Name: 用化学表观修饰因子重定向细胞机械抑制基因转录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 学习利用化学表观修饰因子和染色质修饰机制在哺乳动物细胞中实现基因特异性可逆调控的方法。该技术通过招募内源性酶调控染色质位点，为表观遗传学研究提供新工具。

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作者感谢Hathaway实验室和Jin实验室成员提供的有益讨论。作者还感谢Dan Crona和Ian MacDonald对稿件的审阅。本工作部分由美国国立卫生研究院（N.A.H.）资助项目R01GM118653支持；以及由美国国立卫生研究院（J.J.）资助项目R01GM122749、R01CA218600和R01HD088626支持。本工作还得到了北卡罗来纳大学教堂山分校Eshelman创新研究所提供的三级资助和学生资助（分别由N.A.H.和A.M.C.获得）。额外的资金支持来自T-32 GM007092项目（A.M.C.）。流式细胞术数据在北卡罗来纳大学流式细胞术核心实验室获得，该实验室由北卡罗来纳大学Lineberger综合癌症中心获得的P30 CA016086癌症中心核心支持拨款资助。

1) 用于生产慢病毒的细胞系培养
<ol>
	<li>在含10%胎牛血清（FBS）、10 mM HEPES、1×非必需氨基酸（NEAA）、青霉素/链霉素（Pen/Strep）和2-巯基乙醇的高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO₂培养箱中培养新鲜的低传代（传代次数少于30次）293T人胚胎肾细胞2每3至5天或在细胞达到完全融合前进行传代培养 &#62; 95% 汇合度。</li>
	<li>传代293T HEK细胞，细胞数量为18 × 106 每15厘米培养皿（每种病毒制备使用一个15厘米培养皿）。
	<ol>
		<li>对于15 cm培养皿，吸除旧培养基，加入10 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS），吸除PBS，再加入3 mL 0.05%胰蛋白酶。将细胞在37 °C孵育8分钟，期间在孵育一半时间时轻轻摇动并轻敲培养皿使细胞脱落。 
		&#8203;注意：此步骤的目的是将细胞制成单细胞悬液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当细胞在次日达到 60%–80% 汇合度时，使用 13.5 µg psPAX2 质粒、4.5 µg pMD2.G 质粒和 18 µg 携带目的基因的慢病毒兼容型递送载体进行聚乙烯亚胺（PEI）转染（即，FKBP-Gal4），108 µL PEI 和 1.8 mL 转染培养基。
	<ol>
		<li>将DNA、PEI和转染培养基在15 mL锥形管中轻轻混匀，室温孵育15分钟，然后逐滴加入15 cm培养皿中。 
		注意：此后步骤请采取适当的安全措施，并遵守所有机构和实验室的安全规程，因为所有试剂均含有活病毒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转染后，在37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育16 h2，吸除培养基，轻轻向15 cm培养皿中加入新鲜的293 HEK培养基（在37 °C水浴中预热）。将细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养2 在换液后继续培养48小时，随后即可收获病毒。</li>
</ol>
2) 慢病毒感染小鼠胚胎干细胞（mESC）
<ol>
	<li>在含20%胚胎干细胞级胎牛血清（FBS）、10 mM HEPES、1×非必需氨基酸（NEAA）、青霉素/链霉素（Pen/Strep）、2-巯基乙醇和1:500白血病抑制因子（LIF）的高糖DMEM基础培养基中，于37 °C、5% CO₂培养箱内培养低传代次数（传代次数少于35次）、无饲养层适应的CiA mESCs。2. 
	&#8203;注意：LIF 来自于 COS LIF 产生细胞的上清液，上清液以批次收集，并于 -80 °C 冻存。
	<ol>
		<li>将细胞培养于已用含0.1%明胶的1×PBS预孵育1–3小时并随后用1×PBS洗涤的培养板上。每日更换培养基，根据细胞密度每2–3天传代一次。 
		&#8203;注意：从形态学上看，胚胎干细胞（ES）克隆应体积较小、呈圆形，且彼此分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感染前一天将mESC传代至12孔板（每孔100,000个细胞）。
	<ol>
		<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。对于在10 cm培养皿中培养的细胞，吸除旧培养基，加入5 mL 1×PBS，吸除PBS，再加入1 mL 0.25%胰蛋白酶。将细胞在37 °C孵育8分钟，孵育过程中半程轻轻摇动并轻敲培养皿。此步骤的目的是使细胞充分解离成单细胞悬液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在步骤1.4中对293T15 cm病毒包装细胞更换培养基48小时后，移除上清液并转移至50 mL离心管中。</li>
	<li>离心上清液，300 x g 离心5分钟以沉淀细胞碎片。</li>
	<li>通过0.45 µm滤膜过滤上清液。 
	注意：务必使用无表面活性剂的醋酸纤维素（SFCA）膜，因为某些其他材料可能会吸附病毒，显著降低回收率。</li>
	<li>使用配备SW32转子的超速离心机，以20,000 rpm（约72,000 x g）离心浓缩病毒 g4 °C 条件下孵育 2.5 小时。</li>
	<li>在病毒进行超速离心浓缩的同时，用含有 5 µg/mL 多聚素（polybrene）的新鲜 ES 培养基处理 12 孔板中的 CiA mESCs。</li>
	<li>当病毒浓缩完成后，小心吸除上清液，并将病毒沉淀重悬于100 µL的1x PBS中（避免产生过多气泡）。</li>
	<li>将病毒和1×PBS加入1.5 mL微量离心管中。在300 × g条件下涡旋或振荡混匀。 g （或调至最低档）充分悬浮病毒。将离心管放入小型台式离心机中离心5–10秒以去除气泡。</li>
	<li>向12孔板的每个孔中加入30 µL病毒液。轻轻摇晃培养板，随后在1,000 x g 20 分钟。 
	&#8203;注意：所添加病毒的量可根据病毒滴度进行调整，而病毒滴度与递送载体的大小成反比。
	<ol>
		<li>或者，使用液氮速冻病毒，并于 -80 °C 保存。然而，冷冻病毒会导致病毒滴度降低。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将12孔板放回37 °C培养箱，并于次日早晨（约16小时后）更换新鲜的ES培养基（步骤2.1中所述）。</li>
	<li>感染48小时后，通过添加适当的抗生素筛选整合了病毒质粒的细胞（即，1.5 µg/mL 嘌呤霉素，10 µg/mL 杀稻瘟菌素， 等等。）。每天更换培养基，如果大部分细胞漂浮或死亡，则用1×PBS洗涤细胞。将筛选培养基置于37 °C、5% CO₂培养箱中继续培养细胞72–96 h。2.</li>
</ol>
3）化学表观遗传修饰剂（CEM）的制备与处理
<ol>
	<li>将粉末状CEM用二甲基亚砜（DMSO）溶解，配制成1 mM的储备液，并稀释至100 µM的工作浓度。</li>
	<li>细胞经过72–96小时的筛选后，将mESCs以每孔100,000个细胞的密度接种于12孔板中。在含5% CO2的37 °C培养箱中培养24小时。随后，用ES培养基配制100 nM的CEM培养液，并以每孔1 mL的量加入CiA mESC中进行换液。作为对照，保留一孔未添加CEM的细胞。
	<ol>
		<li>实验期间，每隔24小时通过吸除旧培养基，并每孔加入1 mL新配制的含CEM或不含CEM的ES培养基进行换液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4) 通过显微镜和流式细胞术分析表达
<ol>
	<li>在CEM处理48小时后，使用荧光显微镜对未经CEM处理的细胞以及经100 nM CEM处理的细胞进行成像。使用相差或明场模式在20倍放大下拍摄代表性图像，以记录mESC的形态；细胞应形成圆形克隆，伴有少量分化细胞。在FITC荧光通道下，对两种细胞条件均进行成像。</li>
	<li>吸弃培养基，加入1 mL 1× PBS洗涤细胞，吸弃PBS，每孔加入0.25 mL含EDTA的0.25%胰蛋白酶，作用8–10分钟，收集对照组和CEM处理组细胞用于流式细胞术分析。</li>
	<li>在显微镜下观察，确认细胞不再呈大团块状，使用20倍放大。若细胞未呈现单细胞悬液状态，用P1000移液器轻轻吹打数次，以充分消化细胞。</li>
	<li>用1 mL新鲜培养基终止胰蛋白酶反应，并用血清移液管（或P1000移液器及吸头）高速重悬细胞，直至细胞完全分散为单细胞悬液。</li>
	<li>300 x g 离心细胞 g 5 分钟。吸除上清液。用 1× PBS 洗涤，并重新离心细胞。吸除 PBS 上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于200 mL FACS缓冲液（1 mM 乙二胺四乙酸 [EDTA]、1× PBS 和 0.2% 牛血清白蛋白 [BSA]）中。
	<ol>
		<li>FACS缓冲液的总体积取决于细胞数量，但细胞浓度应为1,000 - 3,000个细胞/µL。对3个样品中的细胞数量进行计数，并计算细胞浓度的平均值。如有需要，可添加更多FACS缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行流式细胞术检测 &#62; 50,000 个细胞与悬浮细胞混合，未分析时保持细胞置于冰上。使用 530/40 滤光片（FITC、AF488、GFP） 等等。) 以记录表达水平的变化。使用未经处理的对照细胞样本确定合适的荧光电压，并调整电压使荧光峰位于记录强度谱的中间位置。以约 5,000 个细胞/秒的鞘流速度运行样本。</li>
	<li>导出数据，并在流式细胞术分析软件中分析FCS文件（即，使用FlowJo软件，首先根据前向散射光进行设门 与 活细胞的侧向散射，然后是前向散射高度 与 单细胞区域。随后，在直方图上可视化GFP通道数据，以确定靶向群体与对照群体中的相对GFP表达水平。</li>
</ol>
5) 通过染色质免疫沉淀（ChIP）结合qPCR分析染色质
<ol>
	<li>将mESCs以每皿300万个细胞接种于10 cm培养皿中，每皿加入10 mL ES培养基（每个实验组或对照组各需一皿）。次日，向各皿中加入10 mL含CEM或不含CEM的培养基。CEM处理48小时后，吸除旧培养基，用5 mL 1×PBS洗涤细胞并吸除。随后用0.25%胰蛋白酶消化细胞，加入10 mL ES培养基终止胰酶反应。计数后，每组条件分离出1000万个细胞样本。</li>
	<li>将每份含1000万细胞的样品在300 x g 5 分钟。</li>
	<li>将每个沉淀重悬于10 mL 1x PBS中，然后以300 x g重新离心细胞 g 5 分钟。</li>
	<li>将每个沉淀重悬于10 mL CiA Fix缓冲液（50 mM pH 8，1 mM EDTA pH 8，0.5 mM乙二醇双（β-氨基乙醚）四乙酸[EGTA] pH 8，以及100 mM氯化钠[NaCl]）中。加入1 mL 11%甲醛溶液，并立即上下颠倒样品5–10次。室温孵育10分钟。</li>
	<li>加入0.5 mL 2.5 M甘氨酸。立即倒置样品，并将样品置于冰上孵育5分钟。</li>
	<li>以 1,200 x g 4 °C下离心5分钟。吸除上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于10 mL CiA Rinse 1（50 mM HEPES pH 8，140 mM NaCl，1 mM EDTA pH 8，10%甘油，0.5% Nonidet P-40 [NP40]，以及0.25% Triton X100）中。将样品置于冰上孵育10分钟。在1,200 x g 4 °C下离心5分钟。</li>
	<li>将沉淀重悬于10 mL CiA Rinse 2溶液（10 mM 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）pH 8，1 mM EDTA pH 8，0.5 mM EGTA pH 8，以及200 mM NaCl）中。将样品在1,200 × g条件下离心 g 4 °C下离心5分钟。</li>
	<li>轻轻沿锥形管管壁加入5 mL CiA剪切缓冲液（0.1% SDS、1 mM EDTA、10 mM Tris，pH 8），以冲洗掉盐分，同时避免扰动沉淀。将样品在1,200 x g 4 °C 下离心 3 分钟。重复洗涤步骤。</li>
	<li>将沉淀重悬于90 µL CiA剪切缓冲液中，并加入新鲜的蛋白酶抑制剂（使用亮抑酶肽、抑酶肽和胃蛋白酶抑制剂A，分别溶于DMSO中配制成每种10 mg/mL的溶液，混合后制成1,000倍储存液，工作终浓度为10 µg/mL）。在保持样品处于冰上的条件下，加入10 µL超声增强纳米液滴。13,14.</li>
	<li>将100 µL溶液转移至玻璃试管中，并盖紧管盖。</li>
	<li>将样品超声处理 3.5 分钟（根据细胞系和细胞数量确定）。若总超声时间超过 2 分钟，为避免样品过热，应以不超过 2 分钟为一个循环周期进行处理。 
	注意：此处使用的聚焦超声破碎仪工作频率较高（500 kHz）。仪器应以55 W的声功率运行。超声处理时间应由各实验室根据具体情况预先确定。</li>
	<li>将每个超声处理的染色质样品转移至新的1.5 mL微量离心管中。以8,000 x g 4 °C下离心2分钟。</li>
	<li>按照ChIP试剂盒制造商的说明书分析剪切效率，并定量染色质的相对含量。 
	注意：通过分光光度法测定DNA浓度（例如使用DNA Nanodrop仪器测定，并将约200 ng DNA在1%琼脂糖凝胶上电泳，以确认染色质已超声破碎至大约200–500碱基对（bp）的大小。</li>
	<li>按照 ChIP 试剂盒制造商的说明书进行免疫沉淀并分离染色质。 
	&#8203;注意：对于DNA浓度较高的样品进行免疫沉淀时，将洗脱缓冲液在37 °C预热，并用30 µL洗脱缓冲液分两次洗脱样品（每次旋转1分钟）。</li>
	<li>进行qPCR时，将试剂加入384孔板中。每孔加入5 µL 2x不对称氰基染料预混液、每种引物至2.5 µM、水以及0.1 - 10 ng DNA。
	<ol>
		<li>设计引物以扩增50–100 bp的扩增片段，CT值通过持家基因——胞内A型颗粒（IAP）进行标准化。 
		注意：有关进一步的qPCR方法，请参见试剂盒制造商的说明书。用于靶向目标的引物序列集 Oct4 目的基因引物序列为：(F) CACATGAAGCAGCACGACTT；(R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC。用于扩增IAP的对照引物序列为：(F) ATTTCGCCTAGGACGTGTCA；(R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC。</li>
		<li>根据引物和目的产物，进行40个循环的qPCR扩增，退火温度为60 °C，持续1分钟。 
		注意：使用样本间的ΔΔCt比较法对所得数据进行定量分析，其中 CiA:Oct4 以IAP为标准化参照。最终分析结果以三份实验样本的平均值表示，误差以均值的标准差表示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了近期开发的CEM系统，该系统可用于以剂量依赖的方式调控特定基因的基因表达及染色质环境。我们提供了一种精确的方法，用于研究通过选择性招募特定的内源性染色质调控蛋白来调节基因表达的动态过程。这是一种高度模块化的技术，可用于探究不同的蛋白质修饰和染色质修饰复合物如何协同作用以正确调控染色质环境，同时也有助于研究这些过程在何种情况下发生失调，并具有实现基因特异性的优势。
本文展示了利用新技术可视化染色质结构和基因表达变化的三种方法。通过CEM对特定靶向位点进行扰动后，可利用荧光显微镜分析基因表达的实时变化。随后，可在预设的时间节点上，通过流式细胞术更定量地测量基因表达水平的变化。最后，通过染色质免疫沉淀（ChIP）检测染色质上翻译后表观遗传修饰的变化；在本实验中，特异性检测了H3K27ac修饰。我们未采用ChIP-qPCR检测HDAC的招募情况，原因是单个基因座上协同作用的HDAC种类繁多。很可能招募的是多种HDAC酶的异质性群体，因此在技术上难以通过ChIP逐一检测所有类型。在先前发表的研究中，我们已证明由GAL4融合蛋白直接招募HDAC3可导致基因表达和染色质修饰发生类似的变...

染色质由缠绕在组蛋白八聚体蛋白周围的DNA构成，该结构形成核小体核心颗粒。染色质压缩程度的调控是实现DNA正确修复、复制和表达的关键机制1,2,3。细胞控制染色质压缩水平的方式之一是通过添加或去除组蛋白尾部的各种翻译后修饰。其中两种重要的修饰包括：（1）赖氨酸乙酰化，通常与基因激活相关；（2）赖氨酸甲基化，其功能取决于氨基酸的上下文环境，可与基因激活或抑制均相关。乙酰化和甲基化修饰的添加分别由组蛋白乙酰转移酶（HATs）和组蛋白甲基转移酶（HMTs）催化完成，而去除这些修饰则分别由组蛋白去乙酰化酶（HDACs）和组蛋白去甲基化酶（HDMs）执行4,5。尽管这些蛋白质的存在已被发现数十年，但关于染色质修饰机制如何精确调控基因表达的许多细节仍有待阐明。由于染色质调控过程在多种人类疾病中出现异常，深入理解其作用机制有望为未来的治疗应用提供新思路。
染色质体内分析（chromatin in vivo assay, CiA）是一种最近报道的技术，利用化学诱导邻近分子（chemical inducer of proximity, CIP）来调控染色质修饰机器向特定基因座的募集6。该技术已被用于研究不断扩展的染色质动态过程，包括组蛋白修饰蛋白、染色质重塑因子和转录因子6,7,8,9。基于CIP的外源表达蛋白染色质锚定技术也已超越CiA的应用范围，通过与失活的成簇规律间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR）相关蛋白（dCas9）联用，实现对未修饰遗传位点的调控10,11。在CiA系统中，小鼠胚胎干细胞（mESCs）经过改造，在Oct4基因座表达一个GFP报告基因，该区域是mESC基因组中高度表达且严格调控的区域。此前，该系统已被用于描述外源表达的异染色质蛋白1（heterochromatin protein 1, HP1）的剂量依赖性和可逆性募集过程；HP1是一种能够结合H3K9me3并传播抑制性修饰（例如，H3K9me3）以及DNA甲基化的酶6。为实现此类募集策略，mESCs被感染一种表达FK506结合蛋白（FK506-binding protein, FKBP）与Gal4融合蛋白的质粒，其中Gal4是一种DNA-蛋白质锚定蛋白，可结合GFP报告基因上游的Gal4结合阵列。同时，细胞也被感染表达一种由FKBP-雷帕霉素结合结构域（FKBP-rapamycin-binding domain, FRB）与HP1融合的蛋白。当mESCs暴露于低纳摩尔浓度的CIP——雷帕霉素时，FRB与FKBP在靶基因座处被拉近并结合。在雷帕霉素处理数天后，目标基因的表达受到抑制，这可通过荧光显微镜和流式细胞术观察到；同时，组蛋白乙酰化水平下降，可通过染色质免疫沉淀（ChIP）和亚硫酸氢盐测序证实。尽管该方法的开发与验证是染色质研究与调控领域的重要进展，但其一个局限在于需要外源表达染色质修饰机器。
为了构建一种仅依赖内源性、生理相关酶类招募的技术，并实现更模块化的系统，我们设计并表征了一类新型双功能分子，称为CEMs（图1）12。CEMs的一个组分包含FK506，与雷帕霉素类似，它能够紧密且特异性地结合FKBP。因此，CEMs仍可被招募至CiA mESCs中的Oct4基因位点。CEMs的另一个组分是能够结合内源性染色质修饰机器的分子片段。在一项初步研究中，我们测试了含有组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂的CEMs。尽管利用抑制剂来招募HDAC看似违反直觉，但该抑制剂仍能将HDAC活性招募至目标基因。这一过程可能通过以下机制实现：（1）将HDAC重定向至目标位点后释放酶，从而增加该区域未受抑制HDAC的密度；（2）在位点处维持HDAC的抑制状态，同时招募能够结合被抑制HDAC的抑制性复合物；或（3）上述两种机制的结合。在先前的研究中，我们已证明CEMs能够以剂量依赖性和时间依赖性的方式有效抑制GFP报告基因的表达，并且这种抑制效应可在短时间内迅速逆转（即，24小时内）12。我们通过荧光显微镜、流式细胞术以及ChIP-qPCR6技术，评估了本文所述CEM技术对基因表达的调控能力及其对染色质环境的控制效果。在此，我们描述了一种使用和表征CEMs的方法，这将有助于推动该系统在染色质生物学相关问题研究中的进一步应用。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013CV</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES（用于组织培养）</td><td>Corning</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>BME（2-巯基乙醇）</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlantic Biologicals</td><td>S11550</td><td>每批次均经质量检测</td></tr><tr><td>Covaris 管</td><td>ThermoScientific</td><td>C4008-632R</td><td></td></tr><tr><td>Covaris 盖帽</td><td>ThermoScientific</td><td>C4008-2A</td><td></td></tr><tr><td>PEI（聚乙烯亚胺）</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>转染培养基（Opti-mem）</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>病毒离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>病毒滤膜</td><td>Corning</td><td>431220</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC134220</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>含 EDTA</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>25400-054</td><td>含 EDTA</td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr</td><td></td></tr><tr><td>杀稻瘟菌素</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green 主混合液（不对称花青染料）</td><td>Roche</td><td>4913914001</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td></td></tr><tr><td>（ChIP 试剂盒）ChIP-IT 高灵敏度试剂盒</td><td>Active Motif</td><td>53040</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Covaris</td><td>E110</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Optima</td><td>XPN-80</td><td></td></tr><tr><td>SW-32 离心转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>14U4354</td><td></td></tr><tr><td>SW-32 Ti 离心吊篮</td><td>Beckman Coulter</td><td>130.2</td><td></td></tr><tr><td>LentiX 293 人胚胎肾细胞</td><td>Clontech</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP9700</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Roche</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>MP Biomedicals</td><td>807426</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Fisher</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>TE 缓冲液</td><td>Fisher</td><td>BP2474-1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES（用于 ChIP）</td><td>Fisher</td><td>BP310-100</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪，Attune NxT</td><td>Thermo Fisher</td><td>A24858</td><td></td></tr><tr><td>FKBP-Gal4 质粒</td><td>Addgene</td><td>44245</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 质粒</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G 质粒</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Nanodroplets</td><td>MegaShear</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DNA Nanodrop</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND1000</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂（亮抑蛋白酶肽）</td><td>Calbiochem/EMD</td><td>108975</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂（抑肽酶）</td><td>Calbiochem/EMD</td><td>230790</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂（胃蛋白酶抑制剂）</td><td>Calbiochem/EMD</td><td>516481</td><td></td></tr><tr><td>CiA:Oct4 mESC</td><td>由 G. Crabtree 惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分泌 Lif-1C-alpha 的 Cos 细胞</td><td>由 J. Wysocka 惠赠</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用化学表观遗传修饰剂重定向细胞机制以抑制基因转录

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

染色质压缩的调控是高等真核生物中控制基因表达的重要过程。尽管在许多疾病中，染色质压缩和基因表达调控常常受到破坏，但长期以来缺乏一种位点特异性、内源性且可逆的方法来研究和控制这些作用机制。为解决这一问题，我们开发并表征了一类新型的双功能基因调控分子。该双功能分子的一个组分可结合于DNA-蛋白质锚定结构，从而被招募至等位基因特异性位点；另一个组分则可招募内源性细胞染色质修饰机器，将这些蛋白引导至目标基因。这类小分子被称为化学表观遗传修饰剂（CEMs），能够以剂量依赖性和可逆的方式调控基因表达及染色质环境。本文详细描述了一种CEM方法及其在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中Oct4位点的绿色荧光蛋白（GFP）报告基因上的应用，用于降低该位点的基因表达和组蛋白尾部乙酰化水平。我们通过荧光显微镜、流式细胞术和染色质免疫沉淀（ChIP）结合定量聚合酶链式反应（qPCR）对先导化合物CEM23进行了表征。尽管该系统在Oct4位点的应用展示了其强大功能，但从概念上讲，CEM技术具有模块化特性，可适用于其他细胞类型及其他基因组位点。

我们近期开发了CEM，并证明该技术能够以剂量依赖性和可逆的方式调控报告基因位点的基因表达和染色质环境。图1展示了先导化合物CEM23的模型。在此情况下，插入到Oct4位点的GFP报告基因作为组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，可将HDAC复合物招募至报告基因位点。
我们旨在表征CiA mESCs中Oct4位点的CEM系统。由于细胞表达GFP，可通过荧光显微镜快速观察报告基因的表达情况。在用100 nM CEM23处理48小时后对细胞进行成像，同时包括未处理的对照细胞。相位图像显示mESCs状态健康，这一点非常重要，因为不健康或已分化的mESCs可能提示GFP表达受到非特异性抑制。荧光图像显示对照组细胞中GFP表达强烈，而经CEM23处理的mESCs中GFP表达降低。代表性图像见图2。
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染色质环境的调控是实现基因正常表达所必需的重要过程。本文中，我们描述了一种通过在特定基因位点可逆性地招募染色质修饰机器来控制基因表达的方法。

染色质压缩的调控是调控高等真核生物基因表达的重要过程。尽管染色质压缩与基因……

该方法有助于解答表观遗传学领域的关键问题，例如基因调控的机制以及不同染色质调控元件之间的因果关系。该技术的主要优势在于，首次能够利用生理条件下具有相关性的内源性酶对染色质位点进行模块化操作。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为小鼠胚胎干细胞培养对于未接受过相关技术培训的人员而言本身具有较高难度。进一步演示该方法至关重要，因为细胞病毒感染步骤较难掌握。研究人员必须同时协调两条独立的细胞培养流程，并且在这些步骤中必须严格监控操作安全。 开始实验方案时，每50厘米培养皿传代1800万个293T-HEK细胞。吸去旧的培养基，加入10毫升1×磷酸盐缓冲液（PBS）。吸去PBS，加入3毫升0.05%胰蛋白酶。将细胞在37摄氏度下用胰蛋白酶孵育8分钟。孵育至一半时间时，轻轻摇晃并轻敲培养容器使细胞脱落。次日，当细胞融合度达到60%至80%时，进行聚乙烯亚胺（PEI）转染。接下来，在15毫升锥形管中轻轻混匀DNA、PEI和转染培养基。将样品在室温下孵育15分钟。孵育结束后，将溶液逐滴加入15厘米培养皿中。然后，将样品置于含5%二氧化碳的37°C培养箱中孵育16小时。第二天，吸除培养基，轻轻加入预热的新鲜293T-HEK培养基至15厘米培养皿中。换液后，将细胞置于37°C、含5%二氧化碳的培养箱中培养48小时。使用血细胞计数板对细胞进行计数。在感染前一天，将先前准备好的小鼠胚胎干细胞（mESC）以每孔100,000个细胞的密度接种至12孔板中。对于在10厘米培养皿中培养的细胞，吸除旧的培养基，加入5毫升1×PBS，随后吸除PBS，并加入1毫升0.25%胰蛋白酶。将细胞在37摄氏度下用胰蛋白酶孵育8分钟，孵育至一半时间时轻轻摇晃并轻敲培养皿以助细胞脱落。换液后48小时，弃去293T-HEK细胞的培养基，并将上清液转移至50毫升锥形管中。在300 × g条件下离心5分钟，以沉淀细胞碎片。接着，使用0.45微米滤膜过滤上清液。利用SW32转子通过超速离心浓缩病毒，在4°C下以72,000 × g离心两个半小时。在病毒进行超速离心浓缩的同时，用含有5微克/毫升Polybrene的新鲜胚胎干细胞（ES）培养基处理12孔板中的CiA mESC。病毒浓缩完成后，小心吸除上清液，并将病毒沉淀物轻轻重悬于100微升1×PBS中，避免产生过多气泡。将病毒和1× PBS加入一个1.5毫升的微量离心管中。在最低转速下涡旋振荡管子，使病毒充分悬浮。在小型台式离心机中离心5至10秒，以去除气泡。向12孔板的每个孔中加入30微升病毒。轻轻摇晃孔板，然后在1000 × g条件下离心20分钟。将12孔板放回37摄氏度培养箱中过夜。次日早晨，更换为新鲜的ES培养基，使感染继续进行48小时。感染48小时后，通过添加适当的抗生素筛选已整合病毒质粒的细胞。每天更换培养基。将筛选培养基作用于细胞，在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中持续培养72至96小时。继续进行化学表观遗传修饰剂（CEM）的配制与处理，将粉末状CEM溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成1毫摩尔的储存浓度和100微摩尔的工作浓度。细胞经过72至96小时的筛选后，将mESC以每孔10万个细胞的密度接种至12孔板中。将细胞置于含5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中培养24小时。培养结束后，用ES培养基配制100纳摩尔CEM的培养液。取1毫升该培养液加入CiA mESC的每个孔中进行换液。保留一个未添加任何CEM的细胞孔作为对照。接下来，在整个实验期间，每隔24小时更换一次培养基，吸除旧的培养基，并向每孔加入1毫升新配制的含CEM或不含CEM的ES培养基。经过48小时的CEM处理后，使用荧光显微镜对未处理组细胞以及经100纳摩尔CEM处理的细胞进行成像观察。使用相差或明场显微镜在10至40倍放大倍数下拍摄代表性图像，以记录mESC的形态。细胞应已形成集落，仅有少量分化细胞。在FITC荧光通道下，对两种细胞状态均进行成像。接下来，通过吸除培养基，用一毫升1× PBS洗涤细胞，吸除PBS，并加入0.25毫升含EDTA的0.25%胰蛋白酶作用8至10分钟，分离对照组和CEM处理组细胞用于流式细胞术分析。在20倍放大倍数下通过显微镜观察，确认细胞不再聚集成大块团块。若细胞尚未完全分散为单细胞悬液，可使用P1000移液器轻轻吹打，使细胞充分消化为单细胞状态。用一毫升新鲜培养基终止胰蛋白酶反应，并用血清移液管高速重悬细胞，直至细胞成为单细胞悬液。然后，在室温下以300 × g离心五分钟。吸除上清液，用1× PBS洗涤细胞，再进行离心。吸弃PBS上清液，将细胞沉淀重悬于200微升FACS缓冲液中。使用悬浮细胞对约50,000个以上的细胞进行流式细胞术检测，并以每秒约5,000个细胞的鞘流速度运行样品。最后，导出数据以进行进一步分析。经100纳摩尔CEM23处理48小时后，CEM系统在Oct4位点及CiA mESC中的相位图像显示GFP特异性抑制，而未经处理的细胞则无此现象。荧光图像显示对照组细胞中GFP表达明亮，而经CEM23处理的mESC中GFP表达降低。流式细胞术分析一致表明，经100纳摩尔CEM23处理48小时的CiA mESC中，GFP表达下降超过30%。染色质免疫沉淀（ChIP）结果显示，与对照细胞相比，经100纳摩尔CEM23处理48小时后，目标位点处的H3K27ac水平降低。进行该实验操作时，务必小心处理小鼠胚胎干细胞。若细胞在实验过程中发生分化，实验结果将无效。该技术建立后，为合成生物学领域的研究人员探索哺乳动物基因组的体内机制开辟了道路。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用化学表观修饰因子重定向细胞机械抑制基因转录

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利用多光谱成像流式细胞术分析纳米颗粒与细菌的细胞内化作用

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