Name: 基于板块的秀丽线虫规模化栽培: 糖尿病代谢变化研究的样品制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: 学习基于固体培养基的秀丽线虫规模化培养方法，用于糖尿病代谢变化研究中的样品制备。该方案通过同步化种群和M九缓冲液处理，实现大样本量收集与可重复性蛋白分离，为发育生物学和神经科学研究提供可靠技术支持。

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本研究由德国研究基金会（DFG）在IRTG 1874项目内资助 &#34;糖尿病微血管并发症&#34; 和结直肠癌1118 &#34;活性代谢物作为糖尿病晚期并发症的原因&#34;. 秀丽隐杆线虫 菌株 N2 和 CL2166 由 CGC 提供，CGC 由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助。

注意：本方案分为五个部分。在第1至第3部分中，为主培养方案 秀丽隐杆线虫 大规模培养方案已呈现。第4和第5节提供了针对糖尿病相关代谢物中典型代谢物检测的附加实验方案。具体而言，第1节描述了基于培养板的通用大规模培养方法；第2节重点介绍了大量样品的转移操作 秀丽隐杆线虫而第3节介绍了大规模样品的收获，第4节说明了样品中蛋白质的分离，第5节描述了后续液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析的样品制备。
1. 培养皿中的大规模培养
<ol>
	<li>通常在无菌操作台内或靠近火焰旁操作，以避免污染。</li>
	<li>为了将线虫培养至年轻成虫阶段，请遵循此先前发表的方案7 并作如下调整。
	<ol>
		<li>使用活体 大肠杆菌 用于喂养线虫的OP50细菌，以及为实验准备400 µM氟脱氧尿苷琼脂（非氨苄青霉素/FUdR）。</li>
		<li>为制备同步化种群，使用未浓缩的OP50；在后续成虫实验中，通过去除70%上清液，使用3.3倍浓缩的OP50。</li>
		<li>建议每日定时喂食。在评估氧化应激时，不同的喂食间隔和喂食量可能会影响实验结果。</li>
		<li>接种时，取一块含有多个线虫的平板，将其切成约 0.5 x 1 cm 的小片2 用解剖刀切取两到三块，转移至直径为60 mm、含有未浓缩OP50的大肠杆菌的线虫生长培养基（NGM）平板上。</li>
		<li>将培养皿置于适合该品系的温度下孵育（野生型N2应在20 °C下培养），直至在培养皿上可见卵。</li>
		<li>洗去大部分卵和成体动物&#160;用2 mL M9缓冲液重悬并收集至15 mL离心管中。将悬液在800 x g 2 分钟。同时，开始配制漂白液。</li>
		<li>取出离心管，用10 mL移液器吸除M9缓冲液。加入10 mL漂白液，涡旋混匀，直至成年线虫完全裂解。此过程通常约需5–7分钟，但不应超过15分钟，否则后续实验中卵将无法充分发育。</li>
		<li>将悬液在800 x g 2分钟。用10 mL M9缓冲液洗涤3次，以去除卵子上的漂白液。</li>
		<li>现在在 OP50 平板上加入 150 µL 卵悬浮液，每个平板应达到 200–300 个卵的密度。等待线虫发育至成虫阶段。 
		注意：图示实验所用的M9缓冲液（pH 7.0）包含以下物质：22 mM KH2PO4，42 mM Na2HPO4，以及 86 mM NaCl。将混合物高压灭菌后，加入 1 mM MgSO4。漂白液包含 0.5 M NaOH 和 2.3 mM NaOCl，溶于蒸馏水中。</li>
		<li>准备无菌M9缓冲液、尖端剪开的无菌移液器吸头用于冲洗线虫，以及15 mL离心管用于收集线虫。</li>
		<li>在平板上加入约 1 mL M9 缓冲液，&#160;轻轻晃动以分配缓冲液，并用移液器轻柔吹打&#160;线虫从培养皿上脱落。</li>
		<li>现在，将线虫收集到离心管中。用剪去尖端的移液器吸头吸取150 µL悬浮液，直接加到已接种OP50的培养板上，并在显微镜下评估线虫密度（建议：每60 mm培养板接种50–100条线虫）。</li>
		<li>如果悬液过浓，用M9缓冲液稀释，并在显微镜下观察，直至达到理想密度。如果收获量过少，让线虫自然沉降，或以800 × g离心悬液10秒。 g 去除液体。 
		注意：充分密度的一个示例如下所示 图1A （宏观）和 1B （显微镜下）20倍放大观察。按所述方法进行经验性操作。</li>
		<li>请注意，线虫会迅速沉降。为确保各培养皿间虫体分布均匀，每处理一叠培养皿（4–5个）后，需将管子颠倒混匀一次。 
		注意：使用剪去尖端的移液管吸头，以及轻柔振荡和洗涤培养板，可降低剪切应力。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 大量转移Caenorhabditis elegans
<ol>
	<li>用约 500 µL M9 缓冲液冲洗线虫，具体用量根据平板的年龄和干燥程度而定。使用相同的缓冲液重复冲洗，直至大部分线虫被收集到&#160;悬浮液</li>
	<li>用剪切过的移液器吸头缓慢吸取线虫，转移至已涂布OP50的培养皿上。让培养皿自然晾干。 
	注意：切勿加入超过推荐体积的液体。尤其在长期实验中，培养板可能无法承受过多液体，导致琼脂破裂，使线虫钻入裂缝中。</li>
</ol>
3. 大量收获 秀丽隐杆线虫 样本
<ol>
	<li>根据所选方法，使用足量的 C. elegans 开始实验。进行 LC-MS/MS 分析时，每组准备 20 个培养板（60 mm × 15 mm），每个板上约含 100 条线虫，以确保每个样本获得至少 200 µg 的蛋白质。 
	注意：&#160;本步骤无需在无菌条件下操作，因为线虫将被收集并冷冻。&#160;</li>
	<li>在样品采集当天，准备好液氮用于快速冷冻收集的样品。将非无菌 M9 缓冲液置于冰上，以减缓线虫的新陈代谢。</li>
	<li>通过加入 1 mL M9 缓冲液并轻轻旋转培养板，将 C. elegans 从板上冲洗下来。此操作可避免收集到死亡的线虫及大部分虫卵（如有），因为它们会黏附在细菌和琼脂上。</li>
	<li>吸取液体体积并转移至 15 mL 离心管中。</li>
	<li>完成全部样品收集后，静置使线虫沉淀，或在 800 × g 条件下短暂离心，并去除大部分 M9 缓冲液。用约 10 mL M9 缓冲液（约为样品体积的 10 倍）洗涤样品 3 次，以去除所有细菌。 
	注意：为确保彻底去除死亡线虫，可选择蔗糖漂浮法。然而，在本展示实验中该方法不适用15。蔗糖会水解为葡萄糖和果糖。在本实验中，研究目的是评估葡萄糖在慢性糖尿病相关生化改变中的作用，因此使用蔗糖漂浮法可能干扰实验结果。</li>
	<li>为每个样品准备一个含有 1 mL M9 缓冲液的 1.5 mL 离心管和一个空的 1.5 mL 离心管。使用玻璃移液管&#160;将沉淀从 15 mL 离心管转移至空的 1.5 mL 离心管中。此步骤至关重要，以确保定量转移。 
	注意：与之前步骤不同，此处线虫浓度更高。由于塑料移液管&#160;吸头可能存在黏附现象，可能导致大量样品损失。因此，应使用玻璃移液管。</li>
	<li>转移完成后，使用玻璃移液管从第二个 1.5 mL 离心管中吸取 1 mL M9 缓冲液，冲洗移液管壁上的线虫。同时，将残留在 15 mL 离心管中的线虫冲洗并转移至样品管中。</li>
	<li>将样品管在 19,000 × g 条件下离心 1 分钟，然后尽可能去除上清液。</li>
	<li>用封口膜密封离心管，并立即在液氮中快速冷冻。将样品管保存于 -80 °C，直至进行裂解液制备。</li>
</ol>
4. 用于质谱分析的蛋白质分离
注意：此处所述的蛋白质分离方法也可用于其他检测（例如，蛋白质印迹）。
<ol>
	<li>向冷冻样品中加入等体积的0.5 mm氧化锆&#160;珠粒，以及至少2倍体积&#160;的含有蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液。 
	注意：图示的线虫-蛋白相关性分析使用了100 µL缓冲液。LC-MS/MS样品则使用200 µL缓冲液进行裂解。</li>
	<li>以9号速度启动匀浆器，持续1分钟。确保样品完全裂解。若裂解不完全，重复此步骤。</li>
	<li>在4 °C条件下，以19,000 × g离心30分钟。将上清液转移至冰上的新离心管中，并在-80 °C保存，直至进行后续检测。 
	注意：图示实验所用的非变性缓冲液包含以下成分：20 mM Tris HCl（pH 8）、137 mM NaCl、1% Triton-X和2 mM EDTA。 
	注意：按照本方案步骤并采用建议的规模操作后，约1,000条线虫可获得约500 µg的蛋白沉淀。更多比较信息请参见图2和代表性结果部分。</li>
</ol>
5. 液相色谱-串联质谱检测的样品制备
注意：根据所关注的参数不同，样品制备方法也会有所不同。本方案重点针对甲基乙二醛和晚期糖基化终末产物（AGE）的测定。
<ol>
	<li>采用邻苯二胺（DB）衍生化法测定细胞内甲基乙二醛，方法如前所述9。
	<ol>
		<li>在1.5 mL离心管中，将样品与20 µL预冷的20%（wt/vol）三氯乙酸、0.9%（wt/vol）氯化钠及80 µL水混合匀浆。</li>
		<li>向样品中加入5 µL内标（13C3-MG；400 nM），涡旋混匀，随后在4 °C下以21,000 × g离心5分钟。</li>
		<li>将35 µL上清液转移至含有200 µL玻璃插件的HPLC样品瓶中。</li>
		<li>每份样品中加入5 µL 3%叠氮化钠（wt/vol），随后加入10 µL含0.5 mM二乙烯三胺五乙酸（DETAPAC）的0.5 mM DB盐酸溶液（200 mM HCl，溶于水）。</li>
		<li>将样品在室温下避光孵育4小时。</li>
		<li>采用LC-MS/MS分析样品，方法如前所述9。 
		注：如需测定晚期糖基化终末产物（AGEs），请按照本方案第4节所述方法分离蛋白质。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用Bradford法测定（解冻后）裂解液的蛋白浓度10。
	<ol>
		<li>配制含牛血清白蛋白（BSA）的标准曲线样品，用磷酸盐缓冲液（PBS）将BSA稀释至以下浓度：0；0.1；0.2；0.3；0.4；0.6；0.8；和1.0 mg/dL，每份取30 µL备用。 
		注：若样品按推荐体积制备（参见步骤4.1中使用200 µL缓冲液制备裂解液），预计蛋白浓度约为2–7 mg/mL。此时，应在测定前用PBS将样品稀释1:10。 
		注：首次使用该方法时，建议对样品进行不同稀释度（1、1:10和1:100）的测定。由于线虫数量无法精确确定，不同研究人员之间的蛋白得率可能存在差异。</li>
		<li>使用透明的96孔板（聚苯乙烯材质），将各标准品及按选定稀释度处理的样品各取10 µL，每组设两个复孔，加入相应孔中。</li>
		<li>将蛋白测定染料试剂浓缩液用蒸馏水（aq. dest.）按1:5稀释，每孔加入200 µL稀释后的试剂，室温孵育10分钟。</li>
		<li>在30分钟内使用酶标仪于595 nm波长处测定吸光度，根据标准曲线对样品浓度进行插值计算。该方法的更多细节已在文献中广泛描述10。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞内晚期糖基化终末产物（AGEs）的测定方法如前所述11,12。
	<ol>
		<li>将总蛋白提取物（约200 µg）用10 kDa超滤离心管，在水中通过超速离心洗涤3次。</li>
		<li>向回收的蛋白样品（约100 µL）中加入10 µL 100 mM HCl、10 µL胃蛋白酶（2 mg/mL，溶于20 mM HCl）和10 µL百里酚（2 mg/mL，溶于20 mM HCl），37 °C孵育24小时。</li>
		<li>加入12.5 µL 0.5 M磷酸钾缓冲液（pH 7.4）和5 µL 260 mM KOH，将样品中和并调节至pH 7.4。</li>
		<li>加入10 µL蛋白酶E [2 mg/mL，溶于10 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）] 和10 µL青霉素-链霉素溶液，37 °C孵育24小时。</li>
		<li>加入10 µL氨肽酶 [2 mg/mL，溶于10 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）] 和10 µL脯氨酰二肽酶 [2 mg/mL，溶于10 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）]，37 °C孵育48小时。</li>
		<li>采用LC-MS/MS分析所得水解产物，方法如前所述12。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fronius, M., Clauss, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-sensitivity+of+ENaC%3A+may+the+%28shear%29+force+be+with+you%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%22%5BJournal%5D)">Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you.</a> Pflügers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html">http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html</a> (2006).</li>
<li>Altun, Z. F., Hall, D. H. Nervous system, general description. WormAtlas. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.wormatlas.org/hermaphrodite/nervous/Neuroframeset.html">http://www.wormatlas.org/hermaphrodite/nervous/Neuroframeset.html</a> (2011).</li>
<li>Sohn, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+neurodegeneration+may+precede+microvascular+changes+characteristic+of+diabetic+retinopathy+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Retinal neurodegeneration may precede microvascular changes characteristic of diabetic retinopathy in diabetes mellitus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (19), E2655-E2664 (2016).</li>
<li>Chilelli, N. C., Burlina, S., Lapolla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGEs%2C+rather+than+hyperglycemia%2C+are+responsible+for+microvascular+complications+in+diabetes%3A+a+%26%2334%3Bglycoxidation-centric%26%2334%3B+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition%2C+Metabolism+%26+Cardiovascular+Diseases%22%5BJournal%5D)">AGEs, rather than hyperglycemia, are responsible for microvascular complications in diabetes: a &#34;glycoxidation-centric&#34; point of view.</a> Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases. 23 (10), 913-919 (2013).</li>
<li>Schlotterer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+as+model+for+the+study+of+high+glucose-+mediated+life+span+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">C. elegans as model for the study of high glucose- mediated life span reduction.</a> Diabetes. 58 (11), 2450-2456 (2009).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152(2009).</li>
<li>Leiers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stress-responsive+glutathione+S-transferase+confers+resistance+to+oxidative+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">A stress-responsive glutathione S-transferase confers resistance to oxidative stress in Caenorhabditis elegans.</a> Free Radical Biology and Medicine. 34 (11), 1405-1415 (2003).</li>
<li>Rabbani, N., Thornalley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+methylglyoxal+by+stable+isotopic+dilution+analysis+LC-MS%2FMS+with+corroborative+prediction+in+physiological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measurement of methylglyoxal by stable isotopic dilution analysis LC-MS/MS with corroborative prediction in physiological samples.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1969-1979 (2014).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 7 (72), 248-254 (1976).</li>
<li>Ahmed, N., Argirov, O. K., Minhas, H. S., Cordeiro, C. A., Thornalley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+advanced+glycation+endproducts+%28AGEs%29%3A+surveying+AGEs+by+chromatographic+assay+with+derivatization+by+6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate+and+application+to+Nepsilon-carboxymethyl-lysine-+and+Nepsilon-%281-carboxyethyl%29lysine-modified+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Assay of advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with derivatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and application to Nepsilon-carboxymethyl-lysine- and Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified albumin.</a> Biochemical Journal. 364 (Pt 1), 1-14 (2002).</li>
<li>Thornalley, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+screening+of+advanced+glycation+endproducts+in+cellular+and+extracellular+proteins+by+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry.</a> Biochemical Journal. 375 (Pt 3), 581-592 (2003).</li>
<li>Karachalias, N., Babaei-Jadidi, R., Ahmed, N., Thornalley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+fructosyllysine+and+advanced+glycation+end+products+in+the+kidney%2C+retina+and+peripheral+nerve+of+streptozotocin-induced+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Accumulation of fructosyllysine and advanced glycation end products in the kidney, retina and peripheral nerve of streptozotocin-induced diabetic rats.</a> Biochemical Society Transactions. 31, 1423-1425 (2003).</li>
<li>Morcos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyoxalase-1+prevents+mitochondrial+protein+modification+and+enhances+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 7 (2), 260-269 (2008).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Screenable+In+Vivo+Assay+for+Mitochondrial+Modulators+Using+Transgenic+Bioluminescent+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53083(2015).</li>
<li>Takamiya, S., Mita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+purification+of+active+liquid-cultured+Caenorhabditis+elegans+using+a+modified+Baermann+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+International%22%5BJournal%5D)">Large-scale purification of active liquid-cultured Caenorhabditis elegans using a modified Baermann apparatus.</a> Parasitology International. 65 (5 Pt B), 580-583 (2016).</li>
<li>Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+systems+for+high-throughput+and+high-content+screening+using+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic systems for high-throughput and high-content screening using the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 17 (22), 3736-3759 (2017).</li>
<li>Zhu, G., Yin, F., Wang, L., Wei, W., Jiang, L., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+type+2+diabetes-like+hyperglycemia+in+C.+elegans+on+a+microdevice%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling type 2 diabetes-like hyperglycemia in C. elegans on a microdevice.</a> Integrative Biology. 8 (1), 30-38 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案介绍了一种用于大规模培养的可靠方法 秀丽隐杆线虫 以获得定量结果。文献中的研究发现可被重复验证，如图所示。 代表性结果. 尽管该大规模样本采集方案 秀丽隐杆线虫 看似是一种直接的方法，但有一些潜在问题需要注意。关于线虫群体的同步化，本方案描述了一种使用次氯酸钠和氢氧化钠进行漂白的方法，以杀死线虫并仅收获卵。需要注意的是，这种方法可能并不适用于所有实验。根据群体数量与漂白液体积的比例，漂白液的有害作用可能会影响胚胎的发育。15尤其是在研究发育过程时，这可能是一个关键步骤。在处理线虫时，整个实验过程中应尽可能减少剪切力的施加。若操作不慎，将导致大量线虫死亡。因此，离心时间和速度不得超出建议范围。在转移线虫时，应使用剪去尖端的移液枪头，以减少对线虫的损伤。转移线虫时，所用缓冲液体积不应超过推荐量，否则琼脂会因过湿而开裂，导致线虫钻入培养皿内部。在收集样品过程中，M9缓冲液必须始终保持冰上预冷，以减缓线虫的代谢速率，特别是在处理代谢物或底物时更应注意这一点。 秀丽隐杆线虫 会降解。彻底清洗样品以尽量减少先...

蛋白质分析（如蛋白质印迹或质谱分析）需要毫克级的蛋白质。要达到这一产量，需大规模培养数百份 C. elegans，可通过液体培养或在固体培养基上通过冲洗转移线虫来实现。液体环境及剪切应力可诱导上皮钠离子通道（ENaC）的表达，从而通过增加钠离子的摄取增强渗透压，可能改变 C. elegans 的寿命并影响代谢分析结果1。因此，本实验方案中基于平板培养的方法包含若干关键步骤，旨在减少应激反应，以降低实验变异性。另一方面，液体培养会影响线虫的表型，并使精确数量线虫的培养与收集变得复杂2。此外，活性物质可能被培养基成分改变，并在到达线虫前分布不均。鉴于液体培养的上述局限性，本方案提供了一种大规模培养 C. elegans 的替代方法。
C. elegans 是一种模式生物，具有由302个神经元细胞组成的独特神经网络，占其全部细胞的三分之一3。自其进入科学研究以来，已发现大量同源和直系同源基因，进一步提升了其作为医学研究模型的价值。最近有研究提出，在糖尿病视网膜病变中，神经功能损伤早于血管损伤出现4。C. elegans 虽无血管系统，但具备明确的神经网络，因此是研究非血管性神经改变的理想模型。因此，C. elegans 在探索糖尿病并发症普遍机制方面具有特殊意义。糖尿病并发症中的生化改变涉及晚期糖基化终末产物（AGEs）的形成，这些产物进一步影响高血糖条件下活性氧（ROS）的生成5。AGEs 在 C. elegans 中已被检测到，并可导致神经损伤6。慢性疾病通常由复杂的多基因过程引起，需要采用多参数方法来评估其潜在机制，本文以糖尿病并发症的评估为例说明了这一点。本实验方案可用于同时或依次获取多个参数。通过避免液体与固体培养基在形态和代谢上的差异，可提高多参数方法的可比性和可重复性。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;OP50</td><td>CGC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans &lt;/em&gt;N2</td><td>CGC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans &lt;/em&gt;CL2166</td><td>CGC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>培养皿，60 mm × 15 mm</td><td>Greiner One</td><td>628161</td><td></td></tr><tr><td>玻璃刻度移液管，10 mL</td><td>Neolab</td><td>E-0413</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合片剂</td><td>Roche</td><td>04693124001</td><td></td></tr><tr><td>&lt;u&gt;非变性裂解缓冲液：&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl，pH 8</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma</td><td>E5391</td><td></td></tr><tr><td>96孔板，透明底</td><td>Brand</td><td>781611</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200 酶标仪</td><td>Tecan</td><td>30017581</td><td></td></tr><tr><td>氧化锆珠，0.5 mm</td><td>Next advance</td><td>ZROB05-RNA</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender 匀浆器</td><td>Next advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>猪胃黏膜来源胃蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>百里酚</td><td>Sigma</td><td>T0501</td><td></td></tr><tr><td>链霉菌蛋白酶 E / 来源于&lt;em&gt;Streptomyces griseus &lt;/em&gt;的蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Sigma</td><td>P43339</td><td></td></tr><tr><td>猪肾来源脯氨酰二肽酶</td><td>Sigma</td><td>P6675</td><td></td></tr><tr><td>氨肽酶，来源于&lt;em&gt;Aeromonas proteolytica&lt;/em&gt;</td><td>Sigma</td><td>A8200</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 离心过滤装置</td><td>Merckmillipore</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>平板培养所需的基本材料详见参考文献&lt;sup class=&quot;xref">6&lt;/sup&gt;。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于平板的大规模培养 秀丽隐杆线虫糖尿病代谢改变研究的样本制备

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

在琼脂平板上大规模培养秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）可能耗时且困难。本实验方案描述了一种简单且低成本的方法，可用于获得大量线虫个体，以提取蛋白质并进行蛋白质印迹（western blot）、质谱分析或进一步的蛋白质组学研究。此外，该方法还可轻松实现线虫数量的增加，以满足免疫染色需求，并在相同培养条件下整合多种分析。同时，该方法也便于在不同实验条件的平板之间进行转移。常规的平板培养技术通常使用铂金丝转移单个C. elegans，或使用解剖刀转移带有线虫的琼脂块。然而，随着线虫数量的增加，这些方法变得极为耗时。本方案详细介绍了C. elegans的大规模培养流程，包含多个关键步骤，旨在最大限度地减少样品制备过程对线虫生理状态的影响。液体环境和剪切应力可能改变C. elegans的寿命及其代谢过程，因此必须详细描述关键操作步骤，以确保获得可靠且可重复的实验结果。C. elegans是一种模式生物，其神经元细胞可占细胞总数的三分之一左右，且缺乏血管系统，因此可用于独立于血管调控机制之外的神经元变化研究。近期研究发现，在糖尿病视网膜病变中，神经退行性改变早于血管结构的变化。因此，C. elegans在研究糖尿病并发症的普遍机制方面具有特殊意义。例如，在C. elegans中可观察到晚期糖基化终末产物（AGEs）和活性氧（ROS）的生成增加，这些现象在糖尿病模型中具有良好的可重复性。本文提供了适用于多种研究目的的大规模样品处理方案，并以糖尿病诱导的生化改变研究为例进行说明。总体而言，本方案适用于需要大量C. elegans且不适合采用液体培养的研究。

本文展示了用于糖尿病研究的大规模 C. elegans 培养的示例。在实验中，将参数与单个动物关联，而非归一化至总蛋白浓度，可能更具意义。在需要少量线虫的实验中，可通过直接计数线虫实现该目的。但对于每个实验组包含数百条线虫的大规模 C. elegans 培养而言，这种方法则不够便捷。图2 展示了 C. elegans 数量与蛋白含量之间的相关性。如图所示，采用本方案可实现可重复的定量蛋白提取。
Amadori加合物果糖基-赖氨酸是糖尿病实验动物模型中形成的多种晚期糖基化终末产物（AGE）前体之一13。图3展示了三次独立实验中，12日龄线虫经葡萄糖处理后及其年龄匹配的未处理对照组的LC-MS/MS检测结果。线虫样品加入200 µL裂解缓...

本方案描述了一种在固体培养基上大规模培养秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的方法。作为液体培养的替代方案，该方法可在基于培养皿的培养条件下获得不同规模的实验参数。通过消除液体培养与固体培养之间在形态学和代谢上的差异，提高了实验结果的可比性。

大规模在琼脂平板上培养秀丽隐杆线虫（C. elegans）可能耗时且困难。本方案描述了一种简单……

在秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究领域，该方法有助于回答一些关键科学问题，这些问题需要利用平板培养技术来产生大量线虫种群和样本。本实验方案的主要优势在于易于建立，且便于描述，包括其中的注意事项和应用范围。在获得同步化的线虫群体后，向平板中加入约一毫升 M9 缓冲液，并通过轻轻摇动平板使缓冲液均匀分布。此后，将线虫收集到一个15毫升的离心管中。然后将管子倒置，使用显微镜评估线虫的密度。根据需要调整悬浮液的密度，并继续在显微镜下进行评估。使用经过改造的移液枪头，将150微升悬浮液直接加到平板上。为确保线虫在各平板间均匀分布，需定期倒置悬浮液管。首先，用改造的移液枪头加入约500微升M9缓冲液清洗线虫。使用相同的缓冲液继续解离线虫，直到大多数个体被收集在悬液中。接着，用经过改造的移液枪头吸取线虫，并将其转移至含有OP50的培养皿中。由于改造后的移液枪头具有更大的直径，可减少剪切应力，从而降低对线虫的损伤。然后，让培养板自然干燥。在采集样品前，准备好液氮以快速冷冻收集到的线虫。随后，将M九缓冲液置于冰上。向每块平板加入一毫升 M9 缓冲液，轻轻摇晃以洗涤每块平板。然后吸出 M9 缓冲液，并转移至新的 15 毫升离心管中。在去除大部分 M9 缓冲液之前，先将离心管在 800 × g 条件下短暂离心。接下来，用10毫升M9缓冲液将样品清洗三次，以去除任何细菌。使用玻璃移液管将每个沉淀转移至一个空的1.5毫升离心管中。用玻璃移液管从第二个1.5毫升离心管中吸取1毫升M9缓冲液，冲洗移液管壁上的线虫。然后，用15毫升离心管冲洗残留的线虫，并将其转移至样品管中。接着，将样品管在19,000 ×g条件下离心1分钟，并尽可能吸除上清液。随后，用石蜡膜密封各管，并立即在液氮中快速冷冻。将试管在负80摄氏度下保存，直至进行裂解液制备。向每个冷冻样品中加入等体积的0.5毫米氧化锆珠以及两倍体积的含蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液。然后，将试管放入匀浆器中，在速度九的条件下匀浆一分钟。将样品在 4 摄氏度、19,000 × g 条件下离心 30 分钟。最后，将上清液转移至冰上的新离心管中，并于 -80 摄氏度保存，用于后续实验。在本实验方案中，培养了大量秀丽隐杆线虫（C. elegans），用于糖尿病研究的相关应用。收集的线虫数量与裂解液的蛋白得率呈正相关，表明使用本方案可实现可重复的定量蛋白质分离。本文展示了对活性代谢物甲基乙二醛及其暴露后形成的高级糖基化终产物进行的质谱分析结果。比较了葡萄糖处理的线虫与对照组。通过移液器转移线虫可能会产生剪切应力，从而对线虫造成损伤。根据本方案，使用移液器转移的线虫与使用金属丝转移的线虫在氧化应激水平上无差异。完成该操作后，可进一步进行如蛋白质印迹（western blot）等其他方法，以回答蛋白质组学中的其他问题。该方案还有助于开展将多个参数

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科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

基于板块的秀丽线虫规模化栽培: 糖尿病代谢变化研究的样品制备

我们介绍了在秀丽隐杆线虫（C.

一种用于淀粉样病变研究的 Caenorhabditis elegans 模式系统

我们在此介绍一种用于大规模培养胚胎的改进方案 秀丽隐杆线虫 细胞。胚胎 秀丽隐杆线虫 培养的细胞 体外 使用该方法，似乎能够以细胞特异性的方式分化并重现基因的表达。可对其他组织中特定细胞类型进行直接访问或分离的技术可应用于 秀丽隐杆线虫...

一种培养胚胎期 C. elegans 细胞的方法

本文中，我们介绍线虫Caenorhabditis...

秀丽隐杆线虫——一种多功能的模式生物 体内 研究宿主-微生物相互作用的模型

我们介绍了使用宽视场线虫追踪平台（WF-NTP）的实验方案，该平台可实现对大量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

大型动物自动化行为分析 秀丽隐杆线虫 使用宽视野追踪平台的群体研究

为了在组学研究中使用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans），需要一种能够培养大量线虫种群的方法，以便在同一份样品上进行多种平台的检测，实现比较分析。本文介绍了一种在大规模培养板（LSCPs）上培养C.

大规模混合阶段的培养与检测 秀丽隐杆线虫 种群

以下方案描述了一种高通量工作流程的建立与优化，用于线虫培养、荧光成像及自动图像处理，以定量多聚谷氨酰胺聚集物，从而评估蛋白质稳态的变化。...

自动化聚集体定量分析 秀丽隐杆线虫

本文介绍了一种在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

Caenorhabditis elegans 作为发现抗多聚谷氨酰胺介导神经毒性的生物活性化合物的模型系统

肠道微生物可能对宿主的健康产生正面或负面的影响 通过 特异性或保守性机制 秀丽隐杆线虫 是一种用于筛选此类微生物的便捷平台。本实验方案描述了对48种细菌分离株进行高通量筛选，以评估其对线虫应激抗性的影响，该指标被用作线虫健康状况的替代参数。...

高通量筛选影响微生物分离物 秀丽隐杆线虫 健康

本方案描述了一种通过手工分离成年秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

手部解剖 秀丽隐杆线虫 肠道

本文展示了一种在微加工多孔装置中的固体培养基上培养分离的单个线虫的优化方案。该方法可对单个动物整个生命周期内的多种与衰老和健康相关的表型进行监测，包括活动性、体型与形态、运动轨迹以及存活情况。...

在多孔板装置中对分离的 Caenorhabditis elegans 进行长期培养与监测

通过实验教学可以使生物学课程对学生更具吸引力。本文介绍了两种不同但互补的实验方案，可在课堂教学中用于鼓励学生提出并验证与高热量饮食、饥饿和衰老相关的假设。...

使用低成本染料可视化糖原积累和肠道完整性 秀丽隐杆线虫

学习基于固体培养基的秀丽线虫规模化培养方法，用于糖尿病代谢变化研究中的样品制备。该方案通过同步化种群和M九缓冲液处理，实现大样本量收集与可重复性蛋白分离，为发育生物学和神经科学研究提供可靠技术支持。

基于平板的大规模培养秀丽隐杆线虫糖尿病代谢改变研究的样本制备

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