Name: 使用P19胚胎癌细胞的神经发生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 学习使用P19小鼠胚胎癌细胞进行神经发生的简化方案，通过视黄酸诱导分化。该方法为研究神经发生机制和神经退行性疾病提供了可重复的用户友好型实验流程。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由波兰国家科学中心（项目编号：UMO-2017/25/N/NZ3/01886）和 KNOW（领先国家研究中心）科学联合体&#34;健康动物 - 安全食品&#34;资助，以及波兰科学与高等教育部第 05-1/KNOW2/2015 号决议支持

1. 培养物维持
<ol>
	<li>将P19细胞系培养于维持培养基中（含4,500 mg/L葡萄糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基，添加10%胎牛血清、100单位/mL青霉素和100单位/mL链霉素）。于37 °C、5% CO2条件下孵育。</li>
</ol>
2. 细胞传代培养
<ol>
	<li>当细胞生长至约 80% 汇合度时，从细胞培养瓶（表面积 25 cm2）中移除用过的培养基。</li>
	<li>用 2 mL 不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。</li>
	<li>向细胞单层加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸）溶液。</li>
	<li>将培养瓶置于 CO2 培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育 2–3&#160;分钟。</li>
	<li>观察细胞与培养瓶表面的贴附情况，确保所有细胞均已脱离并悬浮于培养基中。</li>
	<li>加入 9 mL 维持培养基以终止&#160;胰蛋白酶的酶活性。</li>
	<li>用维持培养基重悬细胞。</li>
	<li>将细胞转移至 15 mL 离心管中，在室温（RT）下以 200 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并向 15 mL 离心管中加入 10 mL 新鲜维持培养基。</li>
	<li>使用细胞计数仪按照制造商说明，利用细胞悬液测定细胞数量。</li>
	<li>以每平方厘米 2 × 104 个细胞的密度，将细胞接种至新的 25 cm2 培养瓶中。</li>
	<li>加入维持培养基至总体积 10 mL。</li>
	<li>将接种细胞的培养瓶置于 CO2 培养箱（37 °C，5% CO2）中培养 2–3 天。</li>
</ol>
3. 胰蛋白酶消化
<ol>
	<li>从细胞培养瓶中吸除维持培养基。用 2&#160;mL 无钙、无镁的 PBS 洗涤细胞一次。</li>
	<li>加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液。</li>
	<li>将细胞培养瓶放入 37 °C 的 CO2 培养箱中孵育 2–3 分钟。</li>
	<li>使用 1 mL 移液器反复吹打细胞 10 次，使细胞解离。</li>
	<li>向细胞中加入 9&#160;mL 不含视黄酸（RA）的分化培养基（含 4500 mg/L 葡萄糖的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基，添加 5% 胎牛血清、100 单位/mL 青霉素和 100 单位/mL 链霉素），以中和胰蛋白酶活性。</li>
	<li>将细胞转移至 15 mL 离心管中，在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，加入 1 mL 不含视黄酸（RA）的分化培养基，重悬细胞沉淀。</li>
	<li>使用细胞计数仪，按照制造商说明书对细胞悬液进行细胞计数。</li>
</ol>
4. 聚集体生成
<ol>
	<li>向10 mL分化培养基中加入5 µL RA（1 mM 储存液，溶于99.8%乙醇，-20 °C保存），充分混匀（RA终浓度为0.5 µM）。 
	注意： RA对光敏感。&#160;低浓度乙醇不影响细胞分化19,20,21。</li>
	<li>将含RA的10 mL分化培养基加入100 mm未经处理的培养皿中（专用于悬浮培养）。</li>
	<li>将1 × 106个细胞接种至100 mm培养皿中（培养皿表面积为56.5 cm2）。</li>
	<li>将含细胞的培养皿置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养2天，以促进细胞聚集体形成。</li>
	<li>2天后，更换分化培养基。用10 mL移液器吸取含有细胞聚集体的培养基，转移至室温下的15 mL离心管中。</li>
	<li>在室温下静置1.5分钟，使细胞聚集体依靠重力自然沉降。</li>
	<li>弃去上清液。</li>
	<li>用10 mL血清移液器加入10 mL新鲜的含0.5 µM RA的分化培养基。 
	注意： 不要反复吹打细胞聚集体。</li>
	<li>将细胞聚集体接种至新的100 mm未经处理的培养皿中（专用于悬浮培养）。</li>
	<li>将培养皿置于培养箱中（37 °C，5% CO2）继续培养2天。</li>
</ol>
5. 聚集体解离
<ol>
	<li>使用 10 mL 移液器吸取细胞聚集体。</li>
	<li>将聚集体转移至 15 mL 离心管中，静置 1.5 分钟，使细胞聚集体依靠重力自然沉降。</li>
	<li>吸除上清液。</li>
	<li>用不含血清和抗生素的 DMEM 洗涤聚集体。</li>
	<li>在室温下静置 1.5 分钟，使细胞聚集体通过重力沉降法沉淀。</li>
	<li>吸除上清液，加入 2 mL 0.25% 的胰蛋白酶-EDTA 溶液。</li>
	<li>将细胞聚集体放入 37 °C 水浴中孵育 10 分钟，每隔 2 分钟用手轻轻敲击管壁以轻柔振荡聚集体。</li>
	<li>加入 4 mL 维持培养基以终止胰蛋白酶消化过程。</li>
	<li>使用 1 mL 移液器将聚集体上下吹打 20 次。</li>
	<li>在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 5 mL 维持培养基中。</li>
	<li>使用细胞计数仪测定细胞数量。</li>
</ol>
6. 细胞接种
<ol>
	<li>向6孔板的每个孔中加入3 mL维持培养基。</li>
	<li>以每孔0.5 × 106的密度将细胞接种至6孔培养板中。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2浓度条件下培养。</li>
	<li>将细胞接种于6孔培养板中的盖玻片上，当细胞融合度达到20%时，使用抗MAP2抗体进行免疫染色。另取6孔板培养细胞至20%融合度，提取RNA并进行Map2、NeuN、Oct4、Nanog和Gapdh的RT-PCR分析。</li>
</ol>

<ol><li>Ramkumar, N., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+mouse+primitive+streak%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: mouse primitive streak.</a> Cell. 146 (3), 488(2011).</li>
<li>Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrulation%3A+making+and+shaping+germ+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Gastrulation: making and shaping germ layers.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).</li>
<li>Tam, P. P. L., Gad, J. M. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTam%2C+PPL+%22Gastrulation%3A+From+Cells+to+Embryo%22">Gastrulation: From Cells to Embryo</a>. Stern, C. D. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 233-262 (2004).</li>
<li>Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Oct4+expression+during+the+development+of+murine+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies.</a> Developmental Biology. 371 (2), 170-179 (2012).</li>
<li>ten Berge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+Signaling+Mediates+Self-Organization+and+Axis+Formation+in+Embryoid+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).</li>
<li>Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+embryonal+carcinoma+cells+to+neurons%3A+the+P19+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">From embryonal carcinoma cells to neurons: the P19 pathway.</a> Bioessays. 16 (5), 343-348 (1994).</li>
<li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP+regulates+neuronal+differentiation+through+Sonic+hedgehog+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">YAP regulates neuronal differentiation through Sonic hedgehog signaling pathway.</a> Experimental Cell Research. 318 (15), 1877-1888 (2012).</li>
<li>Neo, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+miR-124+controls+the+choice+between+neuronal+and+astrocyte+differentiation+by+fine-tuning+Ezh2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">MicroRNA miR-124 controls the choice between neuronal and astrocyte differentiation by fine-tuning Ezh2 expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20788-20801 (2014).</li>
<li>Jones-Villeneuve, E., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li>
<li>McBurney, M. W., Rogers, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+male+embryonal+carcinoma+cells+and+their+chromosome+replication+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns.</a> Developmental Biology. 89 (2), 503-508 (1982).</li>
<li>Jones-Villeneuve, E., Rudnicki, M. A., Harris, J. F., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid-induced+neural+differentiation+of+embryonal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (12), 2271-2279 (1983).</li>
<li>Jasmin,, Spray, D. C., Campos de Carvalho, A. C., Mendez-Otero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+induction+of+cardiac+differentiation+in+P19+embryonal+carcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Chemical induction of cardiac differentiation in P19 embryonal carcinoma stem cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (3), 403-412 (2010).</li>
<li>Solari, M., Paquin, J., Ducharme, P., Boily, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P19+neuronal+differentiation+and+retinoic+acid+metabolism+as+criteria+to+investigate+atrazine%2C+nitrite%2C+and+nitrate+developmental+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">P19 neuronal differentiation and retinoic acid metabolism as criteria to investigate atrazine, nitrite, and nitrate developmental toxicity.</a> Toxicological Sciences. 113 (1), 116-126 (2010).</li>
<li>Babuska, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+P19+cells+during+retinoic+acid+induced+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Prague+Medical+Report%22%5BJournal%5D)">Characterization of P19 cells during retinoic acid induced differentiation.</a> Prague Medical Report. 111 (4), 289-299 (2010).</li>
<li>Monzo, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+generating+high-yield+enriched+neuronal+cultures+from+P19+embryonal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for generating high-yield enriched neuronal cultures from P19 embryonal carcinoma cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 87-103 (2012).</li>
<li>Popova, D., Karlsson, J., Jacobsson, S. O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+neurons+derived+from+mouse+P19%2C+rat+PC12+and+human+SH-SY5Y+cells+in+the+assessment+of+chemical-+and+toxin-induced+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Comparison of neurons derived from mouse P19, rat PC12 and human SH-SY5Y cells in the assessment of chemical- and toxin-induced neurotoxicity.</a> BMC Pharmacology and Toxicology. 18 (1), 42(2017).</li>
<li>Woodgate, A., MacGibbon, G., Walton, M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxicity+of+6-hydroxydopamine+on+PC12+and+P19+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The toxicity of 6-hydroxydopamine on PC12 and P19 cells.</a> Molecular Brain Research. 69 (1), 84-92 (1999).</li>
<li>Tsukane, M., Yamauchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+II+mediates+apoptosis+of+P19+cells+expressing+human+tau+during+neural+differentiation+with+retinoic+acid+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Enzyme+Inhibition+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II mediates apoptosis of P19 cells expressing human tau during neural differentiation with retinoic acid treatment.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 24 (2), 365-371 (2009).</li>
<li>Adler, S., Pellizzer, C., Paparella, M., Hartung, T., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+solvents+on+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">The effects of solvents on embryonic stem cell differentiation.</a> Toxicology in Vitro. 20 (3), 265-271 (2006).</li>
<li>Jones-Villeneuve, E. M., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li>
<li>Roy, B., Taneja, R., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+activation+of+retinoic+acid+%28RA%29-responsive+genes+and+induction+of+embryonal+carcinoma+cell+differentiation+by+an+RA+receptor+alpha+%28RAR+alpha%29-%2C+RAR+beta-%2C+or+RAR+gamma-selective+ligand+in+combination+with+a+retinoid+X+receptor-specific+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synergistic activation of retinoic acid (RA)-responsive genes and induction of embryonal carcinoma cell differentiation by an RA receptor alpha (RAR alpha)-, RAR beta-, or RAR gamma-selective ligand in combination with a retinoid X receptor-specific ligand.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6481-6487 (1995).</li>
<li>Hamada-Kanazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox6+overexpression+causes+cellular+aggregation+and+the+neuronal+differentiation+of+P19+embryonic+carcinoma+cells+in+the+absence+of+retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid.</a> FEBS Letters. 560 (1-3), 192-198 (2004).</li>
<li>Tangsaengvit, N., Kitphati, W., Tadtong, S., Bunyapraphatsara, N., Nukoolkarn, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+Outgrowth+and+Neuroprotective+Effects+of+Quercetin+from+Caesalpinia+mimosoides+Lamk+on+Cultured+P19-Derived+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Evidence-Based+Complementary+and+Alternative%22%5BJournal%5D)">Neurite Outgrowth and Neuroprotective Effects of Quercetin from Caesalpinia mimosoides Lamk on Cultured P19-Derived Neurons.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. , 838051(2013).</li>
<li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+P19+embryonal+carcinoma+cells+develop+responses+to+excitatory+and+inhibitory+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from P19 embryonal carcinoma cells develop responses to excitatory and inhibitory neurotransmitters.</a> Developmental Brain Research. 90 (1-2), 141-150 (1995).</li>
<li>MacPherson, P., Jones, S., Pawson, P., Marshall, K., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P19+cells+differentiate+into+glutamatergic+and+glutamate-responsive+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro.</a> Neuroscience. 80 (2), 487-499 (1997).</li>
<li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyltransferase-inhibition+interferes+with+neuronal+differentiation+of+P19+embryonal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Methyltransferase-inhibition interferes with neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 377 (3), 935-940 (2008).</li>
<li>Wenzel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+classic+nuclear+localization+signal+at+the+N+terminus+that+regulates+the+subcellular+localization+of+Rbfox2+isoforms+during+differentiation+of+NMuMG+and+P19+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Identification of a classic nuclear localization signal at the N terminus that regulates the subcellular localization of Rbfox2 isoforms during differentiation of NMuMG and P19 cells.</a> FEBS Letters. 590 (24), 4453-4460 (2016).</li>
<li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Cathepsin+E+Interferes+with+Neuronal+Differentiation+of+P19+Embryonal+Teratocarcinoma+Cells+by+Degradation+of+N-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Cathepsin E Interferes with Neuronal Differentiation of P19 Embryonal Teratocarcinoma Cells by Degradation of N-cadherin.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (3), 437-443 (2017).</li>
<li>Morassutti, D. J., Staines, W. A., Magnuson, D. S., Marshall, K. C., McBurney, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+embryonal+carcinoma-derived+neurons+survive+and+mature+following+transplantation+into+adult+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Murine embryonal carcinoma-derived neurons survive and mature following transplantation into adult rat striatum.</a> Neuroscience. 58 (4), 753-763 (1994).</li>
<li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., Staines, W. A., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electrophysiological+maturation+of+neurons+derived+from+a+multipotent+precursor+%28embryonal+carcinoma%29+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo electrophysiological maturation of neurons derived from a multipotent precursor (embryonal carcinoma) cell line.</a> Developmental Brain Research. 84 (1), 130-141 (1995).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种利用P19细胞系进行神经发生的简单实验方案。尽管已有大量相关报道，但使用P19细胞系诱导神经发生的详细方法仍不明确。此外，我们在整个实验过程中采用了成分简单的高糖（4,500 mg/L）DMEM培养基，其中添加10%胎牛血清（FBS）。该体系使神经发生实验的操作更加简便友好，并有助于拓展该方法在未来的应用范围。
本方案中最关键的环节是视黄酸（RA）浓度以及在悬浮培养过程中细胞聚集体的形成。虽然P19细胞系的神经发生刺激可以在不形成聚集体的情况下进行，但若不形成聚集体，培养中产生的神经元细胞数量将减少三分之二22。Monzo等人已证明，通过单层培养可诱导P19细胞系发生神经分化15。尽管该方法较为简便，可省去悬浮培养步骤，但仍需进一步研究以将其与其他已有详细描述的方法进行比较。与使用1 µM RA相比，培养基中使用0.5 µM RA浓度可产生更多的细胞聚集体以及更多的神经元。此外值得注意的是，在RA处理期间，若大多数聚集体已贴附于悬浮培养皿底部，则无法观察到有效的神经发生。在...

在胚胎发育过程中，单层细胞会转化为三个独立的胚层1,2,3。为了拓展对体内发生现象的研究可能性，已开发出三维细胞聚集体（胚胎体）作为便捷的研究模型。通过该方法形成的细胞聚集体可暴露于各种诱导细胞分化的条件下，从而模拟胚胎发育过程4,5。P19 小鼠胚胎癌细胞系（P19 细胞系）常被用作体外神经发生研究的细胞模型 6,7,8。P19 细胞系具有典型的多能干细胞特征，在细胞聚集过程中加入视黄酸（RA）可诱导其分化为神经元，随后在贴壁条件下出现 neurite outgrowth。此外，在二甲基亚砜（DMSO）的作用下，未分化的 P19 细胞系也能形成类似肌细胞和心肌细胞的细胞类型9,10,11,12。
已有多种方法13,14,15,16被报道用于神经元分化，但这些方法有时较为复杂，仅通过阅读描述难以掌握。例如，某些方案要求使用添加了小牛血清（CS）和胎牛血清（FBS）混合物的杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM）13。此外，用于神经元发育的培养基通常由Neurobasal培养基与B27添加剂组成13,14,15,16。因此，现有方法在制备上存在复杂性，而本研究的目标是简化这些实验流程。在本研究中，我们证明了含FBS的DMEM培养基不仅可用于维持P19细胞系（DMEM + 10% FBS），也可用于神经元发育（DMEM + 5% FBS + RA）。这种利用P19细胞系的简化神经发生方法使我们能够研究神经元发育的分子机制。此外，阿尔茨海默病等神经退行性疾病的研究所也常使用P19细胞系17,18，我们相信本研究所建立的方法将有助于阐明神经发育异常及神经退行性疾病中的分子机制。

<table><tbody><tr><td>6x DNA上样缓冲液</td><td>EURx</td><td>E0260-01</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>cDNA合成试剂盒</td><td>EURx</td><td>E0801-02</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4&amp;prime;,6-二脒基-2&amp;prime;-苯基吲哚二盐酸盐）</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>10236276001</td><td>工作浓度：1 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>含L-谷氨酰胺的高糖DMEM（4.5 g/L）</td><td>Lonza</td><td>BE12-604Q</td><td></td></tr><tr><td>99.8%乙醇</td><td>Chempur</td><td>CHEM*613964202</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>EURx</td><td>E5050-03</td><td></td></tr><tr><td>MAP2抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA517646</td><td>稀释比例1:100</td></tr><tr><td>PCR反应试剂盒</td><td>EURx</td><td>E0411-03</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（10K/10K）</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），1x浓度，不含Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;、Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Lonza</td><td>BE17- 517Q</td><td></td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>R2625-50MG</td><td>&amp;nbsp;溶于99.8%乙醇；-20 &amp;deg;C保存，最长6个月</td></tr><tr><td>二抗（Alexa Fluor 488）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td>稀释比例1:500</td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>1153630500</td><td></td></tr><tr><td>TBE缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B52</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>含酚红的0.25%胰蛋白酶-EDTA（HBSS配制，不含Ca&amp;nbsp;&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;、Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;）</td><td>biosera</td><td>LM-T1720/500</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养耗材</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL移液管</td><td>Profilab</td><td>515.01</td><td></td></tr><tr><td>10 mL移液管</td><td>Profilab</td><td>515.10</td><td></td></tr><tr><td>专用于悬浮培养的100 mm培养皿</td><td>Corning</td><td>C351029</td><td></td></tr><tr><td>15 mL离心管</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>CLS430791-500EA</td><td></td></tr><tr><td>5 mL移液管</td><td>Profilab</td><td>515.05</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Corning</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶，表面积25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>CLS430639-200EA</td><td></td></tr></tbody></table>

利用p19胚胎癌细胞进行神经发生

Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells

源自小鼠胚胎畸胎瘤的P19细胞系具有分化为三个胚层的能力。在存在视黄酸（RA）的条件下，悬浮培养的P19细胞系可被诱导分化为神经元。这一现象被广泛用作体外神经发生的研究模型。因此，P19细胞系对于与神经发生相关的分子和细胞研究非常有用。然而，文献中描述的P19细胞系神经元分化的实验方案非常复杂。本研究建立的方法简便，将有助于阐明神经发育异常和神经退行性疾病的分子机制。

P19细胞系神经发生诱导方案的简化流程图如下所示 图1为了确定P19细胞系在未分化状态及神经发生过程中的特性，采用了RT-PCR（逆转录-聚合酶链式反应）方法。未分化的P19细胞系表达多能性基因，例如有机阳离子/肉碱转运蛋白4 (Oct4) 和 Nanog 同源框 (Nanog) 悬浮培养中在RA存在下由细胞聚集诱导的神经发生导致了 Oct4 和 Nanog 表达。相反，神经元标志物的表达：微管相关蛋白2（Map2, NeuN （也称为 RNA结合蛋白，fox-1同源物3 (Rbfox3) 在触发神经发生后增加（图2)6,14,15</su...

P19 小鼠胚胎癌细胞系（P19 细胞系）被广泛用于研究神经发生分子机制，相较于体内分析具有显著的简化优势。本文介绍了一种利用视黄酸诱导 P19 细胞系发生神经分化的实验方案。

利用P19胚胎癌细胞进行神经发生

源自小鼠胚胎畸胎瘤的P19细胞系具有分化为三个胚层的能力。在……存在的情况下，

P19细胞系已知可分化为神经元。然而，P19细胞系的神经元分化方案有时较为复杂。本方法使我们能够以更简便的方式进行神经发生实验，从而拓展未来P19细胞系的应用可能性。首先，将P19细胞培养于维持培养基中，该培养基由DMEM组成，含4.5克/升葡萄糖，并添加10%胎牛血清、100单位/毫升青霉素和100单位/毫升链霉素。将细胞培养物置于37°C、5%二氧化碳环境中孵育，直至细胞融合度达到约80%。从细胞培养瓶中移除用过的培养基，并用2毫升不含钙和镁的PBS洗涤细胞。加入1毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA，完全覆盖细胞单层，并在37°C和5%二氧化碳条件下孵育2至3分钟。在显微镜下观察，检查所有细胞是否均已脱离。将细胞重悬于9毫升维持培养基中，以中和胰蛋白酶。将细胞转移至15毫升离心管中，在室温下以200 × g离心5分钟，使细胞沉淀。然后，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。用10毫升新鲜维持培养基重悬细胞沉淀，并根据制造商说明书使用细胞计数仪测定细胞数量。在新的T-25培养瓶中以每平方厘米20,000个细胞的密度接种，加入最多10毫升维持培养基。在37°C和5%二氧化碳条件下培养2至3天。开始胰蛋白酶消化前，首先缓慢吸除上清液，并用2毫升无钙、无镁的PBS洗涤细胞。然后，向细胞中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶EDTA，于37°C及5%二氧化碳条件下孵育2至3分钟。孵育结束后，为中和胰蛋白酶，将细胞重悬于9 mL分化培养基中，该培养基由高糖DMEM组成，并添加5%胎牛血清、100单位/mL青霉素和100单位/mL链霉素。将细胞转移至15 mL离心管中，在室温下以200 × g离心5分钟，使细胞沉淀。然后，缓慢吸除上清液，并将沉淀物重悬于1毫升不含视黄酸（RA）的新鲜分化培养基中。根据制造商说明书，使用细胞计数仪测定细胞数量。进行细胞聚集体生成时，首先在100毫升未经处理的培养皿中加入10毫升分化培养基，并添加5微升视黄酸（RA）。将一百万个细胞接种至培养皿中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养两天，以促进聚集体形成。孵育结束后，使用10毫升移液器吸取含有类胚体的培养基，转移至室温下的15毫升离心管中。静置1.5分钟，待类胚体沉降至管底后，弃去上清液。加入10毫升新鲜分化培养基，其中添加0.5 µM RA。将类胚体轻柔地接种至新的100毫米未处理培养皿中，在37°C、5% CO₂条件下培养两天。首先，使用10毫升移液管将细胞团块转移至15毫升离心管中。室温静置1.5分钟，待细胞团块沉降至管底后，弃去上清液。用不含血清和抗生素的DMEM洗涤细胞团块。等待细胞团块沉降至底部，弃去上清液，加入2毫升0.25%胰蛋白酶EDTA。将试管置于37摄氏度水浴中孵育10分钟，每隔2分钟轻敲试管以保持细胞悬浮。然后加入4毫升维持培养基以终止胰蛋白酶活性，使用1毫升移液器上下吹打20次。最后，在200 × g、室温条件下离心细胞5分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于5 mL维持培养基中。使用细胞计数器测定细胞数量，随后进行细胞接种。接种细胞时，首先向六孔培养板的每孔中加入三毫升维持培养基。然后以每孔500,000个细胞的密度接种。将培养板置于37°C、5%二氧化碳条件下孵育。将细胞接种于六孔培养板中的盖玻片上。当细胞融合度达到20%时，使用抗MAP2抗体进行免疫染色。随后，提取RNA，并对MAP2、NeuN、OCT4、NANOG及GAPDH进行逆转录PCR。本研究介绍了一种简化的神经元分化方法。将P19细胞系在未经处理的培养皿中，使用含5% FBS和0.5微摩尔RA的培养基进行培养。四天后，用胰蛋白酶消化细胞聚集体，并将其接种至贴壁细胞培养板中继续培养四天。通过比较P19细胞系在未分化状态和神经发生过程中的RT-PCR分析结果，评估该方法的分化效率。结果显示，多能性基因（如 Oct4 和 NANOG）的表达迅速下降，而神经元标志物基因（如 MAP2 和 NeuN）的表达则上调。我们认为，本研究建立的方法简便有效，将有助于阐明神经发生以及神经退行性疾病的分子机制。

neurogenesis-using-p19-embryonal-carcinoma-cells

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

使用P19胚胎癌细胞的神经发生

本文介绍了一种从废弃的人类胎儿皮质组织中分离和培养神经干细胞的简单且可靠的方法。来源于已知人类神经系统疾病的人源组织培养物可用于病理性的细胞与分子过程的表征，并可作为评估药理学疗效的平台。...

从废弃的人类胎儿皮质组织中生成神经干细胞

控制体细胞干细胞的扩增是阻碍其研究和治疗应用的主要因素。本文介绍了一种可在发育期和成年期时序性调控神经干细胞扩增的系统，该系统可用于增加小鼠大脑中生成的神经元数量。...

胚胎和成体神经干细胞的扩增 子宫内 电穿孔或病毒立体定位注射

本视频展示了一种利用视黄酸诱导 P19...

维甲酸诱导小鼠胚胎癌细胞神经发生

软脑膜表面是中枢神经系统中一个独特的前体细胞区域，正受到越来越多的关注。本文详细介绍了一种利用改良电穿孔技术快速进行该前体区域遗传操作的方法。该方法可用于研究细胞谱系和参与细胞分化过程的信号通路，进而阐明子代细胞的命运及其生物学特性。...

新生小鼠软脑膜表面电穿孔技术

表型正常的星形胶质细胞和神经干细胞取自携带floxed条件性致癌等位基因的基因工程小鼠，通过病毒介导的Cre重组进行转化，可用于建立星形细胞瘤发病机制的模型 体外 和 体内...

星形细胞瘤发病机制建模 体外 和 体内 利用条件性基因工程小鼠的皮层星形胶质细胞或神经干细胞

本方案描述了如何将人诱导性多能干细胞分化为神经前体细胞，以获得稳定且具有增殖能力的神经细胞群体，可用于鉴定多种神经系统疾病发病机制中涉及的发育通路。...

生成和使用人诱导多能干细胞来源的神经前体细胞用于神经系统疾病研究的指南

上皮-间质转化（EMT）使癌症细胞获得侵袭能力。为研究EMT，可采用基于神经干细胞（NSC）的方法 体外...

一种适用于药物发现的无酶无血清神经干细胞培养模型用于EMT研究

基于体外慢病毒工程技术对神经前体细胞进行改造，并将其共移植到野生型大脑中，结合对“实验”和“对照”衍生细胞的配对形态测量学分析，该方法能够以简单且经济的方式精确模拟体内基因对新皮层神经元形态的调控。...

用于体内神经结构研究的工程化神经前体细胞脑室内移植

本方案介绍了通过仙台病毒感染将外周血单个核细胞重编程为诱导性神经干细胞，将iNSCs分化为多巴胺能神经元，将多巴胺能前体细胞移植到单侧损毁的帕金森病小鼠模型，并评估iNSC来源的多巴胺能前体细胞用于帕金森病治疗的安全性和有效性。...

从外周单个核细胞生成诱导性神经干细胞及其向多巴胺能神经元前体细胞的分化用于移植研究

本文介绍了一种从高密度接种的神经元中自发生成富含神经前体细胞的神经球的实验方案。在同一实验中，当神经元以较低密度接种时，该方案还可实现原代大鼠神经元的长期培养。...

从E14-E16天Sprague Dawley大鼠胚胎分离的原代海马和皮层神经元混合培养中生成神经球

本文介绍了一种利用子宫内电穿孔技术在雪貂胚胎脑中进行遗传操作的实验方案。该方法可在体内实现对新皮层中神经前体细胞的靶向操作。...

在体电穿孔靶向雪貂新皮层中的神经前体细胞

学习使用P19小鼠胚胎癌细胞进行神经发生的简化方案，通过视黄酸诱导分化。该方法为研究神经发生机制和神经退行性疾病提供了可重复的用户友好型实验流程。

利用P19胚胎癌细胞进行神经发生

探索更多视频