Name: 选择与无选择生物鉴定研究蛾 grisescens的化蛹偏好及出现的成功 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: 了解选择与无选择生物鉴定方法，研究灰茶尺蠖（Ectropis grisescens）的化蛹偏好及羽化成功率。该技术为昆虫学研究者探索土壤化蛹昆虫生态学提供了可靠途径。

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感谢华南农业大学林学与风景园林学院的Yuzhen Wen、Shiping Liang、Shengzhe Jian和Yanjun Li在昆虫饲养和实验设置方面提供的帮助。本研究由国家自然科学基金（资助号：31600516）、广东省自然科学基金（资助号：2016A030310445）以及广东省科技计划项目（资助号：2015A020208010）提供经费支持。

1. 通过湿度选择性生物测定确定E. grisescens的化蛹偏好
<ol>
	<li>获取成熟的末龄幼虫 E. grisescens
	<ol>
		<li>剪取茶树的新鲜枝条（长30 - 40 cm）山茶（Camellia sinensis） L.)。将25–30根茶梢插入250 mL三角烧瓶中，加入自来水至满。将3–4个装有茶梢的烧瓶放入塑料盆中（上口直径51 cm，底部直径40 cm，高16 cm）。</li>
		<li>释放实验室种群中1,000 - 2,000头幼虫（二至五龄） E. grisescens 将幼虫接种到每个盆中茶树嫩梢的叶片上。在受控的实验室条件下饲养这些幼虫［光照周期为14小时光照 followed by 10小时黑暗（14:10 L:D），相对湿度（RH）60 - 90%，温度24 - 28 °C]. 每隔1 - 2天用手将幼虫小心转移至新鲜叶片上。每天清除盆底的粪便和残渣。</li>
		<li>选取从茶树嫩梢叶片上掉落并在盆底活跃爬行的成熟末龄幼虫。至少采集240头成熟幼虫，以确保生物测定有足够的试虫。 
		注意：实验中仅选择活跃爬行的幼虫。不要选择停留在叶片上的幼虫，因为这些幼虫尚未准备好化蛹。同时，不要选择活动能力有限的前蛹，因为它们在被放入生物测定装置后不会主动寻找适宜的环境条件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基底制备
	<ol>
		<li>收集并鉴定4种基质例如，砂土、砂质壤土1、砂质壤土2和粉壤土）采用比重计法20. 对土壤和沙子进行灭菌处理 80 °C 用于烘箱干燥的 &gt; 3 d，然后将土壤和沙子完全干燥 50 °C 数周，直至底物样品的干重不再随时间发生变化。</li>
		<li>使用木杵和研钵将干燥土壤研磨成粉。将砂子和研磨后的土壤通过3 mm筛网过筛，并分别储存于可密封的塑料袋中。</li>
		<li>根据以下方法计算各基质（沙土、砂质壤土1、砂质壤土2或粉砂壤土）的不同含水量2: 
		<img alt="基质中水分含量的百分比计算公式；材料分析的关键。" src="/files/ftp_upload/58126/58126eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"></li>
		<li>将所需量的蒸馏水加入含有干燥土壤或沙子的可密封塑料袋中，配制含水量分别为5%、20%、35%、50%、65%和80%的基质。充分混匀蒸馏水与土壤或沙子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物测定实验区准备
	<ol>
		<li>将聚丙烯容器（上口：长20.0 cm × 宽13.5 cm，底部：长17.0 cm × 宽10.0 cm，高6.5 cm）用防水聚氯乙烯（PVC）板（高3.5 cm）均分为6个腔室。使用热熔胶固定PVC板并密封缝隙。 
		注意：必须完全密封所有裂缝，以防水分渗透。</li>
		<li>每次测试时，使用相同类型的基质但含水量不同（5%、20%、35%、50%、65% 和 80% 含水量）填充 6 个腔室图1a). 
		注意：每次试验仅使用一种具有不同含水量的底物。含有6种不同含水量底物的培养室顺序应随机分配。</li>
		<li>使用小块胶带将4-6片新鲜茶叶粘贴在聚丙烯容器盖子的内表面图1b).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="土壤湿度比较、叶片蒸腾装置、质地分析：粉砂、砂土、砂质壤土类型。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58126/58126fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：选择实验用生物测定区域示例。 (a) 使用防水聚氯乙烯（PVC）板将聚丙烯容器均分为6个室。PVC板用热熔胶固定，并仔细密封所有缝隙。本示例中，各室填充不同含水量（5%、20%、35%、50%、65% 和 80% 湿度）的砂质壤土2，按随机顺序排列。(b) 将新鲜茶叶粘贴在盖子内侧，待成熟的Ectropis grisescens幼虫在此处释放。(c) 使用PVC板将聚丙烯容器均分为4个室，分别填充4种基质（砂土、砂质壤土1、砂质壤土2和粉砂壤土），含水量均为50%。本图改编自Wang et al.11。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58126/58126fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>生物测定设置与数据记录
	<ol>
		<li>将30只成熟的末龄幼虫（在步骤1.1.3中获得）释放到聚丙烯容器盖内壁粘贴的新鲜茶叶上。小心翻转盖子，并将盖子紧密盖在聚丙烯容器上。</li>
		<li>每项测试重复8次。将生物测定装置置于环境培养箱中，设置光周期为14:10（光:暗），温度为26 °C。</li>
		<li>第5天，统计每个容器中土壤表面的蛹数。同时拆解生物测定装置，统计基质内部的蛹数。 
		注意：仅统计基质表面或内部存活的蛹。用镊子轻触蛹体，观察其腹部是否具有运动反应，以判断蛹的存活状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>对每项测试，计算每个重复容器中蛹所占的百分比。采用Kucera和Malmgren21提供的方法，将百分比数据转换为对数比率形式。</li>
		<li>使用单因素方差分析（ANOVA）比较各容器中蛹百分比（经转换的数据）。各项测试的显著性水平设为α = 0.05。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 用于确定化蛹偏好的底物选择生物测定法 E. grisescens
<ol>
	<li>重复步骤 1.1 以获得成熟的末龄幼虫，并重复步骤 1.2 以制备不同含水量的基质。本次实验仅需含水量为 20%、50% 和 80% 的基质。</li>
	<li>生物测定装置的制备
	<ol>
		<li>与步骤 1.3.1 类似，使用聚氯乙烯（PVC）板将聚丙烯容器均分为 4 个区域。用热熔胶固定 PVC 板并密封缝隙。</li>
		<li>每次试验时，将四种类型（砂土、砂质壤土 1、砂质壤土 2 和粉砂壤土）且含水量相同（20%、50% 或 80%）的基质以随机顺序填入各区域（图 1c）。重复步骤 1.3.3 制备容器盖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复步骤 1.4 进行生物测定并记录数据，重复步骤 1.5 进行数据分析。</li>
</ol>
3. 确定E. grisescens土壤钻蛀行为与羽化成功率的无选择性生物测定
<ol>
	<li>重复步骤 1.1 以获得成熟的末龄幼虫，并重复步骤 1.2 以制备 4 种基质（砂土、砂质壤土 1、砂质壤土 2 和粉质壤土），每种基质分别设置 3 种含水量（20%、50% 和 80%）。</li>
	<li>生物测定设置
	<ol>
		<li>将基质装入塑料容器中（上口直径：11.5 cm；底部直径：8.5 cm；高度：6.5 cm），填充至 3 cm 深度。总共设置 12 个处理组（4 种基质类型与 3 种含水量的组合），每个处理组重复 7 次。</li>
		<li>在每个生物测定容器的基质表面释放 15 头成熟的末龄幼虫。用盖子紧密封口。将生物测定装置置于环境培养箱中，保持 14:10（光:暗）光周期和 26 °C 的条件。 
		注意：与选择性生物测定不同，无需在盖子上贴新鲜茶叶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据记录与分析
	<ol>
		<li>第 3 天，统计每个重复组基质表面的蛹数及死亡幼虫数。按以下公式计算进入基质的 E. grisescens 个体百分比： 
		<img alt="钻入个体百分比计算公式；生态数据分析方程。" src="/files/ftp_upload/58126/58126eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 2"></li>
		<li>每天记录羽化成虫数量，持续至连续 15 天无新成虫羽化为止。按以下公式计算羽化成功率： 
		<img alt="羽化成功率公式：羽化成虫数/15 × 100%；生物学分析方程。" src="/files/ftp_upload/58126/58126eq3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 3"></li>
		<li>采用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较不同处理组间钻入基质的个体百分比和羽化成功率，显著性水平设为 α = 0.05。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dimou, I., Koutsikopoulos, C., Economopoulos, A. P., Lykakis, J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1046/j.1439-0418.2003.00686.x">Depth of pupation of the wild olive fruit fly, Bactrocera (Dacus) oleae (Gmel.) (Dipt., Tephritidae), as affected by soil abiotic factors.</a> Journal of Applied Entomology. 127 (1), 12-17 (2003).</li>
<li>Chen, M., Shelton, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+soil+type%2C+moisture%2C+and+depth+on+swede+midge+%28Diptera%3A+Cecidomyiidae%29+pupation+and+emergence%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Entomology%22%5BJournal%5D)">Impact of soil type, moisture, and depth on swede midge (Diptera: Cecidomyiidae) pupation and emergence.</a> Environmental Entomology. 36 (6), 1349-1355 (2007).</li>
<li>Holmes, L. A., Vanlaerhoven, S. L., Tomberlin, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+effects+on+pupation+and+adult+emergence+of+Hermetia+illucens+%28Diptera%3A+Stratiomyidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Entomology%22%5BJournal%5D)">Substrate effects on pupation and adult emergence of Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae).</a> Environmental Entomology. 42 (2), 370-374 (2013).</li>
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<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pupation+behaviors+and+emergence+successes+of+Ectropis+grisescens+%28Lepidoptera%3A+Geometridae%29+in+response+to+different+substrate+types+and+moisture+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Entomology%22%5BJournal%5D)">Pupation behaviors and emergence successes of Ectropis grisescens (Lepidoptera: Geometridae) in response to different substrate types and moisture contents.</a> Environmental Entomology. 46 (6), 1365-1373 (2017).</li>
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<li>Ge, C. M., Yin, K. S., Tang, M. J., Xiao, Q. Biological characteristics of Ectropis grisescens Warren. Acta Agriculturae Zhejiangensis. 28 (3), 464-468 (2016).</li>
<li>Xi, Y., Yin, K. S., Tang, M. J., Xiao, Q. <a target="_blank" href="http://www.insect.org.cn/EN/abstract/abstract13974.shtml">Geographic populations of the tea geometrid, Ectropis obliqua (Lepidoptera: Geometridae) in Zhejiang, eastern China have differentiated into different species.</a> Acta Entomologica Sinica. 57, 1117-1122 (2014).</li>
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<li>Zhang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetrical+reproductive+interference+between+two+sibling+species+of+tea+looper%3A+Ectropis+grisescens+and+Ectropis+obliqua%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+Entomological+Research%22%5BJournal%5D)">Asymmetrical reproductive interference between two sibling species of tea looper: Ectropis grisescens and Ectropis obliqua.</a> Bulletin of Entomological Research. , (2016).</li>
<li>Luo, Z. X., Li, Z. Q., Cai, X. M., Bian, L., Chen, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+premating+isolation+between+two+sibling+moths%3A+Ectropis+grisescens+and+Ectropis+obliqua+%28Lepidoptera%3A+Geometridae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Economic+Entomology%22%5BJournal%5D)">Evidence of premating isolation between two sibling moths: Ectropis grisescens and Ectropis obliqua (Lepidoptera: Geometridae).</a> Journal of Economic Entomology. 110 (6), 2364-2370 (2017).</li>
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<li>Hulthen, A. D., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1111/j.1440-6055.2006.00518.x">The influence of soil type and moisture on pupal survival of Bactrocera tryoni (Froggatt) (Diptera: Tephritidae).</a> Australian Journal of Entomology. 45 (1), 16-19 (2006).</li>
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</ol>

作者无任何披露信息。

对不同土壤变量的化蛹偏好已在少数害虫中得到研究6,9,22,23例如，为了研究成熟幼虫的偏好性 Bactrocera tryoni （Froggatt）（双翅目：实蝇科）在不同土壤湿度条件下的研究，Hulthen 和 Clarke22 设置一个 3 × 3 拉丁方设计，包含 9 个容器，每个容器中装有土壤，土壤含水量分别为田间持水量的 0%、75% 或 100%，每个容器表面释放 25 头成熟幼虫。Alyokhin 等23 将100个（装有土壤的）容器放置于一个木制框架内，其中位于中央的36个容器（干燥或湿润）按如下方式排列 &#34;棋盘&#34; 模式，以及350至450只晚期三龄幼虫 Bactrocera dorsalis （海德...

与昆虫的幼虫期和成虫期相比，蛹期由于蛹的活动能力有限，无法迅速逃离危险环境，因此极为脆弱。在地下化蛹是多种昆虫类群（例如，双翅目1,2,3,4、鞘翅目5、膜翅目6、缨翅目7和鳞翅目8,9,10,11,12）为避免受到地表捕食者和环境危害而普遍采用的一种策略。其中许多种类是严重的农林害虫1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。这些在土壤中化蛹的昆虫，其成熟幼虫通常会离开寄主，掉落至地面，爬行寻找合适的场所，钻入土壤并构筑蛹室以进行化蛹8,10。
茶尺蠖Ectropis grisescens Warren（鳞翅目：尺蛾科）是茶树Camellia sinensis&#160;L.最重要的食叶害虫之一13。尽管该物种早在1894年即被描述，但在过去几十年中常被误认为是Ectropis obliqua Prout（鳞翅目：尺蛾科）14,15。近年来的一些研究已描述了这两种近缘物种在形态学、生物学特性及地理分布上的差异14,15,16。例如，Zhang et al.15报道，E. obliqua主要分布于中国安徽、江苏和浙江三省交界地区，而E. grisescens的分布范围则比E. obliqua广泛得多。因此，由E. grisescens造成的经济损失长期被忽视，对该害虫的认识亟需全面修订与更新16,17,18,19。我们先前的研究表明，E. grisescens偏好在土壤中化蛹，但在缺乏土壤时（即无化蛹基质条件下）也能完成化蛹11,12。
本文提供了一套逐步操作流程，用于（1）通过多选择生物测定法确定E. grisescens对基质类型和含水量等因素的化蛹偏好性；以及（2）通过无选择生物测定法评估非生物因素对E. grisescens化蛹行为及羽化成功率的影响。所有这些生物测定均在严格控制的实验室条件下进行。此外，这些生物测定方法可被调整用于评估其他因素对多种土中化蛹昆虫化蛹行为和存活率的影响。

<table><tbody><tr><td>三角烧瓶</td><td>Bomex Chemical (Shanghai) Co., LTD</td><td>99</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>塑料盆</td><td>Chahua, Fuzhou, China</td><td>100</td><td>上侧直径：51 cm；底部直径：40 cm；高度：16 cm</td></tr><tr><td>自封袋</td><td>Glad, Guangzhou, China</td><td>126/133</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯容器</td><td>Youyou Plastic Factory, Taian, China</td><td>139/155/160/161/190</td><td>上侧：20.0 cm [长] &amp;times; 13.5 cm [宽]，底部：17.0 cm [长] &amp;times; 10.0 cm [宽]，高度：6.5 cm</td></tr><tr><td>防水聚氯乙烯板</td><td>Yidimei, Shanghai, China</td><td>141</td><td></td></tr><tr><td>胶带</td><td>V-tech, Guangzhou, China</td><td>VT-710</td><td></td></tr><tr><td>烘箱干燥器</td><td>Kexi, Shanghai, China</td><td>KXH-202-3A</td><td></td></tr><tr><td>环境培养箱</td><td>Life Apparatus, Ningbo, China</td><td>PSX-280H</td><td></td></tr></tbody></table>

ectropis grisescens 蛹化偏好与羽化成功率研究的选与非选生物测定法

Choice and No-Choice Bioassays to Study the Pupation Preference and Emergence Success of Ectropis grisescens

许多昆虫在幼虫和成虫阶段生活于地表以上，而在化蛹阶段则位于地下。相较于其生命周期中的地上阶段，环境因素对这些昆虫在土壤中化蛹过程的影响受到的关注较少。茶尺蠖Ectropis grisescens Warren（鳞翅目：尺蛾科）是茶树的一种严重害虫，在中国南方已造成巨大的经济损失。本文所述实验方案旨在通过多选择生物测定法，研究末龄成熟的E. grisescens幼虫是否能够区分土壤的基质类型和湿度等变量；并通过非选择性生物测定法，确定基质类型和湿度对E. grisescens化蛹行为及羽化成功率的影响。研究结果将有助于加深对E. grisescens化蛹生态学的理解，并可能为通过土壤管理策略抑制E. grisescens种群提供思路。此外，这些生物测定方法可经适当修改，用于研究各种因素对在土壤中化蛹的害虫之化蛹行为和存活率的影响。

水分选择生物测定结果显示，与含水量为80%的沙土相比，显著更多的E. grisescens个体在含水量为5%和35%的沙土中化蛹（图2a）。然而，显著更多的个体倾向于在具有中等含水量的土壤（砂质壤土1和2以及粉质壤土）中化蛹（图2b–2d）。
<img alt="蛹分布与含水量关系图；ANOVA结果；百分比数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58126/58126fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：水分选择性生物测定实验结果。 这些图显示了在含有不同含水量（5%、20%、35%、50%、65% 和 80%）的（...

本文介绍了一种利用选择性生物测定方法研究 Ectropis grisescens 末龄幼虫对土壤因子（例如，基质类型和含水量）的化蛹偏好性的实验方案。同时，我们还提供了一种非选择性生物测定方法的实验方案，用于确定影响E. grisescens化蛹行为及存活率的相关因素。

Ectropis grisescens 蛹化偏好与羽化成功率研究的选与非选生物测定法

许多昆虫在幼虫和成虫阶段生活在地表以上，而在蛹期则生活于地下。与它们生命周期中的地表阶段相比，地下阶段的研究较少……

该方法可提供与茶尺蠖（Ectropis grisescens）化蛹生态相关的重要信息，例如其化蛹行为以及蛹在不同环境因素影响下的存活率。该技术的主要优势在于，能够采用简单的方法来测定茶尺蠖的化蛹选择偏好及其羽化成功率。实验开始时，从茶树上剪取新鲜的嫩梢。然后用自来水填充一个250毫升的三角烧瓶，并将茶树嫩梢放入烧瓶中。将三至四个烧瓶转移至一个塑料盆中。接着，从实验室饲养的E. grisescens种群中释放1,000至2,000头幼虫到茶树嫩梢的叶片上。在受控的实验室条件下饲养幼虫。收集从嫩枝叶片上掉落并主动在盆底爬行的成熟末龄幼虫。将土壤和沙子置于80°C的烘箱中干燥灭菌三天。然后在 50 摄氏度下将土壤和沙子干燥数周。当样品重量不再随时间变化时，即表示基质样品已充分干燥。使用木制研钵和研杵研磨干燥的土壤。然后将沙子和粉碎的土壤通过3毫米筛子进行过筛。向装有基质并已密封的袋子中加入所需量的蒸馏水，并充分混合。接着，使用PVC板将聚丙烯容器分隔成六个相等的腔室。用热熔胶固定PVC板并密封裂缝。接着，用相同类型的基质但不同含水量填充六个腔室。使用小块胶带将4到6片新鲜叶片粘贴到聚丙烯容器盖子的内表面。接下来，将30只成熟的末龄幼虫释放到粘贴在分格容器盖内表面的叶片上。小心翻转盖子并盖好容器。将生物测定环境置于26摄氏度、14小时光照/10小时黑暗光周期的环境培养箱中进行培养。在第五天，统计每个小室基质表面的蛹数量。拆解生物测定装置并统计蛹的总数。首先，使用PVC板将聚丙烯容器分成四个小室。然后，使用热熔胶固定并密封PVC板。将容器的各个区域填入四种含水量相同、随机分配顺序的基质。接着，用胶带将新鲜茶叶粘贴在盖子上，然后将盖子翻转盖在容器上。接下来，将幼虫转移至叶片上，并按照文字方案中所述记录和分析数据。制备12种不同基质含水量处理后，将基质加入塑料容器中，然后在每个实验区域的基质中放入15只成熟的末龄幼虫。将每个生物测定区域置于环境培养箱中，保持26摄氏度、14小时光照/10小时黑暗的光周期。在第3天，统计每个区域基质表面的蛹数及任何死亡的幼虫数量。最后，每天记录羽化的成虫数量，直至连续15天无新成虫羽化为止。在本实验方案中，采用湿度和基质选择性生物测定法来研究灰背丽蝇（E. grisescens）的化蛹偏好。湿度选择性生物测定结果显示，与含水量为80%的沙土相比，更多个体在含水量为5%和35%的沙土中或其内化蛹。然而，显著更多的个体倾向于在中等湿度的土壤中或其内化蛹。底物选择生物测定结果显示，在20%湿度条件下和80%湿度条件下，E. grisescens均最偏好沙土；然而，在50%湿度条件下，该昆虫对四种底物均未表现出化蛹偏好性。该技术的建立为昆虫学领域的研究人员探索多种土栖化蛹昆虫的化蛹生态学特征奠定了基础。

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