拉米内切手术和脊髓窗口植入小鼠
October 23rd, 2019
该协议描述将玻璃窗植入小鼠脊髓，以方便通过生命内显微镜进行可视化。
这种方法能够检查完整的中枢神经系统内的体内蛋白质动力学，以解决神经科学和免疫学中的问题。该程序的主要优点是出色的运动稳定性，用于图像采集、手术时间短暂、操作员对气态麻醉的暴露减少以及廉价的可定制背板。这种方法的视觉演示是至关重要的，因为很难在不损害紧密基础的神经系统组织在手术的拉明切除术步骤期间切除骨骼。
在开始该过程之前，请使用 3D 计算机辅助设计软件为指示的尺寸创建模型。因此，我们有一个对象，这是三维对象，这是我们可以开始。然后，我能做的就是，我们可以把设置，为打印版本。
因此，如果我打开"编辑"，进入高级，打开一个窗口，使我能够查看所有这些设置。将喷嘴温度设置为 205 摄氏度，将床温设置为 45 摄氏度，将 3D 打印机的打印速度设置为 45 毫米/秒。使用 0.4 毫米热 ent 喷嘴和 0.2 毫米层高度打印背板。
然后目视地评估打印的背板的结构完整性。严重结构故障表示打印缺陷。当背板准备好时，将一只8到12周大的麻醉小鼠的头部放在手术限制器耳架之间的热垫上，并在动物的眼睛上涂抹软膏。
在确认对手趾捏没有反应后，使用11号刀片在下胸上腰椎区域进行1.5厘米的胸腔中线切口，将皮肤与胸腔分离。使用钳子剥回皮肤下剩余的透明结缔组织，以暴露表面的肌肉。用泡沫手术矛和目标椎骨的剩余更深的肌肉取代肌肉。
要为后板创建一个座位，请从胸腔 11 的后部和胸板 13 的前部清除肌肉。必要时使用钳子从肌腱上去除剩余的肌肉。当所有的肌肉被切除时，用钳子小心地切开肌腱，直到获得足够的空间来可视化和操纵脊髓。
确认椎间空间的杜拉母体、半透明层骨、骨下的中央表面血管以及前辐射动脉清晰可见。用温暖的人工脑脊髓液将区域弄湿，并使用与脊髓长轴平行的直线笔触将层骨变薄。用钳子轻轻抓住表面的旋转过程，抬起椎骨。
骨头应该很容易地抬起。使用四号钳清除任何骨片，控制任何出血与手术矛和温和的稳定压力，如有必要。然后用温暖的人工脑脊髓液冲洗组织。
对于盖玻璃植入，轻轻涂抹三毫米硅酸盐盖玻璃到外露的电线。使用小铲子将 39 摄氏度加热 2% 的 agarose 涂抹到玻璃边缘，并允许毛细管作用在盖玻璃表面下绘制 agarose。将组织粘合剂涂抹在胸椎11级和13级椎骨的完好相邻椎骨的外露骨关节工艺上。
在相邻肌腱和横向过程周围环中应用额外的组织粘合剂。接下来，使用新的铲子将与助剂混合的牙科水泥涂在组织粘合层上，并在盖玻璃窗为中心的手术场上放置一个背板。应用多层牙科水泥可产生更强的背板附着力，但请务必在牙科水泥开始干燥之前快速放置背板。
在允许牙科水泥固化 10 分钟后，用额外的粘合剂填充后处的内部底座和底部。将牙科水泥涂在薄层中有助于降低水泥扩散到盖玻璃和红糖的风险，从而危及整个协议。当牙科水泥干燥后，将分叉背板支架涂抹到车窗上的适当位置，然后将背板拧入背板支架。
然后将盐水涂抹到后板上以测试泄漏。然后，动物和手术平台可以转移到两光子显微镜的光学台，通过盖玻璃窗进行成像。在这个具有代表性的实验中，EGFP阳性的克劳丁-5在血管丛中荧光标记的紧密结内被可视化。
Z 投影中紧密结结构的清晰划分表明，在成功进行拉明切除术、窗口放置和背板植入后，可产生最小的 XY 图像位移。在尝试此程序时，重要的是要记住，这种显微手术是困难的，可能需要一段时间来掌握。然而，一旦掌握，这个手术可以在大约30分钟内进行。
按照这个程序，其他方法，如两光显微镜和体内成像，可以执行，以回答有关神经血管重塑和其他疾病过程涉及脊髓的其他问题。
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概述
该协议描述了在小鼠脊髓上植入玻璃窗以便于通过活体显微镜观察。该方法能够在完整的中枢神经系统内检查蛋白质动力学，解答神经科学和免疫学中的问题。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
背景
- 活体显微镜允许对生物过程进行实时成像。
- 脊髓是研究神经血管相互作用的重要区域。
- 挑战包括在手术过程中保持神经组织的完整性。
- 使用可定制的背板有助于提高稳定性和成本效益。
研究目的
- 促进活体小鼠脊髓动力学的成像。
- 为更好地理解完整中枢神经系统中的蛋白质动力学做出贡献。
使用的方法
- 该方法涉及在脊髓上植入玻璃窗的手术程序。
- 使用活体小鼠模型，重点在于下胸上腰部区域。
- 关键步骤包括骨骼移除和小心地应用盖玻片。
- 描述了使用3D打印制作背板和双光子显微镜进行成像。
主要结果
- 该协议允许观察血管结构内的紧密连接，表明图像位移最小。
- 成功的窗口放置使得后续成像能够研究神经血管重塑。
- 展示了成像过程中设置的稳定性。
结论
- 本研究提供了一种可靠的小鼠脊髓成像方法。
- 该协议对理解神经血管相互作用和疾病过程具有影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables stable in vivo imaging of the mouse spinal cord, supporting target validation in neuroscience and immunology by providing direct visualization of protein dynamics and neurovascular structures. The method reduces biological variability through motion stabilization, enhancing predictive confidence in preclinical models of spinal cord-related disease processes. It positions as a reproducible platform for mechanistic de-risking in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through real-time observation of protein dynamics in intact CNS tissue.
- Operational Value: Provides a stabilized imaging window that reduces motion artifacts, improving data reliability for target engagement studies.
- Predictive Value: Supports functional validation of targets involved in neurovascular interactions and immune cell trafficking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares a disease-relevant system for quantitative assessment of compound effects on spinal cord vasculature and tight junction integrity.
- Operational Value: Standardizes surgical preparation and imaging conditions, enabling reproducible baseline measurements across experiments.
- Scalability: Uses inexpensive, customizable 3D-printed backplates that support platform reuse and adaptation across labs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains translational continuity by allowing longitudinal imaging of neurovascular remodeling in disease models.
- Operational Value: Facilitates biomarker alignment through visualization of tight junction proteins like Claudin-5 as indicators of vascular barrier function.
- Risk Mitigation: Enables early detection of on-target vascular effects, supporting go/no-go decisions in preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, particularly for CNS-targeted therapeutics where spinal cord exposure is relevant.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct observation of protein localization and dynamics in vivo.
- Screening: Delivers quantitative, fluorescence-based readouts that allow comparison of treatment conditions in spinal cord vasculature.
- Analytics: Generates Z-projection imaging data that quantify structural integrity and displacement, aiding in comparative analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling spinal cord pathology and vascular response over time.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable surgical and imaging platform applicable to multiple neuroimmunology and neurodegeneration programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in neurovascular and immune-mediated mechanisms.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized anesthesia, surgical timing, and stabilization techniques.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early failure detection in targets with poor spinal cord penetration or vascular safety profiles.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing direct evidence of target engagement in a physiologically relevant CNS environment.
Implementation Considerations
- Requires microsurgical expertise in vertebral bone removal without neural tissue damage.
- Depends on access to 3D printing for backplate fabrication and two-photon microscopy for imaging.
- Necessitates standardization of agarose concentration and dental cement application to prevent optical interference.
- Involves adaptation considerations when extending to different vertebral regions or disease models.
- Limited to acute experiments due to potential tissue response from chronic implantation.
