基于平板的大规模培养 秀丽隐杆线虫糖尿病代谢改变研究的样本制备
2018年8月24日
本方案描述了一种在固体培养基上大规模培养秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的方法。作为液体培养的替代方案，该方法可在基于培养皿的培养条件下获得不同规模的实验参数。通过消除液体培养与固体培养之间在形态学和代谢上的差异，提高了实验结果的可比性。
在秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究领域，该方法有助于回答一些关键科学问题，这些问题需要利用平板培养技术来产生大量线虫种群和样本。本实验方案的主要优势在于易于建立，且便于描述，包括其中的注意事项和应用范围。在获得同步化的线虫群体后，向平板中加入约一毫升 M9 缓冲液，并通过轻轻摇动平板使缓冲液均匀分布。
此后，将线虫收集到一个15毫升的离心管中。然后将管子倒置，使用显微镜评估线虫的密度。根据需要调整悬浮液的密度，并继续在显微镜下进行评估。
使用经过改造的移液枪头，将150微升悬浮液直接加到平板上。为确保线虫在各平板间均匀分布，需定期倒置悬浮液管。首先，用改造的移液枪头加入约500微升M9缓冲液清洗线虫。
使用相同的缓冲液继续解离线虫，直到大多数个体被收集在悬液中。接着，用经过改造的移液枪头吸取线虫，并将其转移至含有OP50的培养皿中。由于改造后的移液枪头具有更大的直径，可减少剪切应力，从而降低对线虫的损伤。
然后，让培养板自然干燥。在采集样品前，准备好液氮以快速冷冻收集到的线虫。随后，将M九缓冲液置于冰上。
向每块平板加入一毫升 M9 缓冲液，轻轻摇晃以洗涤每块平板。然后吸出 M9 缓冲液，并转移至新的 15 毫升离心管中。在去除大部分 M9 缓冲液之前，先将离心管在 800 × g 条件下短暂离心。
接下来，用10毫升M9缓冲液将样品清洗三次，以去除任何细菌。使用玻璃移液管将每个沉淀转移至一个空的1.5毫升离心管中。用玻璃移液管从第二个1.5毫升离心管中吸取1毫升M9缓冲液，冲洗移液管壁上的线虫。
然后，用15毫升离心管冲洗残留的线虫，并将其转移至样品管中。接着，将样品管在19,000 ×g条件下离心1分钟，并尽可能吸除上清液。随后，用石蜡膜密封各管，并立即在液氮中快速冷冻。
将试管在负80摄氏度下保存，直至进行裂解液制备。向每个冷冻样品中加入等体积的0.5毫米氧化锆珠以及两倍体积的含蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液。然后，将试管放入匀浆器中，在速度九的条件下匀浆一分钟。
将样品在 4 摄氏度、19,000 × g 条件下离心 30 分钟。最后，将上清液转移至冰上的新离心管中，并于 -80 摄氏度保存，用于后续实验。在本实验方案中，培养了大量秀丽隐杆线虫（C. elegans），用于糖尿病研究的相关应用。
收集的线虫数量与裂解液的蛋白得率呈正相关，表明使用本方案可实现可重复的定量蛋白质分离。本文展示了对活性代谢物甲基乙二醛及其暴露后形成的高级糖基化终产物进行的质谱分析结果。比较了葡萄糖处理的线虫与对照组。
通过移液器转移线虫可能会产生剪切应力，从而对线虫造成损伤。根据本方案，使用移液器转移的线虫与使用金属丝转移的线虫在氧化应激水平上无差异。完成该操作后，可进一步进行如蛋白质印迹（western blot）等其他方法，以回答蛋白质组学中的其他问题。
该方案还有助于开展将多个参数与同一群体相关联的实验。
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概述
本方案描述了一种在固体培养基上大规模培养秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的方法。该方法有助于获得大量线虫种群和样品，从而提高实验结果的可比性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 微生物学
背景
- 秀丽隐杆线虫是一种广泛使用的模式生物。
- 基于平板的培养方法相较于液体培养具有多种优势。
- 了解线虫种群动态对多种研究应用至关重要。
- 该方法解决了秀丽隐杆线虫研究领域中的关键问题。
研究目的
- 建立在固体培养基上培养秀丽隐杆线虫（C. elegans）的可靠方案。
- 实现同步化线虫群体的制备。
- 便于需要大样本量的实验开展。
使用的方法
- 线虫群体的同步化。
- 将M9缓冲液加入培养板中。
- 在显微镜下评估线虫密度。
- 根据需要调整悬浮液的密度。
主要结果
- 成功建立大规模线虫培养体系。
- 提高基于平板培养结果的可比性。
- 识别实验方案中潜在的技术陷阱。
- 在多种研究背景下的应用。
结论
- 本方案提供了一种可靠的秀丽隐杆线虫（C.elegans）培养方法。
- 该方法可提高开展大规模实验的能力。
- 该方法操作简便且可重复。
常见问题
行业重要性概述
大规模培养秀丽隐杆线虫（C. elegans）可实现可重复的定量蛋白质分离，用于糖尿病相关生物标志物的发现，支持神经退行性并发症中的靶点验证。该方法提供了一种可扩展且剪切应力最小化的流程，适用于晚期糖基化终产物（AGEs）和活性氧（ROS）的蛋白质组学分析，可直接应用于早期药物发现中的机制性风险降低。通过在受控条件下促进同步化种群的制备，该方法增强了糖尿病病理临床前模型的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够在神经元模型中探究葡萄糖暴露与晚期糖基化终末产物（AGE）及活性氧（ROS）生成之间治疗假设的关联。
- 操作价值：通过蛋白质产量与线虫数量之间的可重复性相关性，支持功能靶点的验证。
- 预测价值：通过为糖尿病并发症通路中的先导物识别提供定量蛋白质组学数据，促进项目组合的筛选。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：为下游的蛋白质印迹和质谱分析应用准备经过验证的生物系统。
- 可重复性：标准化样品制备流程，以最小化生理影响并确保一致的蛋白质组学结果。
- 可扩展性：可在相同的培养条件下整合多种分析，兼容高通量筛选。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：通过秀丽隐杆线虫模型研究糖尿病并发症，该模型可在无血管干扰因素的情况下表现出晚期糖基化终产物（AGE）和活性氧（ROS）的累积。
- 转化连续性：通过在不同实验条件下实现一致的样品制备，连接发现研究与临床前验证。
- 基于风险调整的推进：提供可靠的裂解液用于生物标志物分析，降低靶点优先排序中的假阳性率。
流程与工作流整合
该方法位于从假设验证到先导物识别再到临床前验证的研究连续体中，特别支持与糖尿病相关的神经退行性病变研究。
- 发现生物学：通过定量蛋白质和代谢物分析，支持糖尿病中代谢改变的假设验证。
- 筛选：提供可直接用于检测的样品，具有标准化的密度和极低的剪切应力，确保化合物评估的可靠性。
- 分析：实现对甲基乙二醛和晚期糖基化终产物（AGEs）的质谱检测，为不同条件间的比较提供定量数据。
- 转化研究：通过一致的蛋白质组学工作流程，将神经元表型的发现与临床前研究的连续性相连接。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，支持在多项糖尿病相关研究中大规模培养线虫。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低糖尿病并发症模型中的机制模糊性，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：确保蛋白质组学工作流程的标准化和可重复性，最大限度减少裂解液制备过程中的变异。
- 战略价值：通过可靠的生物标志物数据，优化“推进/终止”决策，降低糖尿病项目在后期阶段的生物学风险。
- 项目组合影响：基于可重复的晚期糖基化终产物（AGE）和活性氧（ROS）调控数据，实现对靶点的风险校准优先排序。
实施注意事项
- 需要具备秀丽隐杆线虫（C. elegans）操作和同步化技术的专业知识。
- 样本处理需具备离心机、匀浆器和液氮的使用条件。
- 要求各实验团队在悬浮液密度评估和洗涤方案方面实现标准化。
- 在不同实验条件下培养板之间转移操作时，需考虑适应性调整。
- 涉及移液步骤中剪切应力的缓解问题，可通过改性移液吸头加以解决。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Title
0:27
Large Scale Culture on Plates
1:15
Transfer of Large Amounts of Caenorhabditis elegans
1:52
Harvest of a Large Caenorhabditis elegans Sample
3:20
Protein Isolation for Mass Spectrometry
3:56
Results: Reproducible Quantitative Protein Isolation and Further Applications of Large-scale C. elegans Culture
4:47
Conclusion
