Name: c-fos 和 dusp1 在癌基因依赖性中的作用评价方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 学习利用遗传和化学方法验证c-Fos与Dusp1作为白血病药物靶点的实验方案。该技术适用于多种激酶驱动的癌症类型，为肿瘤靶向治疗研究提供重要框架。

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作者感谢 G. Q. Daley 提供 BaF3 和 WEHI 细胞，感谢 T. Reya 提供 MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP 载体。作者感谢 M. Carroll 提供慢性髓系白血病急变期患者的样本。本研究获得了美国国家癌症研究所（NCI，资助号 1RO1CA155091）、白血病研究基金会、V 基金会以及美国国家心肺血液研究所（NHLBI，资助号 R21HL114074-01）对 M.A. 的资助支持。

<ol><li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr%2Fabl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247, 824-830 (1990).</li>
<li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).</li>
<li>Mahon, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discontinuation+of+imatinib+in+patients+with+chronic+myeloid+leukaemia+who+have+maintained+complete+molecular+remission+for+at+least+2+years%3A+the+prospective%2C+multicentre+Stop+Imatinib+%28STIM%29+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial.</a> Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).</li>
<li>O'Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+limits+of+targeted+therapy+in+chronic+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia.</a> Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).</li>
<li>Rousselot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imatinib+mesylate+discontinuation+in+patients+with+chronic+myelogenous+leukemia+in+complete+molecular+remission+for+more+than+2+years%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years.</a> Blood. 109, 58-60 (2007).</li>
<li>Krause, D. S., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+kinases+as+targets+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tyrosine kinases as targets for cancer therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).</li>
<li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+balance+between+life+and+death%3A+targeted+cancer+therapy+and+%22oncogenic+shock%22%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and "oncogenic shock".</a> Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).</li>
<li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+addiction%3A+setting+the+stage+for+molecularly+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy.</a> Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).</li>
<li>Weinstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer.+Addiction+to+oncogenes--the+Achilles+heal+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer.</a> Science. 297, 63-64 (2002).</li>
<li>Corbin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chronic+myeloid+leukemia+stem+cells+are+insensitive+to+imatinib+despite+inhibition+of+BCR-ABL+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).</li>
<li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487, 500-504 (2012).</li>
<li>Wilson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+potential+for+growth-factor-driven+resistance+to+anticancer+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors.</a> Nature. 487, 505-509 (2012).</li>
<li>Kesarwani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+c-FOS+and+DUSP1+abrogates+intrinsic+resistance+to+tyrosine-kinase+inhibitor+therapy+in+BCR-ABL-induced+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia.</a> Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-fos+regulates+neuronal+excitability+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">c-fos regulates neuronal excitability and survival.</a> Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).</li>
<li>Dorfman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+erp%2Fmkp-1+gene+does+not+affect+mouse+development%3A+normal+MAP+kinase+activity+in+ERP%2FMKP-1-deficient+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts.</a> Oncogene. 13, 925-931 (1996).</li>
<li>Padhye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorocurcumins+as+cyclooxygenase-2+inhibitor%3A+molecular+docking%2C+pharmacokinetics+and+tissue+distribution+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice.</a> Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).</li>
<li>Molina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeting+of+quiescent+chronic+myelogenous+leukemia+stem+cells+by+histone+deacetylase+inhibitors+in+combination+with+imatinib+mesylate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate.</a> Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).</li>
<li>Koschmieder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+chronic+phase+of+myeloid+leukemia+with+expansion+of+hematopoietic+stem+cells+in+a+transgenic+model+of+BCR-ABL+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis.</a> Blood. 105, 324-334 (2005).</li>
<li>Abraham, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+targeting+of+p53+and+c-MYC+selectively+eliminates+leukaemic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells.</a> Nature. 534, 341-346 (2016).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+p53+by+SIRT1+inhibition+enhances+elimination+of+CML+leukemia+stem+cells+in+combination+with+imatinib%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib.</a> Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).</li>
<li>Qiagen-miRNAeasy kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources">https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources</a> (2018).</li>
<li>DNA-free DNA removal kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s</a> (2018).</li>
<li>SuperScript™ III First-Strand Synthesis System. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051</a> (2018).</li>
<li>Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html">https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html</a> (2018).</li>
<li>Abarrategi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+human+bone+marrow+niche+in+mice%3A+From+host+bone+marrow+engraftment+to+bioengineering+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches.</a> Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).</li>
<li>Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+screening+and+validation+of+resistant+mutations+against+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

对于大多数癌细胞而言，酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的治疗反应是通过阻断肿瘤所依赖的酪氨酸激酶癌蛋白信号通路介导的。然而，关于导致微小残留病（MRD）的少数癌细胞如何逃逸癌基因依赖性及治疗作用，目前了解仍较少4。近期研究表明，生长因子信号通路在白血病和实体瘤中均介导了药物耐药性，提示多种分子机制可能参与内在耐药性的形成10,11,12。为了阐明其机制并鉴定可用于治疗开发的基因靶点，我们利用小鼠（BaF3）和人源（K562）细胞进行了全面的全基因组表达谱分析。本研究未使用来自白血病小鼠或慢性髓系白血病（CML）患者的原始样本，因为我们推测，由于原始骨髓样本具有显著的异质性，可能会掩盖相关基因/靶点的真实特征。即使通过抗体介导分选获得的细胞（如干细胞前体细胞）也表现出明显的异质性。因此，使用纯化的细胞系可能更适用于靶点鉴定，以避免由遗传异质性带来的非预期复杂性。全基因组表达分析发现，c-Fos、Dusp1 和 Z...

BCR-ABL1 融合癌基因的组成性酪氨酸激酶活性导致慢性髓性白血病（CML），这为使用小分子抑制剂靶向该激酶活性提供了理论依据。酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）在治疗CML患者中的成功，彻底改变了靶向治疗的概念1,2随后，针对多种其他恶性肿瘤（包括实体瘤）的抗激酶治疗作为精准医学得以发展。迄今为止，美国FDA已批准三十多种激酶抑制剂用于治疗多种恶性肿瘤。尽管酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗在抑制疾病方面非常有效，但并不能实现治愈。此外，在治疗过程中仍有一小部分癌细胞持续存在：即微小残留病灶（MRD）3,4,5即使是达到完全缓解的患者仍会残留微小残留病（MRD），若不持续抑制，最终将导致疾病复发。因此，根除MRD细胞对于实现持久或治愈性疗效至关重要。慢性髓性白血病（CML）为阐明精准医学概念、肿瘤发生机制、靶向治疗的合理设计、疾病进展及药物耐药机制提供了重要的研究范式。然而，直至今日，酪氨酸激酶抑制剂（TKI）诱导癌细胞死亡的具体机制仍未完全阐明，同时也不清楚为何MRD细胞（主要由白血病干细胞[LSCs]构成）对TKIs具有内在耐药性。4,6然而，这一现象的 &#34;癌基因依赖性&#34; 突变型激酶癌蛋白与酪氨酸激酶抑制剂（TKI）疗效相关，TKI对靶向癌基因的急性抑制可引发癌基因休克，进而以细胞环境依赖的方式导致强烈的促凋亡反应或细胞静息状态6,7,8,9然而，癌基因依赖性的机制基础尚不明确。近期研究指出，生长因子信号通路可消除癌基因依赖性，从而导致对酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗产生耐药性。10,11,12因此，为了深入了解癌基因依赖的机制，我们对具有BCR-ABL1依赖性和非依赖性（在生长因子存在下培养）的细胞进行了全基因组表达谱分析，结果表明c-Fos和Dusp1是癌基因依赖的关键介导因子。13c-Fos 和 Dusp1 的基因缺失对表达 BCR-ABL1 的细胞具有合成致死效应，实验所用小鼠未发生白血病。此外，使用小分子抑制剂抑制 c-Fos 和 DUSP1 可治愈小鼠中 BCR-ABL1 诱导的慢性髓系白血病（CML）。结果表明，c-Fos 和 Dusp1 的表达水平决定了癌细胞的凋亡阈值，较低的表达水平使细胞对药物敏感，而较高的表达水平则导致治疗耐药。13.
为了鉴定驱动癌基因依赖性的基因，我们利用小鼠来源和慢性髓性白血病（CML）患者来源的细胞（K562），在存在生长因子和酪氨酸激酶抑制剂（伊马替尼）的条件下，开展了多项全基因组表达谱分析实验。这些数据与来自CML患者CD34+细胞的数据集进行了平行分析。+ 伊马替尼处理前后造血干细胞的分析揭示了三个在酪氨酸激酶抑制剂耐药细胞中共同上调的基因（一个转录因子[c-Fos]、双特异性磷酸酶1[Dusp1]和一个RNA结合蛋白[Zfp36]）。为了验证这些基因在介导药物耐药性中的重要性，我们进行了逐步实验 体外 和 体内 分析。通过在耐药细胞中进行实时定量PCR（RT-qPCR）和蛋白质印迹实验，验证了这些基因的表达水平。进一步利用shRNA发夹结构对c-Fos、Dusp1和Zfp36进行cDNA过表达和敲低实验，结果表明，c-Fos和Dusp1表达水平的升高足以且必需介导酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐药性。因此，我们仅针对c-Fos和Dusp1在小鼠模型中进行了体内验证。为对c-Fos和Dusp1进行遗传学验证，我们构建了ROSACreERT诱导型c-Fosfl/fl 小鼠（条件性基因敲除）14 并与 Dusp1 杂交-/- （完全敲除）15 以制作 ROSACreERT2-c-Fosfl/flDusp1-/- 双转基因小鼠。骨髓来源的 c-Kit+ 细胞（来自 c-Fos）fl/fl-，Dusp1-/-- 和 c-Fosfl/flDusp1-/-表达BCR-ABL1的细胞被分析 体外 在菌落形成单位（CFU）实验中，以及 体内 通过将骨髓移植至致死剂量照射的小鼠体内，检测单独或联合缺失c-Fos和Dusp1对白血病发生的影响。同样，使用DFC（二氟化姜黄素）对c-Fos进行化学抑制16 以及通过BCI（苯亚甲基-3-(环己氨基)-2,3-二氢-1H-茚-1-酮）抑制Dusp117 在体外和体内利用表达BCR-ABL1的骨髓来源c-Kit+ 来自野生型（WT）小鼠的细胞。为了验证c-Fos和Dusp1在白血病干细胞中的必要性，我们采用了一种慢性髓系白血病（CML）小鼠模型，该模型通过多西环素诱导在干细胞中特异性表达BCR-ABL1（Tet-转录激活因子在小鼠干细胞白血病（SCL）基因3'增强子调控下表达）18,19我们使用了骨髓 Lin-Sca+c-Kit+ (LSK) 细胞进行体内移植实验。此外，我们分别将磷酸化 p38 水平和 IL-6 表达确立为 Dusp1 和 c-Fos 抑制作用的药效动力学生物标志物。 体内最后，为了增强研究对人类的相关性，采用患者来源的CD34+ 细胞（相当于 c-Kit）+ 来自小鼠的细胞经过长期体外培养起始细胞检测（LTCIC）以及慢性髓性白血病的人源化小鼠体内模型验证20,21将慢性髓性白血病（CML）的CD34+细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，随后进行药物治疗并分析人源白血病细胞的存活情况。
在本项目中，我们利用遗传学和化学工具，结合不同的临床前模型，开发靶点识别与验证的方法。这些方法可成功应用于其他靶点的验证，并为治疗开发研制相应的化学干预手段。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;生物材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro（康宁）</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro（康宁）</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Cellgro（康宁）</td><td>15-016-CVR</td><td></td></tr><tr><td>RetroNectin 重组人纤连蛋白片段</td><td>Takara</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434（小鼠CFU用甲基纤维素）</td><td>干细胞</td><td>3434</td><td></td></tr><tr><td>经典甲基纤维素人类集落形成单位培养基（MethoCult H4434 Classic）</td><td>干细胞</td><td>4434</td><td></td></tr><tr><td>4-羟基他莫昔芬</td><td>Sigma</td><td>H6278</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 SCF</td><td>Prospec</td><td>CYT-275</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 Flt3-配体</td><td>Prospec</td><td>CYT-340</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-6</td><td>Prospec</td><td>CYT-350</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>DFC</td><td>LKT Laboratories Inc.</td><td>D3420</td><td></td></tr><tr><td>BCI</td><td>Chemzon Scientific</td><td>NZ-06-195</td><td></td></tr><tr><td>伊马替尼</td><td>LC实验室</td><td>I-5508</td><td></td></tr><tr><td>姜黄素</td><td>Sigma</td><td>458-37-7</td><td></td></tr><tr><td>NDGA</td><td>Sigma</td><td>500-38-9</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Cellgro（康宁）</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>亚特兰大生物制品</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶EDTA 1×</td><td>Cellgro（康宁）</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>1× PBS</td><td>Cellgro（康宁）</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Cellgro（康宁）</td><td>25-005-CL</td><td>5 mg/mL 储存液（溶于水）</td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Gibco（Life Technologies）</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>硫酸鱼精蛋白</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>5 mg/mL 水溶液储存液</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Cellgro（康宁）</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>罗氏</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;大孔径圆盘滤器</td><td>PALL</td><td>2016-10</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 尼龙细胞滤网</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>FICOL（Histopaque 1083）（多蔗糖）</td><td>Simga</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>康宁</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>罗氏</td><td>CO-RO</td><td></td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂混合物 2</td><td>Sigma</td><td>P5762</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1620115</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura 化学发光底物（化学发光底物）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>CD5</td><td>eBioscience</td><td>13-0051-82</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience</td><td>13-0112-75</td><td></td></tr><tr><td>CD45R（B220）</td><td>BD 生物科学</td><td>553092</td><td></td></tr><tr><td>CD45.1-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0453-85</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0454-83</td><td></td></tr><tr><td>hCD45-FITC</td><td>BD 生物科学</td><td>555482</td><td></td></tr><tr><td>抗生物素-FITC</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-857&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗-7-4</td><td>eBioscience</td><td>MA5-16539</td><td></td></tr><tr><td>抗Gr-1（Ly-6G/c）</td><td>eBioscience</td><td>13-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>抗Ter-119</td><td>eBioscience</td><td>13-5921-75</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>558612</td><td></td></tr><tr><td>CD117 APC&amp;nbsp;</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>553356</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharm Lyse</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm（固定和破膜溶液）</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>BD 固定/破膜缓冲液&amp;nbsp; （磷酸流式检测用的透化与洗涤液）</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>磷酸化 p38</td><td>细胞信号传导技术</td><td>4511S</td><td></td></tr><tr><td>总p38</td><td>细胞信号传导技术</td><td>9212</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG 对照</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>554121</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Invitrogen</td><td>K278001</td><td></td></tr><tr><td>2x HBS</td><td>Invitrogen</td><td>K278002</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>毛细血管采血管</td><td>Fisher</td><td>22-260-950</td><td></td></tr><tr><td>采血管</td><td>Giene Bio-One</td><td>450480</td><td></td></tr><tr><td>新生牛血清</td><td>亚特兰大生物</td><td>S11295</td><td></td></tr><tr><td>促红细胞生成素</td><td>安进</td><td>5513-267-10</td><td></td></tr><tr><td>人 SCF</td><td>Prospec</td><td>CYT-255</td><td></td></tr><tr><td>人IL-3</td><td>Prospec</td><td>CYT-210</td><td></td></tr><tr><td>G-SCF</td><td>Prospec</td><td>CYT-220</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Prospec</td><td>CYT-221</td><td></td></tr><tr><td>MyeloCult（LTCIC 检测用培养基）</td><td>干细胞技术</td><td>5100</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松琥珀酸钠</td><td>干细胞技术</td><td>7904</td><td></td></tr><tr><td>MEM α</td><td>Gibco</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc 低剂量U-100胰岛素注射器，28 G1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>研钵和研杵</td><td>Coor tek&amp;nbsp;</td><td>60316 和 60317</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷（Isothesia TM）</td><td>Butler Schien</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>SOC</td><td>New England Biolabs</td><td>B90920s</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>100 mg/mL 水溶液储存液</td></tr><tr><td>Bacto 琼脂（琼脂）</td><td>Difco</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>优质肉汤</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Genemate</td><td>E-3119-500</td><td></td></tr><tr><td>多西环素饲料</td><td>TestDiet.com</td><td>52662</td><td>改良型 RMH1500，可高压灭菌 5LK8&amp;nbsp; 含 0.0625% 多西环素&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>他莫昔芬</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>碘硝基四唑氯化物&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I10406</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;试剂盒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dneasy 血液 &amp;amp；组织试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green（含Green上样染料的Taq DNA聚合酶）</td><td>Promega</td><td>M1722</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit&amp;nbsp; （RNA提取试剂盒）</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td></td></tr><tr><td>DNA酶去DNA试剂盒（用于RT-PCR的DNA酶处理）</td><td>Ambion，Life Technologies</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III 第一链合成（用于 cDNA 合成的逆转录酶）</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green（用于qPCR的含绿色嵌入染料的taq聚合酶混合物）</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1725270</td><td></td></tr><tr><td>CD117 MicroBead 试剂盒</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-224</td><td></td></tr><tr><td>人类长期培养起始细胞检测</td><td>干细胞技术</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NAPCO 系列 8000 WJ CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>摆桶式转子离心机 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-10 自动细胞计数仪</td><td>伯乐（Bio-RAD）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-1000 梯度PCR仪</td><td>伯乐（Bio-RAD）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Real Plex 2</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc 成像系统（凝胶和蛋白质印迹成像系统）</td><td>伯乐（Bio-RAD）</td><td>17001401</td><td></td></tr><tr><td>Hemavet（血细胞计数仪）</td><td>Drew-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II（流式细胞仪）</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fortessa I（流式细胞分析仪）</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaII（FACS 分选仪）</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁力架</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>辐照仪</td><td>&amp;nbsp;J.L. Shepherd 和 Associates，美国加利福尼亚州圣费尔南多</td><td>Mark I Model 68A</td><td>铯-137 源</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;小鼠&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSACreERT2</td><td>杰克逊实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scl-tTA&amp;nbsp;</td><td>Dr. Claudia Huettner&amp;rsquo;s 实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BoyJ&amp;nbsp;</td><td>辛辛那提儿童医院医学中心小鼠核心设施</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6&amp;nbsp;</td><td>杰克逊实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NSGS</td><td>辛辛那提儿童医院医学中心小鼠核心设施</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSACreERT2/c-Fos&lt;sup&gt;fl/fl &lt;/sup&gt;Dusp1&lt;sup&gt;-/-&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSACreERT2/c-Fosfl/fl</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;细胞&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BaF3</td><td>哈佛医学院波士顿分校 George Daley 惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WEHI</td><td>哈佛医学院波士顿分校 George Daley 惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CML-CD34+ 和正常 CD34+ 细胞</td><td>辛辛那提大学医院，辛辛那提大学</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

评估 c-fos 和 dusp1 在癌基因依赖性中作用的方法

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）在治疗慢性髓性白血病（CML）中的成功应用，标志着癌症治疗进入了一个新时代。然而，仍有一小部分细胞对TKI治疗无反应，导致微小残留病（MRD）的存在；即使是效力最强的TKIs也无法根除这些细胞。这些MRD细胞可作为治疗耐药的储备库。目前尚不清楚TKI治疗为何对MRD细胞无效。已有研究表明，生长因子信号通路在TKI治疗期间支持MRD细胞的存活，但其具体机制仍不明确。近期研究发现，由于癌基因信号与生长因子信号在MRD细胞中汇聚，导致c-Fos和Dusp1表达升高，从而介导了TKI耐药性。通过遗传或化学手段抑制c-Fos和Dusp1可使CML对TKIs高度敏感，并在基因工程小鼠模型和人源化小鼠模型中实现CML的治愈。我们利用TKI敏感与耐药细胞的多个微阵列数据鉴定出这些靶基因。本文提供了在体外和体内小鼠模型中进行靶点验证的方法。这些方法可便捷地应用于任何靶基因的遗传学验证及治疗开发。

癌基因成瘾被认为是酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）治疗有效的机制之一。然而，驱动癌基因依赖性的具体机制尚不清楚。我们进行了多项无偏倚的基因表达分析，以鉴定参与调控这种成瘾状态的遗传组分。这些分析揭示了在不依赖癌基因信号通路存活、因而对TKI治疗不敏感的癌细胞中，c-Fos、Dusp1和Zfp36三个基因的表达上调。通过shRNA介导的敲低使c-Fos和Dusp1表达下调，足以恢复原本对TKI耐药细胞的药物敏感性。
为了验证c-Fos和Dusp1在白血病中作为治疗靶点的作用，首先使用表达BCR-ABL1癌基因的BaF3细胞确认了它们的过表达。在BaF3-BA细胞中，生长因子信号通路消除了对癌基因的依赖性；因此，这些细胞对酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗无反应。通过RT-qPCR和蛋白质印迹法进行的定量表达分析证实，c-Fos和Dusp1均受BCR-ABL1诱导，并且其表达在生长因子IL-3存在下进一步增强（图 1A</...

本文描述了利用体外和体内遗传学方法以及人源化小鼠模型，对c-Fos和Dusp1作为白血病药物靶点进行遗传学和化学验证的实验方案。该方法可广泛应用于任何靶点的遗传学验证及治疗开发。

评估 c-Fos 和 Dusp1 在癌基因依赖性中作用的方法

酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）在治疗慢性髓系白血病（CML）中的应用，标志着癌症治疗领域迎来了一个新时代。然而，……

该方法有助于解答癌症治疗领域中的关键问题，例如鉴定参与癌基因依赖性的关键基因。该技术的主要优势在于利用了多种激酶驱动型癌症中普遍存在的癌基因依赖性，因此可适用于多种肿瘤类型。尽管该方法可为白血病研究提供见解，但也同样适用于其他系统，如肺癌、脑瘤和胰腺癌等实体瘤。通常，由于缺乏分子生物学和细胞生理学方面的经验，初次接触该方法的研究人员会遇到困难。首先，从安乐死的小鼠中取出腿骨。用手术刀清除骨骼上的组织。然后将骨骼置于冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中，并用研杵研碎骨骼。接着，使用10毫升移液管将细胞悬液通过70微米细胞滤网过滤至50毫升螺口离心管中。用预冷的PBS多次冲洗研钵和研杵，并将冲洗后的细胞悬液一并加入50毫升离心管中。接下来离心骨髓并用真空泵和玻璃移液管吸除上清液。用5毫升PBS重悬细胞沉淀。使用移液器将悬浮的骨髓缓慢加至室温的聚蔗糖溶液顶部。此后，将聚蔗糖在400 ×g 条件下离心20分钟，离心时关闭刹车。离心结束后，用移液器收集浑浊的总单个核细胞界面，并转移至一个新的15毫升离心管中。用PBS将体积调至10毫升，并取出20 µL用于细胞计数。离心后，弃去上清液，将沉淀置于冰上。接着，用含EDTA和BSA的PBS重悬细胞沉淀。向细胞悬液中加入CD117磁珠，涡旋混匀。此后，在 4 摄氏度下将悬液孵育 10 分钟。然后用含 EDTA 和 BSA 的 PBS 将体积补至 10 毫升，在 4 摄氏度下以 1200 ×g 离心 5 分钟。用真空泵吸去上清液，并将细胞沉淀重悬于含 EDTA 和 BSA 的 PBS 中。然后将3毫升含EDTA和BSA的PBS加入置于磁力架上的磁性柱中，并使其流入收集管。待缓冲液完全流过柱子后，加入细胞悬液，并使其流过柱子进入收集管。接着向柱中再加入5毫升含EDTA和BSA的PBS，并立即用推杆冲洗柱子。取出活塞，并在计数细胞前重复冲洗。离心细胞后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于完全IMDM培养基中进行培养。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养过夜。首先，将逆转录病毒质粒DNA、包装质粒、氯化钙和水在1.5毫升离心管中混合。然后，在另一支1.5毫升离心管中加入500微升HBS。在涡旋振荡器调至最低转速持续混匀的同时，将转染混合物逐滴加入含有HBS的离心管中。将转染混合物在室温下孵育20至30分钟。在孵育期间，向HEK细胞中加入氯喹，并将细胞置于培养箱中。加入转染混合物后，将细胞在37摄氏度、5%CO2的培养箱中孵育8小时，并通过非常缓慢地加入14毫升新鲜DMEM10培养基更换细胞培养液。沿培养皿壁缓慢移液有助于防止HEK细胞脱落。随后将细胞在37摄氏度、5% CO2的培养箱中孵育过夜。使用10毫升注射器收集病毒上清液。然后将一个0.45微米的注射器滤器连接到注射器上。将病毒上清液推入一个新的收集管中。约16小时后收集病毒上清液。此后，向未经处理的6孔培养板中加入2毫升PBS中的重组人纤连蛋白片段。次日，使用移液器从培养板中移除纤连蛋白。用含2% BSA的PBS封闭培养板，并在室温下孵育30分钟。使用真空泵吸除 BSA，并用 PBS 洗涤孔板，然后再次使用真空泵吸去 PBS。随后立即加入过滤后的病毒上清液，并将孔板离心两小时。用真空泵吸去上清液后，再次离心孔板。接下来用真空泵吸去上清液，并用 PBS 洗涤病毒包被的孔板。再次用真空泵吸去 PBS，向病毒包被的孔板中加入先前培养的 c-Kip 阳性小鼠细胞。离心后，将细胞置于 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育。转导后48小时，通过离心收集细胞，并将其重悬于FACS缓冲液1中。首先将含细胞因子的甲基纤维素在室温下解冻，然后在FACS管中分装3毫升甲基纤维素。向3毫升甲基纤维素中加入100微升含有适当抑制剂的细胞悬液。然后以高速涡旋振荡悬液10至30秒。待大部分气泡逸出后，用1毫升注射器将1毫升培养基接种至三个重复培养皿中。将培养皿放入一个大的培养皿中，并放入一个含有无菌水的敞口培养皿。然后盖上大培养皿，在37°C条件下培养细胞。通过将10毫克碘硝基四唑氯化物溶解于10毫升水中，制备碘硝基四唑氯化物染色液。使用带有0.2微米滤器的鲁尔锁式注射器对染色液进行过滤除菌。在组织培养超净台内，将100微升染色液逐滴加入CFU平板周围。然后将平板置于细胞培养孵育箱中，在37摄氏度下孵育过夜。最后，待菌落变为深红棕色后，在无菌细胞培养操作台中使用白色背景对染色的CFU平板进行拍照。在本方案中，采用了多种无偏倚的基因表达分析方法，以鉴定协调癌基因成瘾性的遗传组分。为了验证c-Fos和Dusp1作为白血病治疗靶点的作用，通过表达BCR-ABL1癌基因的细胞确认了它们的过表达。通过RT-qPCR和蛋白质印迹分析证实，c-Fos和Dusp1均受BCR-ABL1诱导，且其表达可被生长因子IL-3增强。通过FACS分选YFP阳性表达细胞，用于后续的体外和体内实验。结果表明，单独敲除c-Fos或Dusp1均可抑制集落形成单位（CFU）数量。缺乏 c-Fos 和 Dusp1 的细胞在形成集落的能力上显著受损，而伊马替尼处理则清除了所有的集落形成单位（CFUs），表明 c-Fos 和 Dusp1 的缺失与 BCR-ABL1 表达之间存在合成致死关系。在此进展之后，该技术为癌症领域的研究人员探索驱动癌基因依赖性的遗传网络和基因，以及这些基因如何影响小鼠模型和人类患者的特定反应铺平了道路。请务必注意，操作逆转录病毒和患者样本可能具有极高危险性，在执行该实验流程时应严格遵守实验室安全规范。

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科研

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癌症研究

c-fos 和 dusp1 在癌基因依赖性中的作用评价方法

本视频介绍了通过逆转录病毒在慢性髓系白血病细胞系中转移目的基因以进行基因验证的实验方案。逆转录病毒作为媒介，通过称为转导的过程将遗传物质导入白血病细胞，从而实现目的基因的长期表达。该方法可应用于任何目的细胞，用于基因功能验证及治疗开发。...

逆转录病毒介导的转导：一种将目的基因导入癌细胞的方法

焦点形成实验提供了一种简单直接的方法，用于评估候选癌基因的转化潜能。...

焦点形成：一种基于细胞的检测基因致癌潜能的实验方法

本实验方案演示了如何在果蝇（Drosophila）眼/触角成虫盘（EAD）中生成带有荧光标记且遗传背景明确的克隆肿瘤。方案详细描述了如何从三龄幼虫中解剖出EAD和脑组织，并对其进行处理，以观察和定量基因表达变化及肿瘤侵袭性。...

Drosophila 幼虫盘肿瘤模型：利用遗传镶嵌体可视化与定量分析基因表达及肿瘤侵袭性

确定能够从临床前测试顺利过渡到人体试验的新药物靶点是当前科学研究的重点。为此，本文介绍了一种功能基因组学方法，用于研究基因耗竭对癌细胞系球状体的影响，该模型能更真实地模拟人类癌症 体内.

利用功能基因组筛选鉴定肿瘤细胞球状培养物中潜在的新型药物靶点

本文描述了一种基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）CRISPR-Cas9...

基于CRISPR-Cas9的竞争性筛选实验探究基因依赖性

CRISPR/sgRNA 文库已应用于研究蛋白质编码基因。然而，sgRNA 文库在揭示 CTCF 边界在基因调控中功能方面的可行性仍尚未探索。本文中，我们描述了一种针对 HOX 位点的特异性 sgRNA 文库，以阐明 CTCF 边界在 HOX...

HOX 基因座靶向的CRISPR/sgRNA文库筛选鉴定关键CTCF边界

内在无序结构域对致癌融合转录因子的功能具有重要作用。为了靶向治疗这些蛋白，需要更深入地理解这些结构域所采用的调控机制。本文中，我们利用转录组学方法，绘制尤因肉瘤中内在无序的 EWS...

利用转录组学分析绘制无序致癌转录因子的结构-功能关系

本文展示了敲低FAM83A的实验步骤，以及检测其对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力影响的检测方法，并探讨了这些细胞对顺铂敏感性的变化。本研究为宫颈癌提供了一个有前景的靶基因，也为后续药物研究提供了参考依据。...

敲低FAM83A以验证其在宫颈癌细胞生长及顺铂敏感性中的作用

本研究描述了一种通过胰腺导管细胞系的RNA-seq分析，探究pH值改变对癌基因表达影响的实验方案。...

胰腺导管细胞系中pH改变条件下的癌基因表达分析

要理解癌症的恶性行为，需要建立准确的模型来研究肿瘤细胞与肿瘤微环境组分（如巨噬细胞）之间的相互作用。本文介绍了两种研究胶质母细胞瘤细胞与肿瘤相关巨噬细胞及小胶质细胞相互作用的方法，通过这些方法可评估其对胶质母细胞瘤侵袭能力的影响。...

共培养实验研究巨噬细胞和小胶质细胞对胶质母细胞瘤侵袭的促进作用

学习利用遗传和化学方法验证c-Fos与Dusp1作为白血病药物靶点的实验方案。该技术适用于多种激酶驱动的癌症类型，为肿瘤靶向治疗研究提供重要框架。

评估 c-Fos 和 Dusp1 在癌基因依赖性中作用的方法

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