利用pH依赖性荧光报告基因mt-Keima通过流式细胞术灵敏检测线粒体自噬
2018年8月12日
线粒体自噬（mitophagy）是指线粒体的选择性降解过程，在维持线粒体稳态中发挥重要作用，并在多种人类疾病中出现调控异常。然而，目前可用于检测线粒体自噬活性的实验方法十分有限。本文中，我们提供了一种基于流式细胞术的高灵敏度检测方法，用于测量线粒体自噬活性。
本实验的总体目标是提供一种利用流式细胞术测量细胞有丝分裂活性的高灵敏度技术。本文展示了该方法已成功用于评估经线粒体解偶联剂CCCP处理后，HeLa细胞有丝分裂活性的显著增强。该技术可快速、简便地检测有丝分裂活性。
该技术的主要优势在于，无需任何额外染色即可在活细胞中灵敏地检测线粒体自噬活性。因此，该技术最终将有助于阐明线粒体自噬的机制及其生理功能。本实验操作将由我实验室的 Jee-Hyun Um 和 Young Yeon Kim 进行演示。
开始此操作前，需先制备线粒体靶向的Keima慢病毒（mt-Keima）。首先，将HEK293T细胞接种于经多聚-L-赖氨酸包被的培养皿中，并在37°C的组织培养孵箱中培养一天。次日，按照生产商说明书，使用转染试剂将mt-Keima慢病毒DNA和包装用DNA共转染至HEK293T细胞中。
转染8小时后，去除转染培养基，加入8毫升新鲜培养基。48小时后收集含有病毒颗粒的培养基，并通过离心去除细胞碎片。接着使用0.45微米注射器滤器过滤含病毒的培养基。
在收获mt-Keima慢病毒的前一天，将HeLa-Parkin细胞接种于60毫米培养皿中，在37摄氏度培养箱中用4毫升生长培养基培养一天。次日，移除生长培养基，加入1毫升含mt-Keima病毒的培养基，再额外加入2毫升含有3微升聚凝胺原液的生长培养基，并在CO2培养箱中继续培养一天。感染后24小时，移除病毒培养基，用PBS洗涤细胞两次，然后加入4毫升生长培养基。
为了去除未感染的细胞，用每微升2微克的嘌呤霉素处理细胞两天。配制含有10微摩尔CCCP的新鲜培养基。移除培养的培养基，并加入4毫升含有CCCP的新鲜生长培养基。
在37摄氏度的CO2培养箱中孵育细胞6小时。移除培养基，用PBS洗涤细胞一次。用胰蛋白酶EDTA溶液处理，使细胞脱落。
通过离心收集细胞，并将其重悬于一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。将细胞转移至流式管中，置于冰上。进行流式细胞术前，打开流式细胞仪并启动分析软件。
新建一个实验，在参数窗口中为紫色激光选择 BV605，为黄绿色激光选择 PE-CF594。首先运行未感染 mt-Keima 慢病毒的细胞对照样本。在前向散射与侧向散射图中，使用多边形图标在活细胞周围绘制门控，排除死细胞和细胞碎片。
然后运行感染了mt-Keima慢病毒的HeLa-Parkin细胞。在BV605与侧向散射的散点图中，调整电压，使表达mt-Keima的HeLa-Parkin细胞与不表达mt-Keima的对照细胞明显区分开来。接着，在PE-CF594与侧向散射的散点图中，调整电压，使表达mt-Keima的HeLa-Parkin细胞与对照细胞明显区分开来。
然后在 BV605 与 PE-CF594 的点图中，使用多边形图标圈选 mt-Keima 阳性细胞群体。接着创建另一个仅显示 mt-Keima 门控细胞的 BV605 与 PE-CF594 点图。在此点图中，围绕未经处理的 mt-Keima 阳性细胞绘制一个门。
此门被称为低门。然后绘制另一个包含低门上方区域的门。此门被称为高门，因为它包含具有高线粒体自噬活性的细胞。
然后选择“显示群体层级”菜单。“父群百分比”值表示在 mt-Keima 阳性群体中，高门内细胞所占的百分比。现在运行每个样本，并在 mt-Keima 停止门中至少记录 10 000 个事件。
对表达mt-Keima的未经处理的HeLa细胞进行流式细胞术分析，结果显示线粒体自噬水平较低。CCCP处理后，高门区内的线粒体自噬细胞显著增加。CCCP处理6小时后，线粒体自噬细胞的比例增加了10倍以上。
经CCCP处理后线粒体自噬的增加效应可被巴佛洛霉素A共同处理完全消除。一旦表达mito-Keima的细胞准备就绪，若准备得当，可在一小时内使用流式细胞术进行线粒体自噬测量。为通过流式细胞术准确分析线粒体自噬，正确设置高门和低门至关重要。在分析新型细胞时，有必要使用HeLa细胞等已知细胞作为对照。
此外，需要注意的是，线粒体自噬应通过其他特征加以充分确认，例如线粒体蛋白的减少以及线粒体DNA的降低。该技术可应用于多种细胞类型。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何通过流式细胞术分析线粒体自噬。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本文介绍了一种利用流式细胞术检测细胞线粒体自噬活性的高灵敏度技术。该方法无需额外染色，即可快速、简便地评估活细胞中的线粒体自噬。
关键研究要素
科学领域
- 细胞生物学
- 神经科学
- 细胞代谢
背景
- 线粒体自噬是线粒体的选择性降解过程。
- 它在维持线粒体稳态中起着关键作用。
- 线粒体自噬的失调与多种人类疾病相关。
- 目前测量线粒体自噬的方法仍有限。
研究目的
- 提供一种高灵敏度的检测方法，用于测量线粒体自噬活性。
- 展示流式细胞术技术的有效性。
- 加深对线粒体自噬生理功能的理解。
使用的方法
- 用于测量线粒体自噬活性的流式细胞术。
- CCCP处理后HeLa细胞线粒体自噬的评估。
- 无需额外染色的线粒体自噬测量。
- 由研究人员 Jee-Hyun Um 和 Young Yeon Kim 演示。
主要结果
- 成功评估了HeLa细胞中线粒体自噬的增加。
- 展示了快速且灵敏的检测能力。
- 验证了该技术在活细胞中的适用性。
- 提供了关于线粒体自噬机制的深入见解。
结论
- 流式细胞术是检测线粒体自噬的有效方法。
- 该方法有助于进一步研究线粒体动力学。
- 它在线粒体自噬相关疾病的机制研究中具有重要应用潜力。
常见问题
执行层面的行业相关性
准确量化线粒体自噬对于降低神经退行性疾病和代谢性疾病项目中靶向线粒体治疗假设的风险至关重要。mt-Keima 流式细胞术检测提供了一种快速、定量的读出方法，通过将线粒体清除与表型结果关联，支持早期靶点验证，从而在先导化合物的识别和调控线粒体质量控制化合物的优先排序中提供可预测的可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过测量线粒体自噬流作为通路激活的功能性读数，验证治疗假设。
- 操作价值：无需固定或额外染色即可快速筛选基因或药物调节剂，保持活细胞生理状态。
- 预测价值：通过将线粒体自噬的诱导与已知激活剂（如CCCP）以及bafilomycin A的抑制作用相关联，验证检测方法的特异性，支持靶点风险评估。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成定量的、基于流式的有丝分裂吞噬活性细胞百分比，能够进行剂量-反应和动力学分析，用于确认活性化合物。
- 操作价值：兼容高通量流式细胞仪平台，可在不同细胞系和处理条件下实现标准化、可重复的测量。
- 可扩展性：慢病毒介导的mt-Keima表达可建立稳定的报告系统，可在多个实验中重复使用，减少检测方法开发时间。
转化与临床前研究
- 转化连续性：在活细胞中测得的线粒体自噬活性与疾病相关模型一致，在这些模型中，线粒体功能障碍导致病理发生。
- 临床前适用性：该检测方法对溶酶体抑制（例如，巴佛洛霉素 A）具有敏感性，支持在自噬流研究中进行机制性后续分析。
- 生物标志物一致性：当与正交检测方法结合时，可实现线粒体自噬流与下游生物标志物（如线粒体DNA丢失或活性氧产生）的相关性分析。
流程与工作流整合
mt-Keima 流式细胞术方法适用于从靶点假设验证到先导化合物优化的整个发现过程，为线粒体健康干预提供了一种机制性生物标志物。
- 发现生物学：通过量化线粒体自噬通路调节因子在通路调节剂作用下的流量变化，支持对线粒体自噬调控因子的假设驱动型研究。
- 筛选：提供可重复的定量输出结果，适用于检测方法的标准化以及不同实验室之间的数据比较。
- 分析：生成基于百分比的读数（高门控区域与mt-Keima阳性细胞群），可在不同实验条件下进行统计学比较。
- 转化研究：通过在与疾病相关的线粒体应激细胞模型中确认靶点结合，连接并支持临床前验证。
- 企业级复用：建立可重复使用的线粒体流量检测平台，适用于涉及神经退行性疾病、代谢和衰老等治疗领域的研究。
运营与企业影响
- 科学价值：通过提供自噬清除的直接活细胞读数，减少线粒体通路调控中的机制模糊性。
- 操作价值：无需固定或透化步骤，可实现当天分析，并降低检测的变异性。
- 战略价值：通过将化合物效应与线粒体质量控制关联，改善“推进/终止”决策，减少因脱靶线粒体毒性导致的后期研发失败。
- 项目组合影响：基于在人类细胞系统中功能性线粒体自噬调控的结果，促进对靶点进行风险调整后的优先排序。
实施注意事项
- 需要具备慢病毒转导、流式细胞术补偿以及双荧光报告系统门控策略设计方面的专业知识。
- 依赖配备紫色（405 nm）和黄绿色（561 nm）激光线及相应滤光片（BV605、PE-CF594）的流式细胞仪。
- 需要在不同细胞系中标准化mt-Keima表达水平和嘌呤霉素筛选条件，以确保一致的信噪比。
- 需使用溶酶体抑制剂（如巴佛洛霉素A）和线粒体解偶联剂（如CCCP）作为阳性和阴性对照，验证线粒体自噬的特异性。
- 仅适用于可进行慢病毒转导和嘌呤霉素筛选的细胞；对于原代细胞或难转染体系，可能需要采用其他递送方法。
