><td>核磁共振数据采集</td></tr><tr><td>CARA v1.9.1.7</td><td></td><td>http://cara.nmr.ch/&amp;nbsp;</td><td>核磁共振数据解析</td></tr><tr><td>Slidebook</td><td>3i（Intelligent Imaging Innovations）</td><td>https://www.intelligent-imaging.com/slidebook</td><td>共聚焦显微镜</td></tr></tbody></table>

坏死性凋亡中mlkl介导的质膜破裂的表征

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

坏死性凋亡是一种程序性细胞死亡通路，由受体相互作用蛋白激酶3（RIPK3）的激活所触发。RIPK3可磷酸化并激活混合谱系激酶样结构域假激酶MLKL，导致细胞膜破裂或通透化。坏死性凋亡是一种与多种病理过程相关的炎症性通路，包括自身免疫、感染性疾病、心血管疾病、中风、神经退行性疾病以及癌症。本文描述了可用于鉴定MLKL在坏死性凋亡中作为细胞膜破裂执行者的实验方案。我们利用常规荧光和共聚焦荧光活细胞成像技术，对细胞中坏死性凋亡的过程进行可视化观察。

坏死性凋亡，MLKL，RIPK3，活细胞成像，细胞膜破裂，程序性细胞死亡，假激酶，磷酸化&#160;显微镜以及利用电子显微镜观察固定细胞，共同揭示了MLKL在质膜形成大孔洞之前从细胞质溶胶向质膜的重新分布。我们呈现 体外 利用脂质进行核磁共振（NMR）分析以鉴定MLKL介导的坏死性凋亡的潜在调节因子。基于该方法，我们鉴定了MLKL对脂质的定量结合偏好，并发现磷脂酰肌醇磷酸盐（PIPs）是MLKL的关键结合分子，对坏死性凋亡过程中MLKL向质膜的靶向定位及膜通透化至关重要。

通过可诱导表达一种最小截短的MLKL构建体NBB140-2xFV-Venus，现已能够在活细胞中可视化观察调控性坏死性凋亡（necroptosis）的执行过程。该构建体仍具有诱导质膜通透化的能力，并可通过二甲氧苯基甘氨酸（Dim）诱导FKBP结构域（2xFV）的寡聚化而被激活。我们采用活细胞显微成像技术，通过动力学监测（每5分钟一次）细胞不可渗透的绿色荧光DNA结合染料的摄取情况，来观察并定量坏死性凋亡过程（图6A）。该可诱导系统非常稳健，在经Dox预孵育并表达NBB140-2xFV-Venus的细胞中，通过Dim介导的寡聚化，可在约1小时内观察到mlkl-/- MEFs细胞完全发生坏死性凋亡（图1A）。我们将此条件下的坏死性凋亡称为快速动力学坏死性凋亡。单独表达Venus蛋白（无论是否添加Dim），或在...

我们报告了用于表征坏死性凋亡中由MLKL介导的质膜破裂的方法，包括常规和共聚焦活细胞显微成像、扫描电子显微镜以及基于核磁共振的脂质结合分析。

坏死性凋亡中MLKL介导的质膜破裂的表征

坏死性凋亡是一种程序性细胞死亡通路，由受体相互作用蛋白激酶3（RIPK3）激活所触发，RIPK3可磷酸化并……

这些方法有助于解答关于假激酶混合谱系激酶样蛋白（MLKL）在坏死性凋亡中作用的关键问题，例如其在脂质结合过程中的膜转位和通透化。这些技术的主要优势在于能够直接证明MLKL是坏死性凋亡中细胞膜破裂的执行者。活细胞成像技术彻底改变了细胞死亡研究领域，尤其推动了MLKL介导的坏死性凋亡研究。核磁共振是一种强大的技术，可用于监测脂质与蛋白质的结合，本文以MLKL为例进行了演示。首先，在24孔板中每孔加入1毫升添加了补剂的DMEM培养基，并接种5×10⁴个表达MLKL执行结构域（与寡聚化盒及Venus蛋白融合）的MLKL基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），每孔接种一次，置于细胞培养箱中过夜培养。次日早晨，用多西环素处理细胞12小时以诱导转基因表达，随后加入补充了FK506结合蛋白二聚化试剂和细胞膜非通透性绿色荧光染料的标准DMEM培养基，以诱导细胞发生坏死性凋亡。为了监测细胞死亡，将培养板放入位于哺乳动物组织培养箱内的合适成像设备中，并打开成像系统软件。选择“计划 upcoming 扫描”选项卡，在“物理布局”选项卡中选择托盘、容器、扫描类型和扫描模式。在“属性”选项卡中选择快速荧光，然后点击“时间线”窗口，设置总时间点数量和采集频率，以添加扫描时间。然后，点击“应用”以开始图像采集。为了定量分析坏死性凋亡，选择“任务”面板，将鼠标悬停在多张图像的背景区域，以在背景信号水平之上设置具有固定分割阈值的物体计数新分析。接着，选择“预览”以检查当前图像中的荧光物体，并根据需要优化阈值水平。可通过观察孔板上的多个孔并使用软件中的预览功能，仔细选择阈值。请注意，孔板中所有孔的阈值设置应保持一致。为整合绿色荧光计数，在“启动新分析”选项卡下选择时间范围和待分析的孔，并输入分析任务名称。然后，单击“确定”，并双击作业名称，将数据导出至适当的绘图软件中进行进一步分析。对于通过核磁共振波谱法（NMR）检测MLKL与脂质的结合，应使用密封的注射器将目标磷脂以每毫升一毫克的浓度分装至洁净的玻璃小瓶中，用于单独的NMR滴定实验，并将小瓶置于氩气或氮气气流下吹扫五到三十分钟。从氯仿或甲醇等挥发性溶剂中分装脂质时，必须迅速操作，且脂质储备液需保存在干冰上，以尽量减少因溶剂挥发而导致样品间脂质浓度不一致的情况。蒸发结束后，使用大号镊子将小瓶置于布氏烧瓶底部。用橡胶塞密封烧瓶，并连接连接至真空管线的塑料管，在温和真空条件下抽气过夜，以除去残留的有机溶剂。次日早晨，向每支含有脂质膜的玻璃小瓶中加入含有去垢剂的核磁共振缓冲液，使其达到适当的实验浓度，随后将小瓶置于水浴中超声处理最多30分钟，每10分钟停止一次超声，检查脂质膜的溶解情况。超声处理结束后，让样品管静置冷却15分钟，然后在含去垢剂的NMR缓冲液中对脂质-去垢剂胶束进行系列稀释，将1:1混合物超声处理以获得所需浓度梯度。分别在不含去垢剂和含去垢剂的NMR缓冲液中制备蛋白质及添加剂的对照和参考NMR样品，并将蛋白质和添加剂分别加入含去垢剂缓冲液中的各脂质稀释样品中。随后，将适量样品转移至合适尺寸的NMR样品管中，并将样品装载到NMR仪器上进行检测。在表达融合转基因的细胞经多西环素预孵育后，通过二聚体介导的寡聚化，可在一小时内观察到MLKL基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）发生完全的坏死性凋亡。这种快速动力学的坏死性凋亡支持MLKL作为质膜破裂假定执行者的角色：在加入二聚体后一至两分钟内，即可观察到与质膜相关的Venus荧光点状结构，细胞周边出现Venus信号；两至三分钟内，细胞逐渐变圆。在快速坏死性凋亡过程中，细胞形态在寡聚化后五分钟内即从正常的细长形转变为圆形并肿胀，10分钟时出现部分破裂，20分钟时细胞结构广泛解体，胞质消失。通过核磁共振波谱监测的体外脂质结合实验揭示了MLKL效应结构域蛋白在结合脂质后发生的显著结构变化：脂质结合导致抑制性支架区域从闭合的N端螺旋构象转变为开放且内在无序的构象，同时可获得两种构象混合物中各个残基的详细信息。在特定样品中，闭合与开放构象所占的百分比亦可被监测，从而为MLKL效应结构域与磷脂的相互作用提供支持性证据，并提示MLKL与质膜之间存在直接关联。因此，在尝试利用该方法定量细胞死亡时，必须清楚并牢记：DNA结合染料的荧光阈值高于通常使用的基因编码荧光蛋白。因此，这些方法可以并行使用。还需注意，胶束脂质对温度敏感，因此可能需要优化核磁共振样品的温度。在完成此操作后，还可采用其他技术，如全内反射显微镜和电子显微镜，以研究发生坏死性凋亡的细胞其细胞破裂的速度以及破裂在质膜上的定位位置。此外，可采用微尺度热泳技术对MLKL与胶束脂质的结合进行正交验证。本视频中介绍的技术为坏死性凋亡领域的研究人员探索MLKL在细胞膜破裂执行过程中的作用奠定了基础。请注意，使用氯仿具有极高的危险性，在进行该实验操作时，务必采取佩戴手套、在通风良好的环境中操作等安全防护措施。

characterization-mlkl-mediated-plasma-membrane-rupture

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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本文介绍了一种用于检测活细胞与邻近死亡或濒死细胞发生物理相互作用后所诱导的细胞内信号转导事件的实验方案。该方案侧重于由受体介导的对死亡细胞识别所引发的信号事件，而非对死亡细胞的吞噬摄取或可溶性介质的释放。...

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建立小鼠原代小脑颗粒神经元的神经元死亡与变性模型

我们描述了在细胞水平上通过荧光显微镜检测NLRP3炎性小体活化的方法，该方法利用针对活化型caspase-1和接头蛋白ASC的染色技术。同时提供了一种乳酸脱氢酶释放实验，用于在群体水平上检测细胞焦亡性裂解。这些技术可被调整用于研究炎性小体生物学的多个方面。...

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我们介绍了如何利用全内反射显微镜和落射荧光显微镜，在培养的星形胶质细胞中检测近膜区和全细胞内的钙离子动态变化。...

测量星形胶质细胞中近质膜及全细胞内钙动力学

受调控的内吞作用决定了大多数膜蛋白在细胞表面的表达水平。本文中，我们利用可还原且不能透过膜的生物素化试剂，测定多拓扑膜蛋白——多巴胺转运体（DAT）的内吞速率。该方法为测定大多数质膜蛋白内吞速率提供了一种简便直接的途径。...

通过可逆生物素化测定质膜蛋白内吞速率

本方案描述了一种通过流式细胞术快速定量GLUT4从细胞质向细胞膜转位的技术。...

通过流式细胞术对GLUT4向质膜转位进行定量测量

了解坏死性凋亡中MLKL介导的质膜破裂特征，利用活细胞显微镜、扫描电子显微镜和核磁共振脂质结合分析技术。该方法为研究细胞死亡机制提供了详细的实验方案。

坏死性凋亡中MLKL介导的质膜破裂的表征

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