Name: 68加标记精氨酸甘氨酸 (rgd)-肽的血管生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 学习使用镓-68标记RGD肽的放射性化学方法，用于肿瘤血管生成成像研究。该技术为癌症诊断和αvβ3整合素靶向治疗提供了简化的实验方案。

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本工作由韩国国家研究基金会（NRF）的核研究与开发项目资助，该项目由韩国政府资助（编号：2017M2A2A6A02019904）。

所有动物实验均按照韩国放射医学科学研究所动物研究委员会批准的《研究用动物护理与使用指南》中的规程进行。所有试剂和溶剂均直接购入后使用，未经进一步纯化。NOTA-RGD-多肽的制备参照文献方法15。
警告：68Ga 会发射正电子和伽马射线。所有涉及直接或间接接触放射性物质的实验，必须仅由经过培训并获得许可的人员进行。操作放射性物质时，应使用适当的防护设备、屏蔽装置、辐射剂量计胸章和指环、以及辐射巡检仪。
1. 使用68GaCl3对RGD肽进行放射性标记
注意：68Ga（半衰期 t1/2 = 68 分钟，β+ 衰变比例为 89%，电子俘获 EC 为 11%）由 68Ga/68Ge 发生器获得。
<ol>
	<li>洗脱 68GaCl3 从发生器中用4 mL 0.05 M盐酸洗脱。</li>
	<li>在80 °C下用氮气吹扫30分钟以干燥 68GaCl3 (333 kBq，1 mL) 置于 5 mL 反应小瓶中。</li>
	<li>将 RGD-肽溶液（100 µg）溶于 1 M 醋酸钠缓冲液（100 µL，pH 5–6）中，加入含有反应物的反应小瓶 68GaCl3 从步骤 1.2 开始。</li>
	<li>将反应混合物在 80 °C 下加热 5 分钟，然后冷却至室温。</li>
	<li>采用高效液相色谱法（HPLC）纯化粗产物。使用以下系统：C-18色谱柱，流速0.5 mL/min，乙腈梯度洗脱斜率为1.17%/min（30分钟内从5%升至40%），流动相组分：A = 含0.1%三氟乙酸（TFA）的乙腈，B = 含0.1% TFA的水。 
	注意：高效液相色谱仪配备有光电二极管阵列检测器和放射性检测器。 68Ga-RGD-多肽在12.5分钟的保留时间被收集（图2).</li>
	<li>纯化所得产物 68使用固相萃取系统提取 Ga-RGD-肽。
	<ol>
		<li>将溶液通过C18反相小柱，并用2 mL生理盐水洗涤。</li>
		<li>洗脱 68Ga-RGD-多肽加入0.7 mL 95%乙醇，80 °C下通氮气除去溶剂，20 min后使用前用磷酸盐缓冲液（PBS）重新溶解。</li>
		<li>将放射性标记产物通过0.22 µm无菌滤器过滤，并用1 mL无菌生理盐水配制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过放射性薄层色谱法（TLC）检测放射化学产率。
	<ol>
		<li>在即时薄层色谱板（ITLC，长10 cm）上点样1 µL。将色谱板置于含有洗脱剂（0.1 M柠檬酸水溶液，pH 5.0）的展开 chamber 中展开，至展开剂前沿距点样点9 cm处停止。 
		注意：保留因子为 68Ga-RGD-肽为0，未反应物的保留因子 68Ga3+ 是 1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据放射性与非放射性物质的比值，计算最终的比活度，单位为 MBq/nmol。 
	注意：在注射100 µL配制好的溶液后 68将Ga-RGD肽注入HPLC，根据非放射性Ga-RGD肽的标准校准曲线计算非放射性组分的含量。</li>
</ol>
2. 体外 细胞摄取
注意：Uppsala 87 恶性胶质瘤（U87MG）人胶质母细胞瘤细胞培养于添加了10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中。细胞在37 °C、5% CO2湿度环境下的150 mm培养皿中培养。细胞通过胰蛋白酶消化法收获或传代：在37 °C条件下，使用含0.25%（w/v）胰蛋白酶和0.02%（w/v）乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS溶液处理3–5分钟。
<ol>
	<li>以每孔 1 × 106 个细胞的密度将 U87MG 细胞接种至 6 孔板中。</li>
	<li>在 37 °C 条件下，用 68Ga-RGD-肽（111 kBq）孵育细胞，孵育时间分别为 30、60、90 和 120 分钟。每个时间点设三个重复样本。</li>
	<li>用 2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，随后通过胰蛋白酶消化收集细胞。使用含 0.25%（w/v）胰蛋白酶和 0.02%（w/v）乙二胺四乙酸（EDTA）的 PBS 溶液，在 37 °C 孵育 3–5 分钟。</li>
	<li>收集细胞悬液（500 µL），并在 γ 计数器中进行测量。</li>
	<li>通过以下公式计算细胞对化合物的摄取率：摄取率（%）=（细胞内计数 / 总计数）× 100%。</li>
</ol>
3. 体外 血清稳定性
<ol>
	<li>加入500 µL新鲜配制的小鼠血清、500 µL人血清和500 µL PBS。在37 °C下孵育混合物2小时。</li>
	<li>在指定时间点（30、60、90和120分钟）通过ITLC进行分析。取1–2 µL混合物样品点样至ITLC板上（流动相：0.1 M柠檬酸）。按步骤1.7所述展开薄层板。 
	注意：68Ga3+预计随溶剂前沿移动，而标记化合物将停留在原点。</li>
</ol>
4. 脂溶性的测定
<ol>
	<li>向正辛醇-PBS体系（1:1，v/v，总体积1 mL）中加入68Ga-RGD肽（3.7 MBq，3.7 µL）。</li>
	<li>在室温下剧烈振荡混合小瓶5分钟，并在室温下以10,000 × g离心5分钟。</li>
	<li>从每一层取100 µL样品，用γ计数器测量放射性活度。报告的log P值基于三个样品的平均值。</li>
</ol>
5. 肿瘤模型
注：本研究使用 BALB/c 裸鼠（6 - 8 周龄，雌性，n = 23）。在肿瘤体积达到 200 - 300 mm3（植入后 1 - 2 周）时，将小鼠用于 PET 研究（n = 3）和生物分布研究（n = 20）。
<ol>
	<li>将肿瘤细胞装入28 G、1/2英寸的胰岛素注射器中。</li>
	<li>在100 µL PBS中注入5 × 106个U87MG细胞至小鼠左前肢区域。</li>
	<li>在细胞注射过程中，使用含2%异氟烷的氧气对小鼠进行麻醉。
	<ol>
		<li>用镊子夹住小鼠右后足脚趾间皮肤，若其足底回缩反射消失，则表明小鼠已进入麻醉状态。在小鼠恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得将其无人看管。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 体内 α的定量分析vβ3 整合素PET成像
<ol>
	<li>用氧气中的2%异氟烷麻醉小鼠。
	<ol>
		<li>通过用镊子夹住小鼠右后足脚趾间部位，确认其足底回缩反射消失，以确保小鼠已进入麻醉状态。在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得将其无人看管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将头部置于PET扫描仪孔径的中心位置。</li>
	<li>静脉注射给予 68向异种移植小鼠模型注射 Ga-RGD-多肽溶液（7.4 MBq，200 µL） 通过 尾静脉注射持续1分钟。</li>
	<li>同时，以列表模式（动态扫描）进行持续150分钟的PET扫描。 
	注意：原始PET数据由用户自定义的时间框架进行重建（即每30分钟一次）。PET扫描完成后，进行微型计算机断层扫描（micro-computed tomography, CT）以进行衰减校正（X射线参数：50 kVp，0.16 mA）。</li>
</ol>
7. 离体 生物分布
<ol>
	<li>注射 68通过尾静脉向异种移植小鼠模型注射 Ga-RGD-肽（0.37 MBq，200 µL）。注射过程中，使用 2% 异氟烷氧气混合气体麻醉小鼠。 
	注意：如第5节所述，将BALB/c裸鼠分为四组，并在不同时间点处死n 每组5个</li>
	<li>给药后立即唤醒小鼠 68Ga-RGD-肽，并在注射后30、60、90和120分钟时通过二氧化碳安乐死处死动物。 
	注意：已提取目标组织，所选靶组织包括血液、肌肉、心脏、肺、肝、脾、胃、肠、肾、骨和肿瘤。</li>
	<li>称取组织重量，并使用γ计数器测量放射活性。 
	注：结果以每克组织中注入剂量的百分比（% ID/g）表示。</li>
</ol>

<ol><li>Friedlander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+Two+Angiogenic+Pathways+by+Distinct+alpha+v+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Definition of Two Angiogenic Pathways by Distinct alpha v integrins.</a> Science. 270 (5241), 1500-1502 (1995).</li>
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<li>Haubner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylated+RGD-containing+peptides%3A+tracer+for+tumor+targeting+and+angiogenesis+imaging+with+improved+biokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glycosylated RGD-containing peptides: tracer for tumor targeting and angiogenesis imaging with improved biokinetics.</a> Journal of Nuclear Medicine. 42 (2), 326-336 (2001).</li>
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<li>Clarke, E. T., Martell, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilities+of+trivalent+metal+ion+complexes+of+the+tetraacetate+derivatives+of+12-%2C+13-+and+14-membered+tetraazamacrocycles%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Stabilities of trivalent metal ion complexes of the tetraacetate derivatives of 12-, 13- and 14-membered tetraazamacrocycles.</a> Inorganica Chimica Acta. 190 (1), 37-46 (1991).</li>
<li>Clarke, E. T., Martell, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilities+of+the+Fe%28III%29%2C+Ga%28III%29+and+In%28III%29+chelates+of+N%2CN%E2%80%B2%2CN%E2%80%B3-triazacyclononanetriacetic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Stabilities of the Fe(III), Ga(III) and In(III) chelates of N,N′,N″-triazacyclononanetriacetic acid.</a> Inorganica Chimica Acta. 181 (2), 273-280 (1991).</li>
<li>Shetty, D., Lee, Y. S., Jeong, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((68Ga-labeled+radiopharmaceuticals+for+positron+emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Medicine+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">68Ga-labeled radiopharmaceuticals for positron emission tomography.</a> Nuclear Medicine Molecular Imaging. 44 (4), 233-240 (2010).</li>
<li>Shin, U. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+Preliminary+Evaluation+of+68Ga-NOTA-Biphenyl-c%28RGDyK%29+for+the+Quantification+of+Integrin+%CE%B1v%CE%B23%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+Korean+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Synthesis and Preliminary Evaluation of 68Ga-NOTA-Biphenyl-c(RGDyK) for the Quantification of Integrin αvβ3.</a> Bulletin of the Korean Chemical Society. 38 (12), 1415-1418 (2017).</li>
<li>Cai, W., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodality+Molecular+Imaging+of+Tumor+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis.</a> Journal of Nuclear Medicine. 49, suppl2 113-128 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本研究中，我们介绍了一种靶向αvβ3整合素的放射性多肽的制备方法及其生物学评价。传统的药物开发涉及复杂的流程，需要大量参考物质以及相对较长的评价时间。尽管所提出的方法学无法替代精细的评估过程，但该系统可用于筛选目的，从而显著缩短时间和降低成本。
在过去十年中，许多放射性标记的RGD肽已被广泛研究作为肿瘤成像的放射性示踪剂16为了获得可用于临床试验的有前景放射性药物，应提供系统性的药物开发方法。放射化学可行性、对靶点的高选择性和亲和力、代谢稳定性以及合适的药代动力学是四个主要关注点。对于常规的正电子发射断层扫描（PET）研究，合理的放射化学产率可确保放射性药物的可靠性。高亲和力的问题（&#62; nM）和选择性（&#62; 100倍）也得到满足。在药代动力学方面，候选PET示踪剂能迅速从非靶组织中清除，并在肿瘤中长时间滞留，从而实现较高的靶组织与参考组织比值。候选放射性药物不应产生具有干扰性的代谢产物。 体内 这可能会增加非特异性结合并导致对比度较低的成像。必须评估其综合特...

血管生成是一种以新生血管形成为特征的生物学过程。在众多促血管生成因子中，αvβ3整合素与侵袭性相关，因为该整合素在血管生成性肿瘤血管中高表达，而在正常组织中则无表达1。
具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）结构域的放射性标记受体结合肽对αvβ3整合素受体具有高亲和力，被视为有前景的血管生成显像剂2,3,4,5,6,7。目前已开发出多种用于正电子发射断层扫描（PET）的放射性药物，并在多种动物模型中验证了其生物学特性8,9,10,11。在放射性核素方面，68Ga相较于其他放射性同位素具有多项优势：首先，其获取便捷且经济性好，无需依赖回旋加速器；其次，基于68Ga的放射性药物相比单光子发射计算机断层成像（SPECT）可提供更高的空间分辨率，从而实现更精确的定量分析；最后，68Ga的半衰期为67.71分钟，足以满足小肽或蛋白质类药物的制备需求。
为了与68Ga形成稳定的络合物，已开发出多种螯合剂。代表性螯合剂包括1,4,8,11-四氮杂环十四烷四乙酸（TETA）、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸（NOTA）、二乙烯三胺五乙酸（DTPA）以及N,N'-二(2-羟基苄基)乙二胺-N,N'-二乙酸（HBED）。据报道，NOTA可与68Ga形成高度稳定的络合物（稳定常数对数为30.98）12,13,14。
本研究的目的是提供一种新型放射性多肽开发的简明方案（图1）。以实例说明，我们制备了68Ga标记的RGD多肽，并展示了在异种移植模型中对这些类似物进行生物学评价的方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;sup&gt;68&lt;/sup&gt;Ga/&lt;sup&gt;68&lt;/sup&gt;Ge 发生器</td><td>ITG 公司</td><td>-</td><td>10 mCi&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>盐酸溶液</td><td>Sigma-aldrich</td><td>84429</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma-aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>C18 反相小柱</td><td>Waters</td><td>WAT020515</td><td></td></tr><tr><td>0.22-&amp;mu;m 无菌滤器</td><td>Milllipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>放射性薄层色谱扫描仪</td><td>Bioscan</td><td>AR2000</td><td></td></tr><tr><td>ITLC 色谱纸</td><td>Agilent</td><td>SGI001</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma-aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters</td><td>-</td><td>Waters 1525 系统，包含二元泵、光电二极管阵列检测器（Waters 2998）、放射性检测器（Raytest, Gabi）</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>J.T. Baker</td><td>14-650-359</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma-aldrich</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>T175 培养瓶&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>CLS431080</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240112</td><td></td></tr><tr><td>&amp;gamma;-计数器</td><td>Perkin Elmer</td><td>-</td><td>1480 Wizard 3</td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>326105</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>哈佛仪器</td><td>70-4500</td><td></td></tr><tr><td>micro-PET/CT</td><td>西门子 Inveon</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

制备用于血管生成的68ga标记的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（rgd）肽

Preparing a 68Ga-labeled Arginine Glycine Aspartate (RGD)-peptide for Angiogenesis

αvβ3 整合素是一种异源二聚体黏附分子，参与肿瘤细胞迁移和血管生成。在新生血管形成的肿瘤内皮细胞中，整合素呈过表达，但通常浓度较低。这种特异性表达的αvβ3 使其成为抗血管生成药物和成像药物的有效生物标志物。作为一种功能成像技术，正电子发射断层扫描（PET）可提供有关生化和生理变化的信息 体内，因其在纳摩尔尺度上具有独特的高灵敏度。因此，基于放射性金属的PET放射性药物在肿瘤血管生成的无创定量评估中受到广泛关注。本文提供了一套系统性方案，用于制备一种新型放射性金属标记肽以评估血管生成。该方案包含放射化学纯度、脂溶性、细胞摄取、血清稳定性及药代动力学性质等方面的信息。 68Ga-RGD-多肽是靶向α的一种代表性PET配体vβ3 整合素。在此，我们介绍一种制备 68Ga-RGD-多肽及其生物学功效评价

68GaCl3 与 NOTA-RGD 肽的螯合反应操作简便，放射性标记产率达 99%。反应中的杂质已成功去除，结果如图2所示。68Ga-RGD 肽的放射化学纯度大于 99%，合成结束时的比活度为 90 - 130 MBq/nmol（图3）。
68Ga-RGD-多肽的细胞摄取率在30、60、90和120分钟时分别为1.49%、0.85%、0.36%和0.39%。血清稳定性实验显示，68Ga-RGD-多肽在与人或小鼠血清以及PBS孵育2小时后几乎保持完整（2小时时稳定性&gt;92%）。其分配系数（log P）为2.96，表明具有较高的脂溶性。PET显像显示主要器官（包括肝脏、肾脏、心脏、肌肉和肿瘤）在早期有较高的摄取。然而，在后...

αvβ3 整合素是一种黏附蛋白，其在发生血管生成的活化内皮细胞上高表达。因此，评估该整合素的完整性在肿瘤学研究中具有重要意义。本文介绍一种制备68Ga标记放射性多肽的方法，以及评估其生物学效应的方法。

制备用于血管生成的68Ga标记的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽

αvβ3整合素是一种参与肿瘤细胞迁移和血管生成的异源二聚体黏附分子。该整合素在……中呈过表达状态。

该方法有助于解答在制备镓-68标记的RGD肽及其类似物的生物学评价中的关键问题。该技术的主要优势在于，它是一种用于开发新型放射性金属标记肽的简单系统性方案。本次实验操作将由本机构的博士后Ki-Hye Jung进行演示。首先使用 0.5 摩尔盐酸从放射性标记的镓锗发生器中洗脱放射性标记的三氯化镓。在 80 摄氏度下，用氮气对 5 毫升反应小瓶中的化合物进行吹扫。随后，向干燥的化合物中加入 100 微克精氨酸甘氨酸乙酸或 RGD 肽的一摩尔醋酸钠溶液。将反应混合物在80摄氏度下加热5分钟，随后使其冷却至室温。为通过高效液相色谱纯化粗产物，将溶液加入C18柱，并使溶液通过C18反相小柱。用2毫升生理盐水洗涤小柱，然后用0.7毫升95%乙醇洗脱放射性标记的多肽，接着在氮气氛围下80摄氏度除去溶剂，持续20分钟。将纯化的肽用 PBS 重悬，并将放射性标记产物通过无菌的 0.22 微米滤器过滤。将肽制剂溶于 1 毫升无菌生理盐水中，取 1 微升肽溶液点样于即时薄层色谱板上。然后，将色谱板置于含有 0.1 摩尔/升柠檬酸水溶液的展开室中展开，至展开前沿距点样点 9 厘米处，以测定放射化学产率。为评估肽在体内的细胞摄取情况，将每孔1×10⁶个人源胶质母细胞瘤细胞接种于6孔板中，每孔加入111 kBq的放射性标记RGD肽，在37°C条件下孵育30、60、90或120分钟，每组设三个复孔。孵育结束后，用PBS洗涤两次，每次2 mL；随后在37°C条件下，使用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的PBS溶液消化细胞3至5分钟。接着，将每孔细胞转移至15 mL锥形管中，用γ计数器测定放射性标记肽的摄取量。为评估放射性标记RGD肽的血清稳定性，向每份样品中加入500微升新鲜制备的小鼠血清、500微升人血清以及500微升磷酸盐缓冲液（PBS），再加入50微升样品，将混合物在37摄氏度下孵育最多两小时。分别在孵育30、60、90和120分钟后，取每份样品1至2微升点样于即时薄层色谱板上，并按所示方法展开色谱板。为测定该肽的脂溶性，将10微升放射性标记的RGD肽加入到辛醇-磷酸盐缓冲液（PBS）体系中，在室温下充分振荡混匀5分钟。然后通过离心收集肽，并从每一层中取100 µL样品，用γ计数器进行测量。为建立放射性标记的肿瘤模型，将5 × 10⁶个人源胶质母细胞瘤细胞悬浮于100 µL PBS中，使用配备28号针头的半英寸胰岛素注射器，按每只BALB/c裸鼠一份进行装载，并将肿瘤细胞接种于每只受体鼠的左侧 flank 皮下。为通过正电子发射断层扫描（PET）对肽进行体内定量，将荷瘤且已麻醉的小鼠头部置于PET扫描仪孔内，在进行列表模式PET扫描的同时，于1分钟内经尾静脉向每只异种移植小鼠模型注射200 µL PBS中含有7.4 MBq的放射性标记RGD-肽溶液。进行离体生物分布分析时，将

preparing-68ga-labeled-arginine-glycine-aspartate-rgd-peptide-for

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68加标记精氨酸甘氨酸 (rgd)-肽的血管生成

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学习使用镓-68标记RGD肽的放射性化学方法，用于肿瘤血管生成成像研究。该技术为癌症诊断和αvβ3整合素靶向治疗提供了简化的实验方案。

制备用于血管生成的⁶⁸Ga标记的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽

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