c-fos 和 dusp1 在癌基因依赖性中的作用评价方法
January 7th, 2019
在这里, 我们描述了 c-fos 和 dusp1 作为白血病药物靶标的遗传和化学验证协议, 在体外和体内使用遗传和人性化的小鼠模型。该方法可应用于遗传验证和治疗发展的任何目标。
这种方法可以帮助回答癌症治疗领域的关键问题，例如识别与基因依赖有关的关键基因。该技术的主要优点是，它利用许多激酶驱动的癌症常见的肿瘤依赖性，因此它适用于多种肿瘤类型。虽然这种方法可以提供白血病的洞察力，它也可以应用于其他系统，如实体肿瘤，如肺癌，脑肿瘤和胰腺肿瘤。
一般来说，由于在分子生物学和细胞生理学方面缺乏经验，对这种方法的新鲜人将难以为之奋斗。首先，从安乐死小鼠中收获腿骨。用手术刀清洁骨头上的组织。
然后把骨头放在冰冷的PBS上，然后用刺的刺压碎骨头。在此之后，通过 70 微米细胞滤网将电池悬浮液过滤到 50 毫升螺帽管中，并配有 10 毫升移液器。用冷 PBS 多次清洗砂浆和刺，并将细胞悬浮液添加到 50 毫升管中。
接下来，用真空和玻璃移液器将骨髓离心并取出上流液。将细胞颗粒重新在5毫升PBS中。使用移液器，慢慢将悬浮骨髓添加到室温多蔗糖的顶部。
在此之后，在关闭制动器时，以 400 G 旋转聚蔗糖 20 分钟。离心后，用移液器收集多云的完全单核细胞接口，并转移到新的15毫升管。使用 PBS 将体积达到 10 毫升，并取出 20 微升进行计数。
离心后，丢弃上经剂，将颗粒放在冰上。接下来，用 EDTA 和 BSA 重新在 PBS 中重新暂停细胞颗粒。将 CD117 微珠添加到细胞悬浮液中，并加入涡流混合。
在此之后，在4摄氏度下孵育10分钟的暂停。然后将体积高达 10 毫升，使用 EDTA 和 BSA，在 1200 G 下以 4 摄氏度的离心机使用更多 PBS，使用 5 分钟。使用真空去除上一级，并使用 EDTA 和 BSA 将 PBS 中的细胞颗粒悬浮。
然后将 3 毫升 PBS 与 EDTA 和 BSA 添加到带磁柱的磁支架中，并允许其流入收集管。缓冲区完成流过列后，添加单元格悬浮液，并允许它流经柱进入收集管。接下来，在柱上再加入 5 毫升 PBS 和 EDTA 和 BSA，然后立即用柱塞冲洗。
取出柱塞，在计数细胞之前重复冲洗。离心细胞后，取出上经剂，将细胞颗粒悬浮在完整的 IMDM 中，以进行培养。在37摄氏度下一夜之间用5%的二氧化碳培养细胞。
首先，将逆转录病毒质粒DNA与包装质粒、氯化钙和水混合在1.5毫升管中。然后将500微升的HBS加入另一个1.5毫升的管中。将转染混合物滴入含有HBS的管子中，同时与涡流剂混合设置为最低设置。
在室温下孵育转染混合物20至30分钟。在孵化期间，将氯奎因加入 HEK 细胞，并将其留在孵化器中。添加转染混合物后，在37摄氏度5%CO2培养箱中孵育细胞8小时，通过缓慢地加入14毫升新鲜DMEM10培养基来改变细胞介质。
缓慢地对着盘子的壁移液有助于防止 HEK 细胞的任何剥离。然后在37摄氏度的5%CO2培养箱中孵育细胞过夜。使用10毫升注射器收集病毒上一道液。
然后将 0.45 微米注射器过滤器连接到注射器上。将病毒上一种药物放入新的收集管中。大约16小时后收集病毒上一道液。
在此之后，在PBS中加入两毫升重组的人类纤维素片段，加入未经处理的6个井培养板。第二天，使用移液器从盘子中去除纤维素。在 PBS 中用 2%BSA 将板块住，并在室温下孵育板 30 分钟。
使用真空去除 BSA 并使用 PBS 清洗板，然后用真空清除板。在此之后，立即添加过滤的病毒上清液，并离心板两个小时。使用真空去除上一液，然后再次旋转板。
接下来用真空去除上一代，用PBS清洗病毒涂层孔。用真空去除PBS，将先前培养的c-Kip加小鼠细胞添加到病毒涂层孔中。离心后，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育细胞。
转导后48小时，通过离心对细胞进行颗粒化，并在FACS缓冲液1中重新填充。首先在室温下用细胞因子解冻甲基纤维素。然后在FACS管中加入3毫升甲基纤维素。
将100微升的细胞悬浮液与适当的抑制剂添加到3毫升甲基纤维素。然后将悬浮液高至高 10 到 30 秒。大多数气泡逸出后，使用 1 毫升注射器将 1 毫升介质板在三个复制板中。
将盘子放在一个大的培养皿中，以及一个含有无菌水的开放式盘子。然后覆盖大培养皿，在37摄氏度下孵育细胞。通过溶解10毫升水中的10毫克氯化碘三极氯化物，准备碘三氯化物的污渍。
使用配备 0.2 微米过滤器的 Luer 锁注射器对染色溶液进行消毒。在组织培养罩中，在CFU板周围添加100微升的染色溶液。然后在37摄氏度的细胞培养箱中孵育板。
最后，在菌落变成深红色棕色后，使用无菌组织培养罩中的白色背景拍摄染色的CFU板的照片。在该协议中，使用了多种公正的基因表达分析来识别协调基因成瘾的遗传成分。为了验证c-Fos和Dusp1作为白血病治疗靶点的作用，用表达BCR-ABL1肿瘤基因的细胞确认了它们过度表达。
通过RT-qPCR和西部印迹的分析证实，两者都是由BCR-ABL1引起的，并且它们的表情被生长因子IL-3增强。YFP 加表达细胞通过 FACS 排序，以进一步进行体外和体内测定。结果表明，仅删除 c-Fos 和 Dusp1 就抑制了 CFU 编号。
缺乏 c-Fos 和 Dusp1 的细胞在形成菌落的能力方面受到显著损害，Imatinib 治疗消灭了所有 CDU，表明 c-Fos 和 Dusp1 的丧失对 BCR-ABL1 表达具有合成致命性。经过这一开发，这项技术为癌症领域的研究人员探索基因网络和基因驱动基因依赖，以及这些基因如何影响他们在小鼠模型和人类患者中的特殊反应铺平了道路。在执行此过程时，不要忘记使用逆转录病毒和患者样本可能极其危险和安全的实验室做法。
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概览
本文描述了使用遗传和化学方法验证c-Fos和Dusp1作为白血病药物靶点的协议。该方法适用于各种肿瘤类型，为癌基因依赖性提供了见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 肿瘤学
- 遗传学
- 药理学
背景
- 识别癌基因依赖性中的关键基因对于癌症治疗至关重要。
- 该方法可应用于多种激酶驱动的癌症。
- 由于分子生物学的复杂性，新手面临挑战。
- 涉及采集和处理小鼠腿骨进行分析。
研究目的
- 验证c-Fos和Dusp1作为白血病治疗靶点。
- 展示该方法对其他癌症类型的适用性。
- 增强对癌症中癌基因依赖性的理解。
使用的方法
- 体外和体内遗传验证协议。
- 使用人源化小鼠模型进行测试。
- 药物靶向的化学验证技术。
- 采集和清洁小鼠腿骨以供实验使用。
主要结果
- 成功验证了c-Fos和Dusp1作为药物靶点。
- 洞察癌基因依赖性在白血病中的作用。
- 该方法适用于白血病以外的各种肿瘤类型。
- 识别了该方法的新手研究人员面临的挑战。
结论
- 该研究为癌症研究中的遗传验证提供了框架。
- 研究结果支持白血病中靶向治疗的潜力。
- 该方法可适应于肿瘤学中的更广泛应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables target validation in oncogene dependence, a critical inflection point in early discovery where mechanistic de-risking informs portfolio decisions. By genetically and chemically validating c-Fos and Dusp1 as synthetic lethal partners to BCR-ABL1, the approach provides predictive confidence for target prioritization in kinase-driven cancers. The protocol supports translational continuity from in vitro assays to humanized mouse models, facilitating risk-adjusted advancement of therapeutic candidates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by validating genes whose deletion inhibits colony formation in oncogene-dependent cells.
- Operational Value: Provides a reproducible workflow for genetic validation using retroviral transduction and FACS-sorted YFP+ cells.
- Predictive Value: Demonstrates synthetic lethality where loss of c-Fos and Dusp1 combined with TKI treatment eradicates CFU formation, supporting go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated biological systems (c-Kit+ mouse cells transduced with YFP) suitable for downstream compound screening.
- Quantitative Outputs: Enables CFU counting and colony formation assays as quantitative readouts for target dependency.
- Scalability: Uses standardized methyl cellulose plating and triplicate replicates to support screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applies to leukemia models where BCR-ABL1-driven oncogene dependence is validated via genetic and chemical inhibition.
- Preclinical Continuity: Bridges in vitro target validation to in vivo efficacy in humanized mouse models, supporting IND-enabling studies.
- Risk Mitigation: Reduces mechanistic ambiguity by confirming target role through orthogonal methods (RT-qPCR, western blot, functional assays).
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis to lead identification, providing validated models for mechanistic screening and predictive biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by confirming that c-Fos and Dusp1 are induced by BCR-ABL1 and augmented by IL-3 signaling.
- Screening: Delivers assay-ready cells with quantifiable CFU outputs for evaluating compound effects on oncogene dependence.
- Analytics: Enables statistical comparison of colony formation across conditions using FACS-sorted populations and methyl cellulose assays.
- Translational Research: Connects target validation to preclinical models where genetic deletion synergizes with TKIs to eradicate disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for validating any genetic target in kinase-driven cancers beyond leukemia.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in oncogene dependence through genetic and chemical validation of c-Fos and Dusp1.
- Operational Value: Standardizes target validation via bone marrow harvest, retroviral transduction, and CFU assay workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by demonstrating synthetic lethality that predicts therapeutic vulnerability.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets that show TKI sensitization upon inhibition.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, retroviral work, and hematopoietic stem cell isolation.
- Depends on instrumentation for centrifugation, FACS, and cytokine-supplemented methyl cellulose assays.
- Necessitates cross-team standardization for bone marrow processing and viral titer consistency.
- Involves adaptation considerations when applying to solid tumor models due to differences in cell sourcing and culture.
- Limited by biosafety requirements for handling retroviruses and primary patient samples.
