利用P19胚胎癌细胞进行神经发生

P19细胞系已知可分化为神经元。然而，P19细胞系的神经元分化方案有时较为复杂。本方法使我们能够以更简便的方式进行神经发生实验，从而拓展未来P19细胞系的应用可能性。

首先，将P19细胞培养于维持培养基中，该培养基由DMEM组成，含4.5克/升葡萄糖，并添加10%胎牛血清、100单位/毫升青霉素和100单位/毫升链霉素。将细胞培养物置于37°C、5%二氧化碳环境中孵育，直至细胞融合度达到约80%。从细胞培养瓶中移除用过的培养基，并用2毫升不含钙和镁的PBS洗涤细胞。

加入1毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA，完全覆盖细胞单层，并在37°C和5%二氧化碳条件下孵育2至3分钟。在显微镜下观察，检查所有细胞是否均已脱离。将细胞重悬于9毫升维持培养基中，以中和胰蛋白酶。

将细胞转移至15毫升离心管中，在室温下以200 × g离心5分钟，使细胞沉淀。然后，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。用10毫升新鲜维持培养基重悬细胞沉淀，并根据制造商说明书使用细胞计数仪测定细胞数量。

在新的T-25培养瓶中以每平方厘米20,000个细胞的密度接种，加入最多10毫升维持培养基。在37°C和5%二氧化碳条件下培养2至3天。开始胰蛋白酶消化前，首先缓慢吸除上清液，并用2毫升无钙、无镁的PBS洗涤细胞。

然后，向细胞中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶EDTA，于37°C及5%二氧化碳条件下孵育2至3分钟。孵育结束后，为中和胰蛋白酶，将细胞重悬于9 mL分化培养基中，该培养基由高糖DMEM组成，并添加5%胎牛血清、100单位/mL青霉素和100单位/mL链霉素。将细胞转移至15 mL离心管中，在室温下以200 × g离心5分钟，使细胞沉淀。

然后，缓慢吸除上清液，并将沉淀物重悬于1毫升不含视黄酸（RA）的新鲜分化培养基中。根据制造商说明书，使用细胞计数仪测定细胞数量。进行细胞聚集体生成时，首先在100毫升未经处理的培养皿中加入10毫升分化培养基，并添加5微升视黄酸（RA）。将一百万个细胞接种至培养皿中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养两天，以促进聚集体形成。

孵育结束后，使用10毫升移液器吸取含有类胚体的培养基，转移至室温下的15毫升离心管中。静置1.5分钟，待类胚体沉降至管底后，弃去上清液。加入10毫升新鲜分化培养基，其中添加0.5 µM RA。将类胚体轻柔地接种至新的100毫米未处理培养皿中，在37°C、5% CO₂条件下培养两天。

首先，使用10毫升移液管将细胞团块转移至15毫升离心管中。室温静置1.5分钟，待细胞团块沉降至管底后，弃去上清液。用不含血清和抗生素的DMEM洗涤细胞团块。

等待细胞团块沉降至底部，弃去上清液，加入2毫升0.25%胰蛋白酶EDTA。将试管置于37摄氏度水浴中孵育10分钟，每隔2分钟轻敲试管以保持细胞悬浮。然后加入4毫升维持培养基以终止胰蛋白酶活性，使用1毫升移液器上下吹打20次。

最后，在200 × g、室温条件下离心细胞5分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于5 mL维持培养基中。使用细胞计数器测定细胞数量，随后进行细胞接种。

接种细胞时，首先向六孔培养板的每孔中加入三毫升维持培养基。然后以每孔500,000个细胞的密度接种。将培养板置于37°C、5%二氧化碳条件下孵育。

将细胞接种于六孔培养板中的盖玻片上。当细胞融合度达到20%时，使用抗MAP2抗体进行免疫染色。随后，提取RNA，并对MAP2、NeuN、OCT4、NANOG及GAPDH进行逆转录PCR。

本研究介绍了一种简化的神经元分化方法。将P19细胞系在未经处理的培养皿中，使用含5% FBS和0.5微摩尔RA的培养基进行培养。四天后，用胰蛋白酶消化细胞聚集体，并将其接种至贴壁细胞培养板中继续培养四天。通过比较P19细胞系在未分化状态和神经发生过程中的RT-PCR分析结果，评估该方法的分化效率。

结果显示，多能性基因（如 Oct4 和 NANOG）的表达迅速下降，而神经元标志物基因（如 MAP2 和 NeuN）的表达则上调。我们认为，本研究建立的方法简便有效，将有助于阐明神经发生以及神经退行性疾病的分子机制。