pH 依赖性荧光 Keima 对流式细胞术 Mitophagy 的敏感性测定
August 12th, 2018
Mitophagy, 线粒体的选择性降解, 与线粒体稳态有关, 在各种人类疾病中被解除管制。然而, 方便的实验方法测量 mitophagy 活动是非常有限的。在这里, 我们提供了一个敏感的检测 mitophagy 活动使用流式细胞仪。
该程序的总体目标是提供一种使用流式细胞术测量细胞线粒体自噬活性的灵敏技术。在这里，我们证明该方法已成功用于评估线粒体解偶联剂 CCCP 处理后 HeLa 细胞线粒体自噬的显着增加。该技术可以非常快速、轻松地测量 mitophage 活性。
该技术的主要优点是您可以灵敏地测量活细胞中的线粒体活性，而无需任何额外的染色。因此，这项技术最终将能够帮助理解 mitophage 的机制和生理作用。演示该程序的是我实验室的 Jee-Hyun Um 和 Young Yeon Kim。
通过准备 mt-Keima（一种靶向线粒体的 Keima 慢病毒）来开始此过程。首先HEK293T 聚-L-赖氨酸包被的培养皿中接种细胞，并在 37 摄氏度下在组织培养箱中培养一天。第二天，根据制造商的说明，使用转染试剂用 mt-Keima 慢病毒 DNA 和包装 DNase 转染 HEK293T 细胞。
转染 8 小时后，去除转染培养基并加入 8 mL 新鲜培养基。48 小时后收集含有病毒颗粒的培养基，并通过离心去除细胞碎片。接下来，使用 0.45 微米注射器过滤器过滤含病毒的介质。
在收获 mt-Keima 慢病毒前一天，将 HeLa-Parkin 细胞接种在 60 毫米培养皿中，并在 37 摄氏度下用 4 毫升生长培养基培养细胞一天。第二天，去除生长培养基，加入 1 毫米 mt-Keima 病毒培养基，再加入 2 毫升含有 3 微升聚凝胺原液的生长培养基，并将细胞在 CO2 培养箱中孵育一天。感染后 24 小时，去除病毒培养基，用 PBS 洗涤细胞两次，并加入 4 毫升生长培养基。
为了去除未感染的细胞，用每微升嘌呤霉素 2 微克处理细胞两天。准备含有 10 微摩尔 CCCP 的新鲜培养基。去除培养基，加入 4 毫升含有 CCCP 的新鲜生长培养基。
将细胞在 37 摄氏度下在 CO2 培养箱中孵育 6 小时。取出生长培养基并用 PBS 洗涤细胞一次。通过胰蛋白酶 EDTA 溶液处理来分离细胞。
通过离心收集细胞，并将其重新悬浮在一毫升 PBS 中。将细胞转移到 FACS 管中并将它们放在冰上。对于流式细胞术，打开流式细胞仪并启动分析软件。
生成一个新实验，并在参数窗口中为紫色激光选择 BV605，为黄绿色激光选择 PE-CF594。首先运行未感染 mt-Keima 慢病毒的细胞的对照样品。在前向散射与侧向散射的图中，使用多边形图标在活细胞周围绘制一个门，并消除死细胞和细胞碎片。
然后运行感染 mt-Keima 慢病毒的 HeLa-Parkin 细胞。在 BV605 与侧向散射的点图中，调整电压，使表达 mt-Keima 的 HeLa-Parkin 细胞与不表达 mt-Keima 的对照细胞明显区分开来。接下来，在 PE-CF594 与侧向散射的点图中，调整电压，以便表达 mt-Keima 的 HeLa-Parkin 细胞与对照细胞明显区分开来。
然后在 BV605 与 PE-CF594 的点图中，通过使用多边形图标绘制门来选择 mt-Keima 阳性细胞群。接下来，创建 BV605 与 PE-CF594 的另一个点图，仅显示 mt-Keima 门控细胞。在这个点图中，在未处理的 mt-Keima 阳性细胞周围画一个门。
此门称为低门。然后绘制另一个包含低门上方区域的门。该门被称为高门，因为它包含具有高线粒体自噬活性的细胞。
然后选择 Show Population Hierarchy 菜单。Percent of Parent 值表示 mt-Keima 阳性群体中高门细胞的百分比。现在运行每个样本并在 mt-Keima 停止门中记录至少 10 000 个事件。
表达 mt-Keima 的未经处理的 HeLa 细胞的流式细胞术分析显示线粒体自噬水平较低。CCCP 处理诱导高门线粒体自噬细胞的显着增加。CCCP 处理后 6 小时线粒体自噬细胞的百分比增加了 10 倍以上。
通过与巴弗洛霉素 A 的共同处理完全消除了 CCCP 处理对线粒体自噬的这种增加.一旦表达 mito-Keima 的细胞准备好，如果准备得当，可以使用流式细胞术在一小时内进行线粒体噬细胞测量。为了通过流式细胞术进行准确的线粒体分析，设置正确的高门和低门非常重要。在分析新型细胞时，有必要使用众所周知的细胞，例如 HeLa 细胞作为对照。
此外，重要的是要记住，线粒体应通过其他特征（例如线粒体蛋白的减少和线粒体 DNA 的减少）来完全证实线粒体。该技术可应用于多种细胞类型。观看此视频后，您应该对如何通过流式细胞术分析线粒体癌有很好的了解。
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概述
本文介绍了一种使用流式细胞术测量细胞线粒体自噬活性的敏感技术。该方法允许快速且简单地评估活细胞中的线粒体自噬，无需额外染色。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 神经科学
- 细胞代谢
背景
- 线粒体自噬是对线粒体的选择性降解。
- 它在维持线粒体稳态中起着至关重要的作用。
- 线粒体自噬失调与各种人类疾病有关。
- 当前测量线粒体自噬的方法有限。
研究目的
- 提供一种测量线粒体自噬活性的敏感方法。
- 展示流式细胞术技术的有效性。
- 增强对线粒体自噬生理作用的理解。
使用的方法
- 流式细胞术用于测量线粒体自噬活性。
- 评估CCCP处理后的HeLa细胞线粒体自噬。
- 在无需额外染色的情况下测量线粒体自噬。
- 由Jee-Hyun Um和Young Yeon Kim研究人员展示。
主要结果
- 成功评估了HeLa细胞中线粒体自噬的增加。
- 展示了快速和敏感的测量能力。
- 验证了该技术在活细胞中的适用性。
- 提供了对线粒体自噬机制的洞察。
结论
- 流式细胞术技术对测量线粒体自噬有效。
- 该方法可以促进进一步研究线粒体动力学。
- 它有潜力理解与线粒体自噬相关的各种疾病。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of mitophagy is essential for de-risking mitochondrial-targeted therapeutic hypotheses in neurodegenerative and metabolic disease programs. The mt-Keima flow cytometry assay provides a rapid, quantitative readout that supports early-stage target validation by linking mitochondrial clearance to phenotypic outcomes. This enables predictive confidence in lead identification and prioritization of compounds modulating mitochondrial quality control.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring mitochondrial autophagic flux as a functional readout of pathway engagement.
- Operational Value: Enables rapid screening of genetic or pharmacological modulators without fixation or additional staining, preserving live-cell physiology.
- Predictive Value: Supports target de-risking by correlating mitophagy induction with known activators like CCCP and inhibition by bafilomycin A, establishing assay specificity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, flow-based percentages of mitophagy-active cells, enabling dose-response and kinetic analysis for hit confirmation.
- Operational Value: Compatible with high-throughput flow cytometry platforms, allowing standardized, reproducible measurements across cell lines and treatment conditions.
- Scalability: Lentiviral mt-Keima expression creates a stable reporter system reusable across multiple experiments, reducing assay development time.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Mitophagy activity measured in live cells aligns with disease-relevant models where mitochondrial dysfunction contributes to pathology.
- Preclinical Readiness: The assay’s sensitivity to lysosomal inhibition (e.g., bafilomycin A) supports mechanistic follow-up in autophagic flux studies.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of mitophagy flux with downstream biomarkers such as mitochondrial DNA loss or ROS production when combined with orthogonal assays.
Pipeline & Workflow Integration
The mt-Keima flow cytometry method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, providing a mechanistic biomarker for mitochondrial health interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of mitophagy regulators by quantifying flux changes in response to pathway modulators.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for assay standardization and inter-laboratory comparability.
- Analytics: Generates percentage-based readouts (high gate vs. mt-Keima-positive population) that enable statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by confirming target engagement in disease-relevant cellular models of mitochondrial stress.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable mitochondrial flux platform applicable across therapeutic areas involving neurodegeneration, metabolism, and aging.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial pathway modulation by providing direct, live-cell readouts of autophagic clearance.
- Operational Value: Eliminates need for fixation or permeabilization, enabling same-day analysis and reducing assay variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking compound effects to mitochondrial quality control, reducing late-stage attrition due to off-target mitochondrial toxicity.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on functional mitophagy modulation in human cell systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral transduction, flow cytometry compensation, and gating strategy design for dual-fluorescence reporters.
- Dependent on access to flow cytometers with violet (405 nm) and yellow-green (561 nm) laser lines and appropriate filters (BV605, PE-CF594).
- Necessitates standardization of mt-Keima expression levels and puromycin selection across cell lines to ensure consistent signal-to-noise ratios.
- Requires validation of mitophagy specificity using lysosomal inhibitors (e.g., bafilomycin A) and mitochondrial uncouplers (e.g., CCCP) as positive and negative controls.
- Limited to cells amenable to lentiviral transduction and puromycin selection; alternative delivery methods may be needed for primary or hard-to-transfect systems.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
1:02
Generation of Cells Expressing mt-Keima
3:25
Inducing Mitophagy using CCCP Treatment and Preparing FACS Samples
4:29
FACS Analysis of Mitophagy
7:16
Results: Analysis of CCCP-induced Mitophagy in HeLa-mt-Keima Cells by Flow Cytometry
7:55
Conclusion
