Name: 原代培养小鼠肠嗜铬细胞的全细胞电生理 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 学习原代培养小鼠肠嗜铬细胞的全细胞电生理技术，用于研究肠道神经科学与胃肠激素释放机制。该方法通过单细胞电生理记录深入解析EC细胞兴奋性及其对管腔刺激的反应。

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作者感谢Lyndsay Busby女士提供的行政协助，以及梅奥诊所工程部Robert Highet先生在培养皿插件设计与3D打印方面的帮助。本研究由NIH K08基金（DK106456）资助AB，梅奥诊所胃肠道细胞信号转导中心（NIH P30DK084567）向AB提供试点与可行性资助，AB还获得2015年美国胃肠病学会研究学者奖（AGA RSA），GF获得NIH R01基金（DK52766）资助。

本文所述所有方法均已获得梅奥诊所机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。本实验方案中的原代细胞培养部分基于此前已发表的方法，更多细节可参考相关文献10。所有实验操作必须经过机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并且所有实验均须依照相关指南和法规进行。
1. 培养物制备
<ol>
	<li>培养基
	<ol>
		<li>使用高糖[4500 mg/L] Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），添加5%胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素，配制EC细胞完全培养基表1). 
		注意：培养基可在 4 °C 下保存长达一个月。</li>
		<li>过滤EC细胞完全培养基，取25 mL培养基于37 °C条件下加入50 mL离心管中。</li>
		<li>使用高糖[4,500 mg/L] DMEM培养基，并添加0.1%牛血清白蛋白（BSA），配制消化液表1).</li>
		<li>将消化液过滤，并取四份10 mL的滤液分别加入四个50 mL离心管中，置于37 °C水浴中孵育。 
		注意：培养基可在 4 °C 下保存长达一个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酶
	<ol>
		<li>称取4 mg（空肠）或24 mg（结肠）胶原酶XI [≥800 单位/mg] 至1.5 mL 微量离心管中。 
		注意：胶原酶在 -20 °C 下可稳定保存长达一年。</li>
		<li>将胶原酶分装物重悬于 1 mL 冰冷的含 Ca PBS 中2+ 和 Mg2+涡旋溶液以充分混匀，并置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>包被培养板
	<ol>
		<li>在冰上于 4 ˚C 过夜解冻 150 µL 胞外基质。</li>
		<li>通过将100 µL解冻的细胞外基质与2 mL预冷的无血清高糖DMEM混合，配制5% w/v的细胞外基质溶液。 
		注意：细胞外基质在室温下会凝固，因此在准备包被培养皿之前，应使用预冷的移液器、离心管和培养基进行操作。</li>
		<li>立即用250 µL的5%细胞外基质溶液包被35 mm玻璃底培养皿的玻璃内圈。此配方最多可处理8个培养皿。</li>
		<li>将玻璃底培养皿置于37 °C培养箱中，继续进行后续的细胞培养分离步骤。细胞外基质至少需要1 h才能凝固，但在进行其他分离步骤时，可孵育长达2.5 h。 
		注意：孵育时间超过3小时可能导致细胞外基质积聚，从而在全细胞电生理记录过程中阻碍封接的形成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组织分离
<ol>
	<li>根据伦理准则，处死一只3至6周龄的雄性或雌性Tph1-CFP转基因小鼠（The Jackson Laboratory货号：028366）9或其他报告基因小鼠品系。 
	注意：我们采用逐渐增加浓度的二氧化碳致死剂量，并辅以颈椎脱位以确保动物死亡。AVAM安乐死委员会也认为，对于经过训练的操作人员，若动物已预先镇静，颈椎脱位可作为主要的安乐死方法。</li>
	<li>使用21号针头将已处死的小鼠固定在聚苯乙烯泡沫解剖板上。用70%乙醇对小鼠腹部进行去污处理。</li>
	<li>使用显微解剖镊（#5）拉紧小鼠皮肤，然后用锋利的手术剪在小鼠腹部底端做一横向切口，暴露腹腔。再沿腹部垂直向上剪开，直至暴露肋骨区域。</li>
	<li>使用显微解剖镊将盲肠移至小鼠左侧，以清晰暴露结肠。</li>
	<li>使用显微解剖剪剪除结肠最远端部分（但仍位于直肠近端），并在胃远端处做第二个切口。将取出的肠道置于盛有20 mL冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）的100 × 15 mm2培养皿中。</li>
	<li>使用小尺测量并切取10 cm的中段结肠或空肠。通过测量位于直肠上方第一个切口近端的10 cm肠段来获取结肠。将整个小肠对折以确定空肠位置，在对折点处做第一个切口，再在其近端10 cm处做第二个切口以获取空肠组织。 
	注意：后续所有分离步骤均需在冰上操作。</li>
	<li>用冰上预冷的PBS填充一支6 mL注射器，将针头插入取出的肠段腔内。使用显微解剖镊夹紧并封闭针头周围的肠道组织，缓慢注入10 mL PBS冲洗肠腔，以去除粪便残留物。</li>
	<li>通过将显微解剖镊轻轻插入肠腔，夹住一段肠壁，并将组织从镊尖近端拉出，使肠组织翻转。重复此操作，直至肠段完全内翻，肠腔朝外。</li>
	<li>使用显微解剖剪将肠组织切成1 cm长的小段。</li>
	<li>使用显微解剖镊将组织片段转移至盛有5 mL无菌PBS的50 mL烧杯中。用显微解剖剪将组织剪碎至呈液状质地。</li>
	<li>用移液管将剪碎的组织与15 mL冰上预冷的PBS转移至洁净的50 mL离心管中。用移液管吹打混匀2次，静置使组织沉淀，吸除15 mL PBS上清液，并补充新鲜PBS。重复该过程三次，直至PBS澄清。</li>
	<li>将含有清洗后组织片段的50 mL离心管置于冰上，并将冰桶移入组织培养超净台中。</li>
</ol>
3. 酶消化与机械消化
<ol>
	<li>首次消化
	<ol>
		<li>从水浴中取出一支含有10 mL预热消化液的50 mL离心管。向该50 mL离心管中加入250 µL PBS胶原酶溶液和剪碎的肠组织片段。 
		注意：务必避免带入前一步洗涤中的 PBS。</li>
		<li>将50 mL离心管置于37 °C水浴中5分钟（结肠或空肠），每分钟摇动2次。 
		注意：机械消化的最佳时间和强度可能有所不同，需由使用者自行确定。为确定最佳消化条件，可在每次消化后取10 µL细胞样品进行观察。在第一次消化过程中，上清液中应含有细胞团块。</li>
		<li>用10 mL血清移液管缓慢吹打组织一次。短暂静置使组织块沉降，然后用移液管完全移除10 mL上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第二次消化：重复步骤 3.1.1 至 3.1.3。若消化结肠，将孵育时间延长至 10 分钟；若消化空肠，则保持孵育时间为 5 分钟。 
	&#8203;注意：观察时，上清液中仍应含有大量细胞团块。</li>
	<li>第三次消化
	<ol>
		<li>重复步骤 3.1.1</li>
		<li>将50 mL离心管置于37 ˚C水浴中10分钟（结肠或小肠空肠段）。每分钟以高于消化步骤1和2的强度振荡2-3次。</li>
		<li>用10 mL血清移液管缓慢地将组织上下吹打。让组织块短暂沉降。 
		注意：上清液应包含单细胞和少量小细胞团的混合物。</li>
		<li>使用移液管将10 mL上清液转移至新的15 mL离心管中，加入2 mL预热的EC细胞完全培养基，轻轻倒置一次混匀。</li>
		<li>以 100 x 转速离心 g 室温孵育5分钟，然后用移液管吸除上清液。用移液管将剩余沉淀重悬于2.5 mL预热的EC细胞完全培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第四次消化：重复步骤 3.3.1 至 3.3.5。结肠的孵育时间延长至 15 分钟，空肠仍为 10 分钟。 
	注意：上清液现在应含有单细胞。</li>
</ol>
4. 细胞培养
<ol>
	<li>使用移液管将第三次和第四次消化收集的细胞悬液合并至一个新的15 mL离心管中（总体积为5 mL）。</li>
	<li>取10 µL细胞悬液用于血细胞计数板计数，其余细胞悬液在室温下以100 × g 离心5分钟。 
	注意：最终的细胞悬液将包含小团块和单个细胞。</li>
	<li>用移液管吸去上清液，并将沉淀重悬于EC细胞完全培养基中，细胞密度为每毫升1,000,000个细胞。 
	注意：细胞悬液的最终体积取决于最终细胞数量。典型的细胞数量范围为2,000,000至4,000,000个。</li>
	<li>从培养箱中取出包被好的玻璃底培养皿。使用P1000移液器将每个培养皿中的细胞外基质替换为250 µL最终细胞悬液。 
	注意：细胞外基质包被容易附着在玻璃底培养皿的边缘。必须特别小心地清除边缘处的包被，以防止凝胶堆积。</li>
	<li>配制1 mM的ROCK抑制剂Y-27632储备液。向每个玻璃底培养皿中加入2.5 µL储备液，使每个培养皿中ROCK抑制剂的工作浓度达到10 µM。 
	注意：此步骤对空肠培养物的存活至关重要，但对结肠培养物可选。</li>
	<li>将每个培养皿置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养24至72小时（图1）。</li>
</ol>
5. 全细胞电生理实验用内皮细胞的制备
<ol>
	<li>用两条 5 × 0.5 cm 的石蜡膜条环绕显微镜载物台内径，形成一个 O 形圈。将 35 mm 细胞培养皿置于 O 形圈内（图2A-B).</li>
	<li>冲洗掉内皮细胞周围的漂浮碎屑（如未贴附的细胞外基质或死细胞）以及培养基中的血清，确保彻底清除，以防止这些物质阻碍内皮细胞与电极之间形成封接。可采用以下三种方法中的任意一种，以实现电生理实验所需的充分细胞清洗：
	<ol>
		<li>方案1：在长形腔室中，溶液交换效率高于圆形腔室。由于EC细胞在圆形35 mm培养皿中培养，可为该培养皿制作一个塑料椭圆形插入装置。
		<ol>
			<li>通过3D打印或传统铣削方法制备嵌件。我们所使用的嵌件由丙烯酸塑料铣削而成，其尺寸如下（单位：mm）：外径 34.5；内椭圆 20×9；外高 10；内高 1.5；桥接跨度 3×3；桥接间隙 1.5；入口和出口各为 4×4。</li>
			<li>将插入物放入培养皿中（图2A-B）并使用两个 0.15 固定在显微镜载物台顶部&#160;至0.2克的油灰状黏土，压制成1.2 × 0.3 × 0.1 cm的矩形块（图2A-C).</li>
			<li>使用塑料移液管，缓慢将细胞外液加入培养皿的一侧（入口），同时从另一侧（出口）吸出液体。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>选项2：若无定制塑料插件，可使用移液管从培养皿的一侧（入口）加入细胞外溶液，同时从对侧（出口）吸出液体。缓慢旋转移液管的位置，例如， 从北到东再到南，同时在对侧镜像放置抽吸针的位置例如， 南至西至北。</li>
		<li>选项3：在步骤1.3.3中将细胞外基质包被于矩形盖玻片上，并在步骤4.4中将细胞悬液接种于这些盖玻片上。随后将该盖玻片转移至盛有细胞外溶液的矩形记录 chamber 中，省略步骤5.1，跳过步骤5.3。使用塑料移液管以细胞外溶液冲洗 chamber，操作同选项1（5.2.1.3）所述。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将培养细胞的培养皿重新安装到倒置显微镜上方的载物台上（图2D将EC细胞培养物在室温下孵育于无血清的细胞外溶液中。</li>
	<li>4小时后，用上述细胞外溶液再次冲洗培养物。随后进行全细胞电生理记录。</li>
</ol>
6. 原代培养EC细胞的全细胞电生理记录
<ol>
	<li>实现全细胞吉欧封接
	<ol>
		<li>拉制一打电极，使其电阻达到1–5 MΩ。 
		注意事项：电阻为1–2 MΩ、可形成10–100 GΩ封接的移液管性能最佳。电极尖端无需进行火焰抛光即可获得GΩ级封接。</li>
		<li>用聚合物均匀包被所有移液管的锥形前端。将移液管保持水平于地面，并垂直于热风枪前端。缓慢旋转移液管，直至聚合物硬化。</li>
		<li>将细胞内液分装至15 mL锥形管中。用1 mL注射器吸取1.2 mL该溶液，转移至1.5 mL微量离心管中。再用同一注射器吸取0.7 mL细胞内液。排出注射器末端的空气。将一根34 G、67 mm的柔性针头连接至注射器，并冲洗针头中残留的空气。</li>
		<li>识别一个未与其他细胞或碎片接触的 Tph1-CFP+ 细胞。</li>
		<li>用细胞内液填充电极尖端。使用注射器从后方填充移液管。用指甲轻轻弹击移液管，以排除气泡界面。</li>
		<li>将装有0.3 mL空气的活塞抽吸到位后，将6 mL注射器连接至固定管的出口。将电极安装到固定器中。 
		注意：在电极进入浴液之前，应先将注射器连接至导管，以在封接前维持细胞内液的中性或正压。</li>
		<li>加载一个两步电压钳制程序，第一步通过电压梯度记录稳态激活电流，第二步通过单一电压记录可用电流。打开封接测试（5 mV，50 kHz）。</li>
		<li>将电极浸入灌流液中。使用显微操作器，将电极尖端移动至与细胞处于同一平面且正对细胞的水平位置。排出注射器中的0.3 mL空气。</li>
		<li>轻轻沿x轴水平移动电极以接触细胞。观察内皮细胞表面是否出现凹陷，和/或封接测试中膜电阻是否升高。如有必要，沿z轴轻微下调电极和/或沿x轴水平微调，但不要越过细胞中线。</li>
		<li>在6 mL注射器上施加0.1–0.2 mL的负压。保持推杆稳定，直至电阻达到100 MΩ，然后松开对推杆的握持。等待细胞形成吉欧封接（giga-seal）。轻轻旋转拆下注射器。 
		注意：如果内皮细胞（EC）最初未能形成封接，可能可以通过再次尝试重新封接。为此，需轻轻将电极从内皮细胞（EC）上移开，并进行后续操作。 &#60;20 MΩ 封接电阻。使用显微操作器操控已用过的电极，绕开目标内皮细胞，手动清除周围基质或碎片。随后，用新的电极尝试对内皮细胞进行封接。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录全细胞电压门控钠通道电流+ 电流
	<ol>
		<li>连接一支含有0.5–1.0 mL空气的3 mL注射器。在3 mL注射器上施加一次快速抽吸（0.1–0.5 mL）。重复此操作，直至获得全细胞记录模式，然后轻柔地取下注射器。 
		注意：由于注射器的性能在初始使用时可能存在差异，并会随着时间推移和使用次数增加而逐渐变化，因此请事先使用3 mL注射器进行练习（用食指封住末端），确保推杆回弹位置与起始位置相差在0.1–0.2 mL范围内。若不符合此标准，则应更换为新的注射器。</li>
		<li>打开全细胞电容补偿。调节电容和串联电阻。开启串联电阻补偿。将延迟设为60 ms，先调节预测的串联电阻补偿，再调节校正后的串联电阻补偿。关闭封接测试。</li>
		<li>记录全细胞电压门控钠通道的平均5次运行数据+ 电流图3A).</li>
		<li>快速记录电压门控Na通道的两个参数+ 电流：窗口电流处的电压（图3B，红色符号表示稳态激活与失活曲线的交点）以及峰值Na+ 电流密度 
		注意：具有峰值 Na 的 EC 细胞+ 在电压钳模式下，电流超过 -50 pA 通常会在电流钳模式下引发动作电位。此外，在电压钳模式下，电流大于 -200 pA 时（图3A）随后通常在电流钳制模式下，从膜电位（红线， 图3D）接近窗电流电压时（红色符号， 图3B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录诱发电位
	<ol>
		<li>关闭串联电阻补偿。关闭外部指令。将模式从电压钳切换到电流钳。调节增益。加载一个事件性电流钳协议。将保持电流调节至 0 pA。开启外部指令。 
		警告：在切换电压钳（V-clamp）与电流钳（I-clamp）模式时，必须先关闭外部指令信号，否则不得进行模式切换。</li>
		<li>记录静息膜电位。调节钳制电流输入，使膜电位读数低于窗口电流（window current）的阈值。例如， -80 至 -100 mV）。调整片段式电流钳制程序，使电流输入的步进间隔小于保持电流的数值。图3C 插图，+2 pA步阶，保持电流为-3 pA。</li>
		<li>记录诱发电位。注意引发动作电位所需的最小注入电流（图3C，5次扫描中的第3次，从-3 pA的保持电流施加+4 pA阶跃，即+1 pA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录自发性动作电位。
	<ol>
		<li>关闭外部指令。加载无间隙（非片段式）电流钳制程序。 
		注意：在确认无间隙电流钳协议中的持留电流大小对细胞合适之前，切勿重新打开外部指令。</li>
		<li>将维持电流调整为诱发电位协议中未引发动作电位的最后一次扫描所注入的电流值图3D，第二次扫描期间的输入电流，即从 -3 pA 的保持电流增加 +2 pA 步阶，等于 -1 pA。</li>
		<li>打开外部指令。仔细检查预测的钳制电流是否使膜电位低于产生动作电位的阈值，必要时调整钳制电流。记录自发性活动。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

要完全理解肠嗜铬细胞（EC细胞）的功能，需要一种高质量的原代培养方法，以获得适用于全细胞膜片钳电生理实验的细胞。传统上，胃肠道上皮细胞的原代培养因细胞存活率低而存在困难。本方法克服了这一干扰因素，能够从小肠或大肠组织中分离出单个EC细胞，并使其存活数天。
我们发现，以下因素对于提高培养物质量以适用于电生理学实验至关重要：（1）将黏膜翻转而非剥离，（2）在消化液中添加少量 BSA 及在培养液中添加 FBS，（3）降低 XI 型胶原酶的浓度，（4）调整机械振荡的持续时间与强度以增加单细胞的数量和活力，（5）以较低浓度包被细胞外基质，以及（6）添加 ROCK 抑制剂进行培养。
类似地，在进行膜片钳实验以获得完整细胞时，以下改进措施至关重要：（1）用无血清的细胞外溶液彻底冲洗培养物；（2）让肠嗜铬细胞在细胞外溶液中静置至少4小时；（3）将已使用过的电极（如形成封接失败的电极）重新利用，以清除通向下一个肠嗜铬细胞路径上的碎片；（4）在细胞外溶液中添加10 µM Gd3+，以阻断漏电流（如果存在），并促进哺乳动物细胞...

胃肠道（GI）上皮由多种细胞类型组成，是一个多样化的细胞群。肠内分泌细胞约占所有上皮细胞的1%，而肠嗜铬（EC）细胞是数量最多的肠内分泌细胞亚群1。近期研究表明，肠内分泌2和EC3,4细胞具有电兴奋性。我们致力于研究原代EC细胞的电生理特性。因此，本研究的目的是建立适用于全细胞电生理记录的优化原代EC细胞培养体系。
目前已有的肠嗜铬（EC）细胞系能够产生并分泌5-羟色胺（5-HT）（例如，&#160;QGP-15、BON6、KRJ-17），并已被用于研究电生理学特性5,8，但这些细胞系通常来源于永生化的肿瘤组织。尽管从这些细胞系获得的信息具有重要价值5,8，但仍需开展对原代细胞的电生理学研究，才能更准确地理解EC细胞的生理功能。对原代EC细胞进行电生理学研究需要分离并培养单个上皮细胞，然而上皮细胞培养的存活率较低，限制了相关研究的开展。
本研究中介绍的培养方法依赖于表达荧光标记肠嗜铬细胞的转基因小鼠，例如本研究所使用的 Tph1-CFP9。该方法优化了先前建立的混合原代上皮细胞培养体系2,10，以适用于单细胞电生理学研究3。以往的方法采用胰蛋白酶/EDTA联合胶原酶A，或EDTA与DTT组合进行酶消化，并利用密度梯度法特异性分离和培养豚鼠11及大鼠的肠嗜铬细胞12。最近，有研究通过生成肠道类器官并进行机械性解离，用于电生理记录4。尽管这些方法所获得的细胞培养物适用于5-羟色胺释放实验和RT-qPCR分析，且理论上也可用于电生理学研究，但其依赖于耗时较长的类器官生成过程、依赖密度梯度来识别肠嗜铬细胞，且受到胰蛋白酶和EDTA对细胞结构破坏效应的限制。相比之下，本文所述方案改进了酶消化与机械处理步骤，优化了培养条件，并简化了操作流程，从而获得单个且健康的肠嗜铬细胞，满足电生理学实验对细胞质量的高标准要求。
该方法适用于希望在混合培养物中研究原代EC细胞而非永生化细胞，并探究单个细胞电生理特性的科研人员。然而，该方法可能不太适合需要进行细胞分选或需要超过72小时长期培养存活的细胞群体研究。

<table><tbody><tr><td>100 mm × 15 mm 培养皿</td><td>Corning (Falcon)</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>Corning (Falcon)&amp;nbsp;</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形离心管</td><td>Corning (Falcon)&amp;nbsp;</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形离心管</td><td>Corning (Falcon)&amp;nbsp;</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>1,000 µL 带滤芯移液器吸头</td><td>Thermo Scientific (Art)</td><td>2079E</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>MatTek 玻底培养皿</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>显微解剖镊子——极细、超长尖端</td><td>Fine Science Tools</td><td>SB12630M</td><td></td></tr><tr><td>手术剪刀——锋利型</td><td>Nasco</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>显微解剖剪刀</td><td>Nasco</td><td>SB46568M</td><td></td></tr><tr><td>Monoject 低容量注射针头，21 G × 1&quot; A，每盒100支</td><td>Covidien</td><td>8881250172</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Tg(Tph1-CFP)1Able/J 小鼠</td><td>Jackson</td><td>库存编号 # 028366</td><td>使用4至7周龄的雄性或雌性小鼠</td></tr><tr><td>Microfil 非金属注射器针头（34号，67 mm）</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm &quot;M&quot; 实验室封口膜</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R6101</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 mL 带标准鲁尔接头的注射器</td><td>Monoject</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 mL 带标准鲁尔接头的注射器</td><td>Monoject</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;电生理设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>数据采集系统（daq）</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>信号调节器</td><td>Molecular Devices</td><td>CyberAmp 320</td><td></td></tr><tr><td>软件</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.6</td><td></td></tr></tbody></table>

原代培养小鼠肠嗜铬细胞的全细胞膜片钳电生理学

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

胃肠道（GI）上皮中的肠嗜铬（EC）细胞是肠内分泌细胞中数量最多的亚群。作为特化的感受细胞，EC细胞能够感知管腔内的刺激，并将其转化为5-羟色胺（5-羟基色胺，5-HT）的释放事件。然而，这些细胞的电生理特性尚不明确，因其难以培养且不易识别。本文介绍的方法建立了一种优化用于单细胞电生理研究的原代EC细胞培养体系。该方案利用一种转基因的青色荧光蛋白（CFP）报告系统，在混合的原代培养细胞中识别小鼠EC细胞，从而改进了在电压钳和电流钳模式下获取高质量全细胞电生理记录的技术途径。

培养物： 
来自转基因 Tph1-CFP 模型的原代小鼠上皮细胞在 4 小时后贴附于培养皿，24 至 72 小时之间即可用于生理学实验。在培养条件未优化时，上皮细胞培养物呈现大块细胞团、漂浮的细胞碎片、破损的细胞膜，以及肠嗜铬细胞中微弱的 CFP 信号（图 1A）。经优化用于电生理实验的培养物则主要由单个细胞和小团细胞组成。健康的肠嗜铬细胞可通过明亮的 CFP 荧光轻松识别，并在剧烈洗涤后仍牢固贴附于培养皿表面（图 1B）。
电生理学 
在未添加ROCK抑制剂的结肠培养物中，仅在15 ± 4%的尝试中获得了EC全细胞（22个培养物共182次尝试中获得29个全细胞），而在添加ROCK抑制剂的...

肠嗜铬（EC）细胞是胃肠道上皮细胞中的一个小亚群。EC细胞具有电兴奋性并可释放5-羟色胺，然而由于在培养和鉴定EC细胞方面存在困难，其生理学研究受到限制。本文所介绍的方法建立了一种适用于通过电生理学技术对单个EC细胞进行检测的原代培养模型。

胃肠道（GI）上皮中的肠嗜铬（EC）细胞构成了肠内分泌细胞中最大的亚群。作为特化的感觉...

该方法有助于回答肠神经系统和胃肠道生理学中的关键问题，例如：肠嗜铬细胞兴奋性及其对管腔刺激反应的机制是什么？胃肠道激素释放的机制又是什么？该技术的主要优势在于，它使我们能够利用单细胞技术（如电生理学）对肠嗜铬细胞进行深入研究。本实验步骤将由共同第一作者 Kaitlyn Knutson 和 Peter Strege 演示，他们是在开发这些技术方面表现出色的技术专家。开始此操作时，将装有冰冻 PBS 的 6 毫升注射器针头插入已提取的肠段管腔中。使用显微解剖镊子夹紧并封闭针头周围的肠组织，然后轻柔地将 6 毫升 PBS 缓冲液冲洗通过管腔，以去除任何粪便残留物。接下来，将显微解剖镊子轻轻插入管腔内，夹住一段肠壁，并将镊子尖端近端的组织向外翻转，从而完成肠组织的翻转。重复此步骤，直至组织段呈内面外翻，管腔朝外。使用显微解剖剪将组织段剪成一厘米长的小段，然后将组织段转移至一个盛有五毫升无菌 PBS 的 50 毫升烧杯中。随后，将组织块切碎至液化状态。将切碎的组织与15毫升冰浴PBS转移至一个洁净的50毫升离心管中。使用移液管吹打混匀两次。等待组织沉淀。随后，移除15毫升PBS上清液，并加入新鲜的PBS。重复此步骤三次，直至PBS变为澄清。进行第一次消化时，从水浴中取出一个含有10毫升预热消化液的50毫升离心管。接着，向装有剪碎肠组织片段的离心管中加入250微升PBS胶原酶溶液。最后，将剪碎的肠组织片段加入消化液和PBS胶原酶溶液中。然后，将样品置于37摄氏度的水浴中5分钟。用一支10毫升的血清移液管缓慢地对组织进行一次滴定，并让组织块短暂沉降。使用移液管移除10毫升上清液。进行第二次消化时，向组织中加入250微升PBS胶原酶溶液，并将其置于37摄氏度的水浴中。随后，用10毫升血清移液管缓慢吹打溶液一次。然后移除10毫升上清液。进行第三次消化时，在试管中加入 250 微升 PBS 胶原酶溶液。将其置于 37°C 水浴中 10 分钟。然后以比第一次和第二次消化更高的强度，每分钟振荡试管两到三次。随后，使用10毫升血清移液管缓慢地将组织上下吹打几次，并让组织块短暂沉降。转移10毫升上清液至新的15毫升离心管中。加入2毫升预热的EC细胞完全培养基，轻轻倒置一次以混匀。接着，在室温下以 100 ×g 离心样品 5 分钟。5 分钟后，弃去上清液，并将剩余的沉淀物重悬于 2.5 毫升预热的 EC 细胞完全培养基中。进行第四次消化时，重复消化步骤，但结肠的孵育时间延长 15 分钟，空肠则保持 10 分钟不变。培养细胞时，使用移液管将第三次和第四次消化收集的细胞悬液合并到一个新的15毫升离心管中。取10微升细胞悬液，用血细胞计数板进行计数。然后在室温下以100 ×g离心5分钟，沉淀剩余的细胞悬液。五分钟后，移除上清液，并使用5毫升移液管加入完全EC细胞培养基，调整细胞密度为每毫升一百

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

原代培养小鼠肠嗜铬细胞的全细胞电生理

Kv 通道功能障碍与心律失常相关。为了研究导致此类心律失常的分子机制，我们采用一种系统性方案，从 Kv...

小鼠心房与心室心肌细胞的分离及Kv通道记录

精氨酸加压素（AVP）通过促进肾集合管主细胞对水的重吸收，调控机体水平衡的精细调节。本文介绍一种适用于研究AVP介导的水重吸收分子机制的原代大鼠肾髓质内层集合管细胞的培养方案。...

原代大鼠髓质内集合管细胞培养

我们展示了一种用于直接研究肠神经系统中神经元和胶质细胞组分的细胞培养方案。该方法通过取自成年小鼠肌间神经丛的神经元/胶质细胞混合培养，在盖玻片上建立培养体系，从而能够利用电生理学、免疫组织化学等方法对单个神经元和胶质细胞的功能进行检测。 等等.

一个 体外 成年小鼠肌间神经丛分离肠神经元和胶质细胞的制备

本视频演示了一种在单根神经纤维上进行电生理记录的实验方案 体外 小鼠结直肠-神经制备...

体外 小鼠结直肠传入末梢的功能表征

一旦神经组织被从体内取出，其会受到环境条件的显著影响，导致在6至8小时后逐渐降解。通过一种独特的孵育方法，可对组织的细胞外环境进行密切监测和精确调控，从而将组织活性显著延长至&gt;24小时。...

延长急性神经组织孵育时间用于电生理学和钙成像

本方案描述了小鼠小肠混合细胞的分离与培养方法。这些原代肠道细胞培养物可用于通过多种技术研究介导肠肽分泌的信号通路。...

用于研究肠道激素分泌及肠内分泌细胞活体成像的小鼠小肠混合原代培养

我们介绍一种结合细胞分离与全细胞膜片钳记录的技术方案，用于测定大鼠附睾尾部原代分离的上皮细胞的电生理特性。该方案可用于研究原代附睾上皮细胞的功能特性，从而进一步阐明附睾的生理作用。...

从附睾分离的原代上皮细胞的全细胞膜片钳记录

我们介绍一种采用两步酶解法从人膀胱标本中分离单个新鲜逼尿肌平滑肌细胞的方法。所获得的有活力的逼尿肌细胞可通过多种单细胞技术进行研究，包括文中所述的两性霉素B膜片钳电生理学技术，以揭示其生理学和药理学特性。...

新鲜分离人膀胱逼尿肌平滑肌细胞的制备与应用：用于表征9-苯并蒽酚敏感性阳离子电流

关键词：膀胱逼尿肌，平滑肌细胞，新鲜分离，9-苯并蒽酚，阳离子电流，电生理学，膜片钳技术

我们介绍了分离小鼠心肌细胞的方法，以及如何利用荧光光度法结合同时进行的数字细胞形态测量，同步获得动作电位或钙瞬变信号与肌节缩短信号。...

分离小鼠心室肌细胞的光学成像

本方案描述了一种共聚焦成像技术，用于检测牛肾上腺嗜铬细胞中的三种融合模式。这些融合模式包括：1）闭合融合（也称为“亲吻即走”模式），涉及融合孔的开放与关闭；2）持续融合，涉及融合孔的开放并维持孔道的开放状态；3）收缩融合，涉及融合囊泡的收缩。...

利用共聚焦显微镜测量肾上腺嗜铬细胞中融合孔动力学的三种模式

本研究概述了一种从猪的小肠和大肠来源的类器官生成二维单层细胞的方案。这些单层细胞的生长伴随着跨上皮电阻（TEER）值的升高，表明上皮完整性良好。此外，在Ussing室实验中，施加佛司可林后，这些单层细胞表现出生理性的分泌反应。...

二维猪肠道类器官反映原生肠道的生理特性

学习原代培养小鼠肠嗜铬细胞的全细胞电生理技术，用于研究肠道神经科学与胃肠激素释放机制。该方法通过单细胞电生理记录深入解析EC细胞兴奋性及其对管腔刺激的反应。

原代培养小鼠肠嗜铬细胞的全细胞膜片钳电生理学

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