Name: pH 依赖性荧光 Keima 对流式细胞术 Mitophagy 的敏感性测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 学习使用流式细胞术和pH依赖性荧光Keima蛋白快速检测活细胞中的线粒体自噬活性。该方法无需额外染色即可灵敏测量HeLa细胞的线粒体自噬水平，为研究线粒体稳态机制提供有效工具。

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本工作由韩国国家研究基金会资助（2016R1D1A1B03931949）（资助对象：J. U.），以及由韩国国家研究基金会（NRF）根据韩国政府（MSIT）资助的项目（编号：2016R1A2B2008887，编号：2016R1A5A2007009）（资助对象：J.Y.）提供支持。

1. 表达线粒体Keima（mt-Keima）的HeLa细胞的制备
<ol>
	<li>mt-Keima 慢病毒的制备
	<ol>
		<li>向100 mm培养皿中加入2 mL 0.001%的多聚赖氨酸/磷酸盐缓冲液（PBS），室温孵育5分钟，以包被培养皿。</li>
		<li>使用连接真空泵的玻璃移液管吸除多聚赖氨酸溶液，并加入2 mL 1× PBS洗涤培养皿。</li>
		<li>在包被后的培养皿中接种1.5 × 106个HEK293T细胞，加入含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的10 mL DMEM培养基，于37 °C、CO2细胞培养箱中培养1天。</li>
		<li>根据转染试剂说明书，使用转染试剂将2 µg mt-Keima慢病毒质粒29&#160;DNA与包装质粒DNA（psPAX 2 µg和pVSVG 0.25 µg）共转染，转染时间为8小时。</li>
		<li>移除转染后的培养基，加入8 mL新鲜培养基。</li>
		<li>48小时后收集含有病毒颗粒的培养基。将收集的培养基在500 × g条件下离心5分钟以去除细胞碎片，并用0.45 µm注射器滤器过滤。 
		注意：如需长期保存，可将慢病毒颗粒分装后于-80 °C保存。为保证病毒感染效率，应避免反复冻融。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用mt-Keima慢病毒感染HeLa-Parkin细胞
	<ol>
		<li>在收获mt-Keima慢病毒的前一天，将5 × 104个表达Parkin的HeLa细胞（HeLa-Parkin）接种于60 mm培养皿中，加入含10% FBS和1%青霉素/链霉素的4 mL DMEM培养基，于37 °C培养1天。 
		注意：由于HeLa细胞本身不表达内源性Parkin30，因此本实验采用HeLa-Parkin细胞以更清晰地展示CCCP诱导的线粒体自噬。该方法也可适用于其他原代细胞或永生化细胞系。</li>
		<li>次日移除生长培养基，加入1 mL含mt-Keima慢病毒的培养基，并额外加入含3 µL聚凝胺储存液（8 mg/mL，溶于蒸馏水）的2 mL生长培养基。在CO2细胞培养箱中孵育1天。</li>
		<li>次日移除mt-Keima慢病毒混合液，用1× PBS洗涤细胞两次，加入4 mL生长培养基，并加入2 µg/mL嘌呤霉素处理细胞2天。</li>
		<li>嘌呤霉素筛选2天后，移除生长培养基，用1× PBS洗涤细胞两次，更换新鲜生长培养基，将细胞置于CO2培养箱中继续培养，待后续使用。 
		注意：该方法可用于构建稳定表达mt-Keima的细胞系，包括其他细胞系及原代细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用 CCCP 处理诱导线粒体自噬并制备 FACS 样品
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>在60 mm培养皿中接种5 × 104个表达mt-Keima的HeLa-Parkin细胞，加入4 mL含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基，于37 °C、CO2细胞培养箱中培养1天。</li>
	<li>次日弃去培养基，加入4 mL含10 µM羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）的新鲜DMEM培养基，将HeLa-Parkin-mt-Keima细胞置于CO2培养箱中孵育6小时。</li>
	<li>6小时后弃去培养基，用2 mL 1× PBS洗涤细胞，加入胰蛋白酶/EDTA溶液消化使细胞脱落，随后加入含10% FBS的培养基终止胰酶反应，将细胞转移至15 mL锥形离心管中。</li>
	<li>以500 × g离心5分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，用1 mL预冷的1× PBS重悬细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞转移至适当的FACS管中，置于冰上。
	 
	注意：以未转染的HeLa细胞作为阴性对照。
	 
	注意：细胞在冰上可保持数小时的活性，mt-Keima荧光信号亦保持稳定。</li>
</ol>
3. 线粒体自噬的流式细胞术分析
注意：本研究中，使用配备405 nm和561 nm激光器的流式细胞仪对细胞进行分析。细胞同时用紫光激光（405 nm）激发，其发射光通过BV605检测器在610 ± 10 nm波长处检测；同时用黄绿光激光（561 nm）激发，其发射光通过PE-CF594检测器在610 ± 10 nm波长处检测（图1）。
<ol>
	<li>圈选活细胞
	<ol>
		<li>打开流式细胞仪和计算机，登录分析软件。</li>
		<li>新建一个实验或复制一个已有实验。若需使用紫光（405 nm）和黄绿光（561 nm）激光激发细胞，并在610 ± 10 nm检测器上检测发射光，则在参数窗口中选择BV605和PE-CF594，同时根据需要选择前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）作为荧光染料。 
		注意：所有荧光染料应在参数设置中以线性模式添加。</li>
		<li>将每个细胞样品短暂涡旋震荡，以分散细胞团块。</li>
		<li>将未感染mt-Keima慢病毒的对照HeLa-Parkin细胞样品管置于进样口，按下细胞仪上的 &#34;run&#34; 按钮。</li>
		<li>在FSC与SSC的散点图中，调节FSC和SSC电压，使细胞位于散点图中央。</li>
		<li>使用多边形（Polygon）工具在活细胞周围绘制P1门，排除死细胞和细胞碎片（图2A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调节紫光和绿光激光的电压
	<ol>
		<li>将感染了mt-Keima慢病毒的HeLa-Parkin细胞样品管置于进样口，按下细胞仪上的 &#34;run&#34; 按钮。</li>
		<li>在BV605（405 nm）与SSC的散点图中，调节BV605电压，使表达mt-Keima的HeLa-Parkin细胞与不表达mt-Keima的对照细胞明显区分开（图2B）。</li>
		<li>在PE-CF594（561 nm）与SSC的散点图中，调节PE-CF594电压，使表达mt-Keima的HeLa-Parkin细胞与对照细胞明显区分开（图2B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>评估发生线粒体自噬的细胞百分比
	<ol>
		<li>使用线性刻度获取BV605与PE-CF594的散点图。使用多边形工具在表达mt-Keima的细胞周围绘制门控区域，排除不表达mt-Keima的细胞（图3A）。该mt-Keima荧光阳性细胞群称为 &#34;mt-Keima&#34; 门。</li>
		<li>创建另一个仅显示 &#34;mt-Keima&#34; 门控细胞的BV605与PE-CF594散点图。在此图中，围绕未处理的mt-Keima阳性细胞绘制一个门控区域。对照HeLa细胞的基础线粒体自噬活性较低，其PE-CF594/BV605发射光比值小于1，因此该门控区域称为 &#34;low&#34; 门。</li>
		<li>在 &#34;low&#34; 门区域上方绘制另一个门控区域。该门控区域称为 &#34;high&#34; 门，因其包含线粒体自噬活性较高的细胞，即PE-CF594/BV605发射光比值较高的细胞（图3B）。</li>
		<li>为计算位于 &#34;high&#34; 门中的细胞百分比，选择 &#34;Show Population Hierarchy&#34; 菜单。&#34;Percent of Parent&#34;（%Parent）值表示在mt-Keima阳性细胞群中，位于 &#34;high&#34; 门中的细胞百分比。</li>
		<li>在 &#34;mt-Keima&#34; 停止门中设定至少记录10,000个事件，并运行每个样品。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种利用流式细胞术快速、灵敏地检测表达mt-Keima的细胞中线粒体自噬活性的方法。经历高水平线粒体自噬的细胞表现出更高的PE-CF594（561 nm）/BV605（405 nm）激发光比率。因此，线粒体自噬活性可表示为具有高561/405比值的细胞百分比。我们计算了在PE-CF594（561 nm）与BV605（405 nm）的散点图中位于&#34;高&#34;门区的细胞百分比，结果显示，CCCP处理可诱导HeLa-Parkin细胞中线粒体自噬的增加。我们先前已证实，通过慢病毒介导的mt-Keima过表达本身不会影响线粒体功能或细胞生理状态31。尽管我们在论文中展示了流式细胞术能够成功检测表达Parkin的HeLa细胞中由CCCP诱导的线粒体自噬，但该技术在引入mt-Keima后可适用于任何类型的细胞。我们此前还证明，在无需外源性表达Parkin的情况下，也可在HeLa细胞中检测到缺氧诱导的线粒体自噬29。此外，包括我们团队及其他研究小组在内的先前研究均表明，mt-Keima荧光分析可用于检测原代细胞（如小鼠胚胎成纤维细胞，ME...

线粒体是细胞增殖和生理功能所必需的细胞器。线粒体通过氧化磷酸化产生超过80%的ATP供应，同时还为生物合成和代谢提供多种代谢中间产物1，2。除了在能量供应和代谢中的作用外，线粒体还在许多其他重要过程中发挥核心作用，包括活性氧（ROS）的生成、细胞死亡的调控以及细胞内Ca2+动态平衡3。线粒体功能的改变与多种人类疾病相关，包括癌症、糖尿病以及各种神经退行性疾病4，5。线粒体功能障碍的增加以及线粒体DNA突变也被认为是正常衰老过程的重要影响因素6，7，8。因此，质量控制在线粒体中是一个至关重要的问题。线粒体是高度动态的细胞器，能够持续在拉长的网状结构与短小、碎片化的形态之间转换。线粒体动力学在维持线粒体功能以及通过线粒体自噬实现其降解方面发挥着重要作用9。
线粒体自噬是一种利用自噬机制选择性降解完整线粒体的过程。线粒体自噬是线粒体更新以及受损或功能障碍线粒体清除的主要机制。在此过程中，线粒体首先被膜结构包裹，形成自噬体，随后自噬体与溶酶体融合，实现水解降解9。先前在Drosophila中的遗传学研究提示，两个与帕金森病相关的基因——PTEN诱导的假定激酶1（PINK1）（PARK6）和Parkin（PARK2）——在同一条信号通路中发挥作用10,11。后续研究表明，PINK1-Parkin通路负责清除受损的线粒体，该通路的缺陷会导致线粒体自噬功能障碍，并可能参与多种人类疾病的发生12,13。近年来发现，线粒体自噬过程的缺陷存在于多种人类疾病中，包括癌症、心脏病、肝脏疾病和神经退行性疾病14。此外，最近的研究还表明，线粒体自噬在许多生理过程中至关重要，例如细胞分化、发育以及免疫应答15,16,17,18,19，提示线粒体自噬可能在调控细胞功能中发挥更为主动的作用。
尽管最近已证实线粒体自噬（mitophagy）在线粒体质量控制和人类疾病中均发挥重要作用，但其分子机制仍不甚清楚。虽然线粒体自噬相关机制已在酵母中得到系统研究，但针对哺乳动物细胞中线粒体自噬机制的研究主要集中在PINK1-Parkin通路。先前的研究已确立，PINK1-Parkin通路主要负责通过线粒体自噬选择性清除受损的线粒体12,20,21。然而，最近的研究报道，在某些模型中，即使缺乏功能性PINK1，线粒体自噬仍可被激活22,23,24。这些结果提示，除PINK1-Parkin通路外，还存在另一条尚未明确的通路可激活线粒体自噬。
缺乏一种便捷的方法来评估线粒体自噬活性，是探索调控线粒体自噬的通路及其在病理生理过程中的作用的主要障碍。透射电子显微镜是一种可直接观察被自噬体包裹的线粒体的强大工具。然而，电子显微镜在定量分析线粒体自噬活性方面存在局限性。尽管目前最广泛使用的方法是基于微管相关蛋白1轻链3（LC3）偶联的荧光探针策略，例如GFP-LC325基于LC3的信号具有瞬时性，且假阳性信号率较高，这限制了其在细胞中检测线粒体自噬的灵敏度26结合使用蛋白质印迹法检测线粒体蛋白水平、线粒体DNA定量以及荧光显微镜分析线粒体与自噬小体或溶酶体的共定位，是评估线粒体自噬的有效方法。然而，现有方法在定量方面的局限性及操作不便性促使人们寻求新的技术手段。一种新型pH依赖性荧光蛋白——线粒体靶向Keima（mt-Keima）的引入，显著提升了检测线粒体自噬的能力27通过将细胞色素c氧化酶亚基VIII（COX VIII）的线粒体靶向序列与Keima融合，mt-Keima可被靶向至线粒体基质。Keima的激发峰从440 nm（对应pH 7）显著偏移至586 nm（对应pH 4），该特性可用于高灵敏度地检测线粒体自噬，适用于两种 体外 和 体内 实验28,29更重要的是，mt-Keima 对溶酶体降解具有抗性，导致其信号在溶酶体中累积，从而便于对线粒体自噬活性进行定量检测。mt-Keima 的荧光变化可通过共聚焦显微镜或流式细胞术进行分析。28,29然而，迄今为止尚未详细提供基于流式细胞术、利用mt-Keima检测线粒体自噬活性的方法。
本文介绍了一种基于流式细胞术检测细胞中线粒体自噬活性的详细实验方案，该方法利用mt-Keima进行检测。尽管本文已证明流式细胞术能够成功检测表达Parkin的HeLa细胞中由CCCP诱导的线粒体自噬，但该技术可广泛应用于多种不同类型的细胞。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>wellgene</td><td>LS202-02</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30013.02</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Turbofect</td><td>Thermos scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m 注射器滤器</td><td>sartorius</td><td>16555</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>8 mg/ml</td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>2 mg/ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>羰基氰基间氯苯腙（CCCP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2759</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>wellgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD Bioscience</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>FACSDIVA</td><td>BD Bioscience</td><td>FACSDIVA (v8.0.1)</td><td></td></tr></tbody></table>

利用ph依赖性荧光报告基因mt-keima通过流式细胞术灵敏检测线粒体自噬

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

线粒体自噬是一种利用自噬机制选择性清除受损或多余线粒体的过程。已有研究发现，线粒体自噬功能障碍与多种人类疾病密切相关，包括神经退行性疾病、癌症以及代谢性疾病。此外，近期研究表明，线粒体自噬还参与多种正常的细胞过程，如细胞分化与发育。然而，线粒体自噬的具体作用及其分子机制仍需进一步研究。因此，建立一种可靠且便捷的方法来检测线粒体自噬活性的变化至关重要。本文中，我们描述了一种利用线粒体靶向荧光蛋白Keima（mt-Keima）通过流式细胞术定量评估线粒体自噬活性的详细实验方案。相较于传统的显微镜观察或免疫印迹方法，该流式细胞术检测方法能够更快速、更灵敏地分析线粒体自噬活性。本方案可广泛应用于多种细胞类型的线粒体自噬活性分析。

HeLa-Parkin 细胞中由 CCCP 诱导的线粒体自噬流式细胞术分析示例见图4。采用上述流式细胞术分析方法，我们可检测到“高”门控区域中发生线粒体自噬的细胞数量显著增加。与未处理的对照细胞相比，“高”门控区域中的细胞比例增加了10倍以上（图4A）。共处理巴佛洛霉素A（BFA）后，线粒体自噬活性的这一增加被完全抑制（图4A 和 4B）。
<img alt="细胞分选、激光调节、mt-Keima 追踪和线粒体自噬分析的流式细胞术示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58099/58099fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt...

线粒体自噬（mitophagy）是指线粒体的选择性降解过程，在维持线粒体稳态中发挥重要作用，并在多种人类疾病中出现调控异常。然而，目前可用于检测线粒体自噬活性的实验方法十分有限。本文中，我们提供了一种基于流式细胞术的高灵敏度检测方法，用于测量线粒体自噬活性。

利用pH依赖性荧光报告基因mt-Keima通过流式细胞术灵敏检测线粒体自噬

线粒体自噬是一种利用自噬机制选择性清除受损或多余线粒体的过程。已有研究发现其与……之间存在密切关联。

本实验的总体目标是提供一种利用流式细胞术测量细胞有丝分裂活性的高灵敏度技术。本文展示了该方法已成功用于评估经线粒体解偶联剂CCCP处理后，HeLa细胞有丝分裂活性的显著增强。该技术可快速、简便地检测有丝分裂活性。该技术的主要优势在于，无需任何额外染色即可在活细胞中灵敏地检测线粒体自噬活性。因此，该技术最终将有助于阐明线粒体自噬的机制及其生理功能。本实验操作将由我实验室的 Jee-Hyun Um 和 Young Yeon Kim 进行演示。开始此操作前，需先制备线粒体靶向的Keima慢病毒（mt-Keima）。首先，将HEK293T细胞接种于经多聚-L-赖氨酸包被的培养皿中，并在37°C的组织培养孵箱中培养一天。次日，按照生产商说明书，使用转染试剂将mt-Keima慢病毒DNA和包装用DNA共转染至HEK293T细胞中。转染8小时后，去除转染培养基，加入8毫升新鲜培养基。48小时后收集含有病毒颗粒的培养基，并通过离心去除细胞碎片。接着使用0.45微米注射器滤器过滤含病毒的培养基。在收获mt-Keima慢病毒的前一天，将HeLa-Parkin细胞接种于60毫米培养皿中，在37摄氏度培养箱中用4毫升生长培养基培养一天。次日，移除生长培养基，加入1毫升含mt-Keima病毒的培养基，再额外加入2毫升含有3微升聚凝胺原液的生长培养基，并在CO2培养箱中继续培养一天。感染后24小时，移除病毒培养基，用PBS洗涤细胞两次，然后加入4毫升生长培养基。为了去除未感染的细胞，用每微升2微克的嘌呤霉素处理细胞两天。配制含有10微摩尔CCCP的新鲜培养基。移除培养的培养基，并加入4毫升含有CCCP的新鲜生长培养基。在37摄氏度的CO2培养箱中孵育细胞6小时。移除培养基，用PBS洗涤细胞一次。用胰蛋白酶EDTA溶液处理，使细胞脱落。通过离心收集细胞，并将其重悬于一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。将细胞转移至流式管中，置于冰上。进行流式细胞术前，打开流式细胞仪并启动分析软件。新建一个实验，在参数窗口中为紫色激光选择 BV605，为黄绿色激光选择 PE-CF594。首先运行未感染 mt-Keima 慢病毒的细胞对照样本。在前向散射与侧向散射图中，使用多边形图标在活细胞周围绘制门控，排除死细胞和细胞碎片。然后运行感染了mt-Keima慢病毒的HeLa-Parkin细胞。在BV605与侧向散射的散点图中，调整电压，使表达mt-Keima的HeLa-Parkin细胞与不表达mt-Keima的对照细胞明显区分开来。接着，在PE-CF594与侧向散射的散点图中，调整电压，使表达mt-Keima的HeLa-Parkin细胞与对照细胞明显区分开来。然后在 BV605 与 PE-CF594 的点图中，使用多边形图标圈选 mt-Keima 阳性细胞群体。接着创建另一个仅显示 mt-Keima 门控细胞的 BV605 与 PE-CF594 点图。在此点图中，围绕未经处理的 mt-Keima 阳性细胞绘制一个门。此门被称为低门。然后绘制另一个包含低门上方区域的门。此门被称为高门，因为它包含具有高线粒体自噬活性的细胞。然后选择“显示群体层级”菜单。“父群百分比”值表示在 mt-Keima 阳性群体中，高门内细胞所占的百分比。现在运行每个样本，并在 mt-Keima 停止门中至少记录 10 000 个事件。对表达mt-Keima的未经处理的HeLa细胞进行流式细胞术分析，结果显示线粒体自噬水平较低。CCCP处理后，高门区内的线粒体自噬细胞显著增加。CCCP处理6小时后，线粒体自噬细胞的比例增加了10倍以上。经CCCP处理后线粒体自噬的增加效应可被巴佛洛霉素A共同处理完全消除。一旦表达mito-Keima的细胞准备就绪，若准备得当，可在一小时内使用流式细胞术进行线粒体自噬测量。为通过流式细胞术准确分析线粒体自噬，正确设置高门和低门至关重要。在分析新型细胞时，有必要使用HeLa细胞等已知细胞作为对照。此外，需要注意的是，线粒体自噬应通过其他特征加以充分确认，例如线粒体蛋白的减少以及线粒体DNA的降低。该技术可应用于多种细胞类型。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何通过流式细胞术分析线粒体自噬。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

pH 依赖性荧光 Keima 对流式细胞术 Mitophagy 的敏感性测定

本文描述了一种用于监测细胞器向酵母液泡酸性腔内递送以进行降解和回收的稳健方法。该方法依赖于利用基因编码的双发射荧光pH生物传感器对目标细胞器进行特异性标记，并通过荧光显微镜观察单个细胞。...

一种用于监测酵母Saccharomyces cerevisiae中线粒体自噬的荧光显微镜检测方法

本文介绍了一种通过免疫标记从啮齿类动物组织中分离的线粒体，并结合流式细胞术分析来检测和定量线粒体外膜蛋白的方法。该方法可进一步扩展用于评估线粒体亚群的功能特性。...

通过分离线粒体的流式细胞术对外膜蛋白进行免疫检测

本文详细描述了一种通过延时视频显微技术来检测EYFP-Parkin在选择性清除受损线粒体过程中时间依赖性募集的方法。这种依赖EYFP-Parkin的受损线粒体清除的动态过程，可作为在不同实验条件下评估细胞健康状态的指标。...

延时视频显微镜用于评估EYFP-Parkin聚集作为细胞有丝分裂吞噬的标志物

本研究采用多光谱成像流式细胞术，结合分析功能，对3种自噬标志物的明场细节图像进行比较，并定量分析其共定位情况，同时进行LC3斑点计数，从而以客观、定量且具有统计学稳健性的方式检测自噬水平。...

利用多光谱成像流式细胞术通过检测LC3、p62和LAMP1共定位评估自噬流

线粒体自噬是清除受损线粒体的过程，对于维持线粒体稳态和健康至关重要。本文介绍了一些在人类细胞、秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

体外 与 体内 检测人细胞、C. elegans 及小鼠中的线粒体自噬

本文介绍了一种用于定量活细胞中线粒体或溶酶体的强大方法。通过将特异性针对溶酶体或线粒体的荧光染料与荧光标记的表面标志物抗体相结合，利用多色流式细胞术，可在混合细胞群体（例如从组织样本中分离的原代细胞）中实现对这些细胞器的定量分析。...

基于多色流式细胞术的T细胞线粒体与溶酶体定量分析

异源物质外排泵在造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中具有高度活性，会导致线粒体膜电位荧光染料TMRM被排出。本文介绍了一种在维拉帕米（一种外排泵抑制剂）存在的情况下，使用TMRM准确测定HSPCs中线粒体膜电位的实验方案。...

通过抑制外排泵提高流式细胞术检测造血干细胞和祖细胞线粒体膜电位的准确性

线粒体自噬是线粒体质量控制的主要机制。然而，线粒体自噬的评估 体内 由于缺乏可靠的定量检测方法，该过程受到限制。本文介绍了一种利用细胞膜通透性绿色荧光线粒体染料和红色荧光溶酶体染料，在活细胞中观察线粒体自噬的实验方案。...

利用线粒体与溶酶体荧光染料可视化线粒体自噬

通过电子显微镜、遗传传感器和免疫荧光技术研究线粒体自噬需要昂贵的设备、熟练的技术人员以及大量的时间投入。本文展示了商用荧光染料试剂盒在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

线粒体自噬的检测 秀丽隐杆线虫 使用细胞器特异性染料标记细菌和哺乳动物细胞

本方案概述了两种用于定量分析胰腺β细胞有丝分裂的实验方法：第一种是结合使用可穿透细胞的线粒体特异性染料，第二种是利用基因编码的有丝分裂报告系统。这两种技术互为补充，可根据具体需求灵活选用，从而在定量研究线粒体质量控制方面实现灵活性与精确性。...

探究胰岛β细胞中线粒体自噬流的互补方法

学习使用流式细胞术和pH依赖性荧光Keima蛋白快速检测活细胞中的线粒体自噬活性。该方法无需额外染色即可灵敏测量HeLa细胞的线粒体自噬水平，为研究线粒体稳态机制提供有效工具。

利用pH依赖性荧光报告基因mt-Keima通过流式细胞术灵敏检测线粒体自噬

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