Name: 制备脂肪组织基质血管部分用于潜在软骨再生的临床协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: 了解从脂肪组织中分离基质血管部分用于膝关节骨关节炎治疗的临床方案。该方法通过微创技术促进软骨样组织再生，改善患者膝关节功能，为再生医学领域提供创新治疗策略。

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作者感谢Mipro医疗诊所工作人员的支持以及Jaepil/David Lee的图示设计。本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）由科学与信息通信技术部资助的生物与医学技术发展计划（项目编号：NRF-2017M3A9E4078014）；以及韩国国家研究基金会（NRF）由科学与信息通信技术部资助的研究基金（项目编号：NRF-2017R1A2B4002315 和 NRF-2016R1C1B2010308）的支持。

本病例报告的报告批准与知情同意由明志大学机构审查委员会（MJUIRB）豁免。&#160;此外，本临床方案符合《赫尔辛基宣言》以及韩国食品药品安全部（KFDA）的法规指南。对于相关操作，已从患者处获得知情同意。
1. 吸脂术
注意：需采用无菌技术操作。
<ol>
	<li>采用以下纳入标准：（1）MRI 证实为 3 期骨关节炎；（2）性别不限（男性或女性）；（3）年龄超过 18 岁；（4）具备足够的（100–110 g）脂肪组织可供抽脂；（5）不愿接受手术治疗；（6）保守治疗无效；（7）持续存在致残性疼痛。</li>
	<li>采用以下排除标准：（1）存在可能影响疼痛状况的活动性炎症或结缔组织疾病即，，系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，纤维肌痛）；（2）可能影响疼痛状况的活动性内分泌疾病即， 甲状腺功能减退症，糖尿病）；（3）可能影响疼痛状况的活动性神经系统疾病即，， 周围神经病变、多发性硬化症）；（4）需要用药治疗的活动性肺部疾病；以及（5）近3个月内无关节内类固醇注射史。</li>
	<li>将患者带入配备生物危害A级罩的手术室，并使其仰卧。</li>
	<li>用5%聚维酮碘清洁患者的腹部区域，并使用无菌技术铺巾，暴露已清洁的腹部区域以进行吸脂术。</li>
	<li>在脐部下方约5 cm偏外侧处，使用5 mL注射器抽取不含肾上腺素的2%利多卡因，以25号、1½英寸针头在拟切口部位的左右两侧各2 mL，于表皮层注射进行局部麻醉。</li>
	<li>使用10 mL注射器（配25号、1½英寸针头）抽取5 mL肿胀液（500 mL生理盐水、40 mL 2%利多卡因、20 mL 0.5%布比卡因、0.5 mL 1:1000肾上腺素），对拟切口部位进行局部麻醉。</li>
	<li>在脐部下方约5 cm处的两侧，捏起皮肤以增加皮下层次的深度，做两个长约0.5 cm的切口。</li>
	<li>使用11号刀片刺穿隆起的皮肤，穿透至皮下层，但不要穿透腹壁。</li>
	<li>使用20 cm长、16号套管针，将700至800 mL肿胀液注入拟行吸脂术的整个下腹部皮下层进行麻醉。</li>
	<li>在完成肿胀液对整个下腹部的浸润后，准备吸脂装置：将一根3.0 mm的套管连接至60 mL（或30 mL）注射器，用于手动吸脂；或使用专为真空辅助吸脂设计的3.0 mm套管，将其连接至离心套件和密闭系统注射器（以保持无菌状态），再连接至负压机进行真空辅助吸脂。</li>
	<li>进行吸脂术以获取100–110 g脂肪组织（不含肿胀液）。吸脂过程中会同时获取含有肿胀液的脂肪组织，需将其分离并去除。</li>
	<li>为分离肿胀液，首先通过重力作用，将离心套件中的脂肪组织转移至一支60 mL注射器中，并将注射器垂直放置（即， 注射器底部为脂肪组织部分。静置5-6分钟后，脂肪组织与肿胀液将完全分离。通过按压注射器推杆上部，移除注射器底部的液体。</li>
	<li>重复上述步骤1.9-1.11，直至每膝累积获得100-110 g脂肪组织（吸脂物）。</li>
</ol>
2. 使用无菌封闭系统制备ASC/ECM混合物
<ol>
	<li>在通过重力分离肿胀液并收集每套60 mL离心套件50–55 g脂肪抽吸物后，将2套装有无菌封闭系统的离心套件放入离心机容器桶中，以1600 × g离心 g 5分钟，使脂肪抽吸物浓缩，并将液体与脂肪组织分离。在此进一步浓缩过程中，脂肪抽吸物在某些情况下可能产生脂肪油。</li>
	<li>小心操作，避免晃动，取下离心套件顶部的安全帽和底部的塞子。</li>
	<li>通过缓慢按压离心套件推杆的顶部来移除底部液体。</li>
	<li>在另一支60 mL注射器中，溶解10 mg胶原酶（5 mg针对结缔组织的特异性胶原酶）24 以及5 mg针对脂肪组织的胶原酶25用50 mL生理盐水冲洗。</li>
	<li>将约25–30 mL浓缩脂肪抽吸物与溶解的胶原酶混合（使用针对结缔组织的胶原酶，5 mg）&#160;以及5 mg专用于脂肪组织的胶原酶）按1:1（v:v）的比例，通过专用连接器将60 mL注射器与离心套件连接。</li>
	<li>将浓缩的脂肪抽吸物与胶原酶通过推杆或推注器在60 mL注射器与离心套件之间反复推注，充分混匀内容物。</li>
	<li>将脂肪抽吸物与胶原酶的混合物重新转移至60 mL注射器中。</li>
	<li>将每个装有混合物的60 mL注射器连接至含有刀片的组织匀浆器。</li>
	<li>将一个空的60 mL注射器连接到匀浆器的另一端。</li>
	<li>通过匀浆器将混合物推入另一个60 mL注射器中，重复4-6次，以切割和切碎脂肪抽吸物。</li>
	<li>通过专用连接器将均质化的脂肪抽吸物和胶原酶混合物转移回60 mL离心套件</li>
	<li>将离心管套件放入容器中，置于已预热至 37 °C 的培养箱内。</li>
	<li>将两个离心试剂盒与匀浆混合物在37 °C孵育40分钟，同时以45 rpm转速旋转。</li>
	<li>孵育40 min后，以无菌操作方式将容器从培养箱中取出，然后取出离心套件并放入离心机中。</li>
	<li>将混合物在800 x g下离心 g 5分钟，以分离脂肪组织来源的基质血管组分（SVF）。</li>
	<li>离心后，通过移除柱塞顶部的注射器帽，并在柱塞开口处连接一个30 mL注射器，从每个离心套件中移除上清液（包含胶原酶和消化的脂肪组织） 通过 注射器锁定连接</li>
	<li>缓慢下压30 mL注射器的筒部，使上清液流入30 mL注射器中。</li>
	<li>将30 mL注射器筒完全下压至离心套件底部剩余3-4 mL处，仅保留最后3-4 mL的脂肪组织来源SVF。弃去上清液。</li>
	<li>从柱塞顶部取下30 mL注射器，并用5%葡萄糖乳酸林格液（D5LR）充满注射器。</li>
	<li>将装有 D5LR 的 30 mL 注射器连接至柱塞开口上方，向含有 3-4 mL 脂肪组织来源 SVF 的离心套件中加入 D5LR 至总体积达 55 mL。</li>
	<li>移除30 mL注射器，盖紧柱塞，再次以300 x g离心离心套件 g 4 分钟。</li>
	<li>重复步骤 2.17–2.21，共进行 4 次洗涤。所使用的胶原酶为异源性。因此，大部分胶原酶可通过 4 次洗涤去除。然而，为符合美国食品药品监督管理局（FDA）的批准要求，可能需要对方案进行优化，以彻底清除终体积中的胶原酶残留；尽管目前胶原酶残留量可能已低至对患者无任何临床不良反应的程度。</li>
	<li>4之后th 离心后，为获得最终用于注射的SVF，移除离心套件底部开口处的安全帽和塞子，切勿摇晃或翻转离心套件。</li>
	<li>使用特制连接器将一个20 mL注射器连接到离心套件的底部开口。</li>
	<li>反复抽拉注射器活塞数次，以混匀已沉降到离心管底部的细胞。</li>
	<li>移除含有ASCs和ECM以及其他细胞和组织的SVF总液体体积（通常每次离心套件用于膝关节注射时约为3-4 mL）。</li>
</ol>
3. 采用无菌技术制备PRP
<ol>
	<li>在准备ASCs和ECM的同时，抽取30 mL自体血，并加入2.5 mL抗凝剂柠檬酸葡萄糖溶液A。</li>
	<li>将采集的血液转移至60 mL离心套件中。</li>
	<li>以730 × g 离心5分钟，去除上清液并转移至新的60 mL离心套件中；再以1300 × g 离心4分钟，获得3–4 mL富血小板血浆（PRP）。</li>
	<li>在注射前立即向PRP中加入3%（w/v）氯化钙，按10:2（PRP:氯化钙，v:v）的比例激活PRP。</li>
	<li>向经氯化钙激活的PRP中加入0.5%（w/v）透明质酸（HA）作为支架材料。这些含有ECM的ASCs、经氯化钙激活的PRP以及HA共同构成ASC/ECM混合物。</li>
</ol>
4. 基于ASC/ECM混合物的治疗
<ol>
	<li>用5%聚维酮碘清洁患者的膝关节，并以无菌方式铺巾。</li>
	<li>触诊膝关节前方，定位胫骨与股骨之间的关节间隙。</li>
	<li>用稀释的利多卡因（1 mL 1% 利多卡因与 4 mL 生理盐水混合）从皮肤至关节囊外侧进行表皮麻醉。</li>
	<li>用稀释的罗哌卡因麻醉关节囊内部（将1 mL 0.75%罗哌卡因与3 mL生理盐水混合稀释）。</li>
	<li>通过注射器连接器将2 mL HA与含有6-8 mL SVF的20 mL注射器混合。</li>
	<li>使用注射器-注射器连接器，将0.4 mL氯化钙加入已制备好的3-4 mL自体PRP中，该PRP已盛装于一支5 mL注射器内并准备就绪。</li>
	<li>将3.5–4.5 mL PRP/氯化钙加入5 mL注射器中，与20 mL注射器中的8–10 mL HA/SVF混合物混合 通过 注射器对注射器连接器</li>
	<li>立即使用38毫米长、18号针头，将混合液（约12–15 mL）缓慢注入膝关节的胫股前关节腔内，可选择在超声引导下或无超声引导下进行。</li>
	<li>注射后，将4×4棉纱布折叠4次，覆盖于注射部位并施加压力，再用胶带固定折叠后的4×4纱布进行包扎。</li>
	<li>指导患者保持静止60分钟，以促进细胞贴壁。</li>
	<li>指导患者从诊所出院后至少1周内限制活动。</li>
	<li>3 周内返回诊所，再接受三次经氯化钙激活的 PRP 注射。</li>
</ol>
5. 治疗后随访
<ol>
	<li>在治疗后第2、4、16（或18、22）周评估患者的疼痛改善情况（采用视觉模拟评分法，VAS）及功能改善情况（采用物理治疗相关参数）。按照先前所述方法26,27测定功能评分指数（FRI）、VAS以及关节活动范围（ROM）。</li>
	<li>治疗后3个月通过MRI随访患者。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

2001年，Zuk et al. 通过使用胶原酶消化胶原基质，从脂肪组织中分离出干细胞6。随后，该研究团队证明，这些从脂肪组织中分离得到的干细胞可分化为软骨及其他中胚层来源的组织，从而证实这些干细胞具有间充质来源的特性。&#160;
同样，本文所述方法是对原有技术进行改良后用于人体患者的实验方案。该方案的主要改进之处在于，采用封闭式注射器获取和处理脂肪抽吸物，以尽量减少组织与空气的接触，同时保持操作的便捷性。使用此类封闭式注射器获取脂肪组织 通过 吸脂术。随后，在封闭系统注射器内将吸出的脂肪组织与胶原酶混合。之后，通过在封闭系统注射器内稀释胶原酶浓度，去除混合物中的胶原酶。最终获得无菌的脂肪组织来源的基质血管组分（SVF），且该过程操作简便。&#160;
通过采用类似方法，Pak 在 2011 年首次证明，自体脂肪组织来源的基质血管组分（SVF）可用于治疗骨关节炎（OA）患者，有望再生出类似软骨的组织。随后，Pak et al...

间充质干细胞（MSCs）具有再生软骨的能力1,2,3,4,5,6。这些细胞可从多种来源轻松获取，包括骨髓、脐带血和脂肪组织等。在这些来源中，脂肪组织是唯一一种在临床条件下无需体外扩增即可获得足够数量MSCs以实现软骨再生的来源7,8。自体骨髓来源的基质血管组分（SVF）也易于获取，但未经培养扩增的骨髓中所含干细胞数量非常少7,8。脐带血可能含有足够数量的MSCs，但其并非自体SVF的 readily available 来源。
目前已有多种用于临床应用的脂肪组织处理方法以获取基质血管组分（SVF）。其中，Zuk et al.5,6 开发并验证的利用胶原酶从脂肪组织中获取间充质干细胞（MSCs）的方法被广泛接受。该胶原酶法已针对骨科领域的临床应用进行了改良。为适用于临床环境，整个系统必须为封闭式系统，以在保证无菌性的同时维持操作便利性。本文介绍的一项特定改良措施是对抽吸脂肪组织进行均质化处理。较小尺寸的抽吸脂肪组织相较于较大尺寸者可被相对更快地消化，从而导致脂肪组织分解不均。此外，较大尺寸的抽吸脂肪组织可能产生纤维组织，在关节注射过程中易造成注射器和针头堵塞9,10。为避免上述问题，可在与胶原酶孵育前，通过剪切和研磨对抽吸脂肪组织进行均质化处理。经此处理后获得的脂肪组织来源SVF，其细胞外基质（ECM）的均一性可能优于未经均质化的抽吸脂肪组织11。SVF中被降解的ECM成分可发挥支架作用12。
2009年，韩国食品药品管理局（KFDA）允许在医疗机构内由医生对自体脂肪组织来源的基质血管组分（SVF）进行 минималь操作后的使用13。此后，自体脂肪组织来源的SVF已被用作一种潜在治疗剂，通过促进类软骨组织再生，以改善骨关节炎（OA）患者的膝关节功能10,14,15,16,17,18。
2011年，Pak 首次证明，来源于脂肪组织基质血管组分（SVF）的脂肪组织来源干细胞（ASCs）在与富血小板血浆（PRP）联合注射后，可改善骨关节炎（OA）患者的膝关节功能，并可能促进类软骨组织的再生 14。此外，Pak et al. 于2013年报道了涉及91例患者的安全性数据，该研究中报告的平均有效率为67%15。随后，Pak et al. 的其他研究进一步表明，对于伴有半月板撕裂和髌骨软化症的患者，膝关节功能得到改善，这可能归因于类软骨组织的再生10,16,17,18。根据已发表的文章可知，采用本文所述方案处理每100 g脂肪组织所获得的干细胞数量，依据患者个体特征的不同，可能在1,000,000至40,000,000之间波动8,19,20,21,22,23。
本文介绍了一种使用自体脂肪组织来源的基质血管组分（SVF）联合透明质酸（HA）和经氯化钙激活的富血小板血浆（PRP）治疗人类膝骨关节炎的临床方案。该临床方案的首个版本于2011年报道，采用封闭式手动系统以维持无菌环境14。此后，该相同方案在保持无菌条件的基础上进一步优化，并于2013年和2016年相继报道10,15。本文呈现的是经过优化后的临床方案。该方案的示意图见图1。
<img alt="脂肪抽吸与处理示意图，显示用于再生医学的ASC/ECM混合物注射。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58363/58363fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：实验方案的示意图概览。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58363/58363fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% 聚维酮碘（碘伏）&amp;nbsp;</td><td>Firson Co., Ltd.</td><td>657400260</td><td></td></tr><tr><td>2% 利多卡因&amp;nbsp;</td><td>Daehan Pharmaceutical Co.</td><td>670603480</td><td></td></tr><tr><td>肿胀液&amp;nbsp;</td><td>Myungmoon Pharm. Co. Ltd.</td><td>N01BB01</td><td>该溶液由500 mL生理盐水、40 mL 2%利多卡因、20 mL 0.5%布比卡因和0.5 mL 1:1000肾上腺素组成。</td></tr><tr><td>Liberase TL 和 TM 研究级酶&amp;nbsp;</td><td>Roche Applied Science</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>D5LR</td><td>Dahan Pharm. Co., Ltd.</td><td>645101072</td><td>含5%葡萄糖的乳酸林格液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗凝用枸橼酸葡萄糖溶液&amp;nbsp;</td><td>Fenwal, Inc.</td><td>NDC:0942-0641</td><td>该溶液由0.8%枸橼酸、&lt;br/&gt; 0.22%柠檬酸钠和0.223%葡萄糖组成。</td></tr><tr><td>3% (w/v) 氯化钙&amp;nbsp;</td><td>Choongwae Pharmaceutical Co.</td><td>644902101</td><td></td></tr><tr><td>0.5% (w/v) 透明质酸（Hyaluronic acid）</td><td>Dongkwang pharm. Co., Ltd.</td><td>645902030</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 罗哌卡因</td><td>Huons Co., Ltd.</td><td>670600150</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.0 mm 套管针&amp;nbsp;</td><td>WOOJU Medical Instruments Co.</td><td>ML30200</td><td></td></tr><tr><td>60-mL 带锁扣注射器</td><td>BD (Becton Dickinson)&amp;nbsp;</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>离心桶套件&amp;nbsp;</td><td>CPL Co., Ltd.</td><td>30-0827044</td><td></td></tr><tr><td>含刀片的组织匀浆器</td><td>CPL Co., Ltd.</td><td>30-0827045</td><td></td></tr><tr><td>旋转孵育混合仪</td><td>Medikan Co., Ltd</td><td>MS02060092</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Hanil Scientific Inc.</td><td>CE1133</td><td></td></tr><tr><td>磁共振成像系统</td><td>Philips Medical Systems Inc.</td><td>18068</td><td></td></tr><tr><td>超声成像系统</td><td>Samsung Medison co., Ltd</td><td>CT-LK-V10-ICM-09.05.2007</td><td></td></tr></tbody></table>

用于软骨再生的脂肪组织来源基质血管组分制备的临床方案

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

骨关节炎（OA）是最常见的致残性疾病之一。&#160;近年来，已有大量研究尝试通过使用不同形式的间充质干细胞（MSCs）来改善膝关节功能。在韩国，骨髓浓缩物和脐带血来源的干细胞已获得韩国食品药品管理局（KFDA）批准用于软骨再生。此外，KFDA也已批准将脂肪组织来源的基质血管组分（SVF）用于人体患者的关节注射。自体脂肪组织来源的SVF除了含有间充质干细胞外，还包含细胞外基质（ECM）。ECM可分泌多种细胞因子，这些细胞因子与透明质酸（HA）以及经氯化钙激活的富血小板血浆（PRP）共同作用，可能有助于MSCs再生软骨并改善膝关节功能。本文介绍了一种通过在OA患者体内再生类似软骨组织以改善膝关节功能的操作方案。该方案的效果最早于2011年报道，随后又有若干补充性研究发表。该方案包括通过抽脂术获取自体脂肪抽吸物，并将其与胶原酶混合。随后对脂肪抽吸物-胶原酶混合物进行切割和均质化处理，以去除可能在注射过程中堵塞针头的大块纤维组织。之后将混合物进行孵育，以获得脂肪组织来源的SVF。最终得到的脂肪组织来源SVF含有脂肪组织来源的MSCs以及ECM残余成分，将其与HA及经氯化钙激活的PRP联合后注射至患者膝关节内。文中包含三例接受本方案治疗的患者案例，结果显示膝关节疼痛、肿胀及活动范围均有所改善，并有MRI证据显示出现了类似透明软骨的组织。

三名患者（一名87岁患有3期骨关节炎的女性、一名68岁患有3期骨关节炎的男性，以及一名60岁患有3期骨关节炎的女性）既往无显著病史，因持续性膝关节疼痛就诊，希望接受潜在的自体脂肪组织来源的基质血管组分（SVF）治疗。三名患者均经骨科医生检查膝关节，曾被建议行全膝关节置换术（TKR），但均不愿接受手术。在治疗前，三名患者均已接受过多次皮质类固醇和透明质酸（HA）注射，但均未获得持久改善。
这位87岁的韩国女性患者在就诊时主诉静息状态下存在剧烈疼痛（VAS评分为8分；图2A）。她表示在上下楼梯时疼痛加剧（FRI评分：37；图2A）。体格检查发现轻度关节肿胀，活动范围（ROM）减小，并在屈曲时出现压痛（图2B）。然而，未发现韧带松弛。麦克默里（McMurray）试验和阿普利（Apl...

本文介绍了一种制备脂肪组织来源的基质血管组分的方案，并将其应用于骨关节炎患者，通过再生类似软骨的组织以改善膝关节功能。

骨关节炎（OA）是最常见的致残性疾病之一。近年来，人们已做出大量尝试以改善……的功能。

骨关节炎是老年人群中最常见的致残性疾病之一。目前尚无明确方法治愈骨关节炎的根本病因。本临床方案描述了一种创新性操作流程，旨在通过再生类似软骨的组织，为人类膝骨关节炎提供一种具有前景、微创且可替代的治疗方法。骨关节炎是老年人群中最常见的致残性疾病之一。目前尚无明确方法治愈骨关节炎的根本病因。本临床方案是一种创新性操作，旨在通过再生类似软骨的组织，为人类膝骨关节炎提供一种具有前景、微创且替代性的治疗方法。将患者送入配备生物危害A级罩的手术室，并使其仰卧。用5%聚维酮碘溶液清洁患者腹部区域，采用无菌技术为患者铺巾，暴露腹部拟进行吸脂术的清洁区域。在脐部下方约五厘米处偏外侧，于脐部左右两侧各麻醉一个部位，作为即将进行切口的位置。使用5毫升注射器，装有2毫升不含肾上腺素的2%利多卡因，采用25号1.5英寸针头，于表皮层水平对每个部位进行注射。使用5毫升肿胀液和10毫升注射器，配合25号1.5英寸针头，对拟切开部位进行局部麻醉。通过捏起皮肤以增加皮下层次的深度，在脐部外侧下方约5厘米处，做两个长约0.5厘米的切口。使用11号刀片，协助隆起的皮肤穿透至皮下层，但不要穿透腹壁。使用20厘米长的60规格套管，将700至800毫升肿胀液注入拟进行吸脂的整个下腹部皮下层以实施麻醉。完成整个下腹部的肿胀液浸润后，准备吸脂装置：将一根3.0毫米套管连接至60毫升或30毫升注射器用于手动吸脂，或使用特制的3.0毫米套管连接至离心套件。一种由我们自主研发并获得美国FDA CDRH批准的封闭系统注射器，用于在负压辅助吸脂过程中保持无菌状态，并连接至真空设备。进行吸脂手术以获取100至110克脂肪组织（不包括肿胀液）。在实施吸脂时，脂肪组织将与肿胀液一同被抽出，但需将其分离并去除。为了首先通过重力分离肿胀液，可将离心套件中的脂肪组织转移至一个60毫升注射器中，并将注射器垂直放置，例如针头开口端朝下。静置五到六分钟后，脂肪组织与肿胀液即可实现分离。通过按压注射器推杆顶部，移除注射器底部的液体。重复上述步骤9到11次，直至每个膝关节累积获得100克至110克的脂肪组织脂质抽吸物。通过重力分离肿胀液后，每套60毫升离心装置无菌封闭系统中累积50克至55克脂质抽吸物，将两套装有抽吸物的离心装置放入离心机容器吊桶中，在1600 ×g 条件下离心5分钟，使脂质抽吸物浓缩，并将液体与脂肪组织分离。此过程会进一步浓缩脂质抽吸物，并在某些情况下可能产生脂肪油。注意不要晃动，取下离心套件底部的安全帽和塞子。通过缓慢下压离心套件推杆的顶部，移除底部液体。另取一个60毫升注射器，加入10毫克胶原酶、5毫克特异性针对结缔组织的胶原酶和5毫克特异性针对脂肪组织的胶原酶，用50毫升生理盐水溶解。将约25至30毫升浓缩脂肪抽吸物与上述溶解的胶原酶溶液（含5毫克特异性针对结缔组织的胶原酶和5毫克特异性针对脂肪组织的胶原酶）按1:1的体积比混合，使用专用连接器将60毫升注射器与离心套件相连。通过推杆或推注器反复推动内容物在60毫升注射器与离心套件之间转移，充分混匀，以使抽吸物与胶原酶充分接触并浓缩。将脂质抽吸物与胶原酶的混合物转移回60毫升注射器中。将装有该混合物的每个60毫升注射器连接至含有刀片的组织匀浆器。将一个空的60毫升注射器连接至匀浆器的另一端。通过匀浆器将混合物推入另一个60毫升注射器中，重复四到六次，从而使脂肪抽吸物被剪切和切碎。通过专用连接器，将匀浆后的脂肪抽吸物和胶原混合物转移回60毫升离心套件中。将离心套件放入容器中，并置于已预热至37摄氏度的培养箱内。将两个离心管套件与匀浆混合物在37摄氏度下孵育40分钟，同时以45 rpm的速度旋转。孵育40分钟后，以无菌方式从培养箱中取出容器。然后取出离心管套件，并将其放入离心机中。将混合物在800 G条件下离心五分钟，以分离脂肪组织来源的基质血管组分（SVF）。离心结束后，通过移除柱塞顶部的注射器帽，并通过注射器锁紧连接在柱塞开口处安装一个30毫升注射器，将含有胶原酶和消化后脂肪组织的上清液从每个离心套件中移除。缓慢下压30毫升注射器的筒体部分，使上清液缓缓进入该注射器内。将30毫升注射器筒完全下压，直至离心套件底部仅剩最后3至4毫升，保留最后3至4毫升的脂肪组织来源基质血管组分（SVF）。弃去上清液。将30毫升注射器从柱塞顶部取下，并用5%葡萄糖乳酸林格液（又称D5LR）充满注射器。将装有 D5LR 的 30 毫升注射器连接到活塞开口顶部，向含有 3 至 4 毫升脂肪组织来源 SVF 的离心套件中加入 D5LR，直至总体积达到 55 毫升。随后取下 30 毫升注射器，封闭活塞开口，并以 300 G 再次离心约 4 分钟。重复步骤 17 至步骤 21，共完成四次洗涤。第四次离心后，为获得最终用于注射的基质血管组分（SVF），请在不摇动或翻转离心套件的情况下，取下离心套件顶部的安全帽和底部开口处的塞子。使用特制连接器将一个20毫升注射器连接至离心套件的底部开口。来回多次抽拉20毫升注射器的活塞，以重悬已沉降至离心套件底部的细胞。取出含有ASTs和ECM以及其他细胞和组织的SVF所需总体积。通常每个离心套件用于膝关节注射时约为三到四毫升。我们使用了30毫升自体血液以及2.5毫升抗凝剂枸橼酸右旋糖溶液。然后将采集的血液转移至60毫升离心管套件中，在730 ×g 条件下离心5分钟。弃去上清液，并将其转移至新的60毫升离心管套件中。将上清液以1350重力离心4分钟，获得4.4毫升PRP。用5%聚维酮碘清洁患者膝关节，并以无菌方式铺巾。触诊膝关节前方，确定胫骨与股骨之间的关节间隙。用稀释的利多卡因对注射部位进行表皮麻醉，即从皮肤至关节囊外层使用1毫升1%利多卡因与4毫升生理盐水稀释后的溶液。然后用稀释的罗哌卡因对关节囊内部进行麻醉，即使用1毫升0.75%罗哌卡因与3毫升生理盐水稀释后的溶液。通过注射器连接器，将2毫升透明质酸（HA）与装有6至8毫升SVF的20毫升注射器中的SVF混合。使用注射器连接器，将0.4毫升氯化钙加入已制备好的3至4毫升自体富血小板血浆（PRP）中，该PRP已置于5毫升注射器内待用。通过注射器连接器，将5毫升注射器中的3.5至4.5毫升PRP-氯化钙混合物与20毫升注射器中的8至10毫升HA-SVF混合物充分混合。立即缓慢注射约12至15毫升的混合液至膝关节前胫股关节腔内，使用38毫米18号针头，可选择在超声引导下或无超声引导进行注射。注射后，将4×4棉纱布折叠四次，覆盖于注射部位并用胶带固定，以加压包扎。指导患者静卧60分钟，以利于细胞附着。指导患者在离开诊所后至少一周内限制活动。返回诊所，在三周内再接受三次经氯化钙激活的PRP注射。该3期骨关节炎患者接受了方案部分所述的治疗。在注射ASV-ECM混合物第二周后，患者的疼痛和关节活动范围（ROM）得到改善。到第16周时，患者的疼痛和关节活动范围（ROM）改善超过70%。第16周后的治疗后MRI显示，膝关节内侧软骨样组织厚度增加。另一位三期骨关节炎患者接受了方案部分所述的治疗。在注射ASV-ECM混合物后的第二周，患者的疼痛和关节活动范围即有所改善。到第18周时，疼痛和关节活动范围（ROM）显著改善，达到80%。第18周后重复进行的MRI显示，膝关节前内侧软骨样组织的高度增加。第三位处于三期骨关节炎的患者接受了方案部分所述的治疗。在注射ASV-ECM混合物后的第二周，患者的疼痛和关节活动范围改善了约50%。到第22周时，疼痛和关节活动范围显著改善，超过80%。第22周后重复进行的MRI显示，膝关节内侧软骨样组织的高度增加。目前尚无可用于治疗骨关节炎（OA）的治愈性疗法。然而，通过经皮注射脂肪来源干细胞（ASCs）和均质化的细胞外基质（ECM），联合透明质酸（HA）以及经氯化钙激活的富血小板血浆（PRP）类似物，可能为当前膝关节OA的治疗提供一种替代方案。

clinical-protocol-producing-adipose-tissue-derived-stromal-vascular

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

制备脂肪组织基质血管部分用于潜在软骨再生的临床协议

本方案描述了从脂肪抽吸物中分离脂肪源性基质细胞以及制备4...

使用抽脂术获取的脂肪源性基质细胞修复颅骨临界尺寸缺损模型

2001年，加州大学洛杉矶分校的研究人员描述了一种从脂肪组织中分离成体干细胞群体的方法，这类细胞被称为脂肪来源干细胞（Adipose-derived Stem...

从人脂肪抽吸物中手动分离脂肪来源干细胞

利用细胞表面标志物和成骨基因，可在单细胞水平上定义人脂肪来源基质细胞内的转录异质性。我们描述了一种利用流式细胞术分离具有增强成骨潜能的细胞亚群的方案，该方案可用于增强颅面骨骼的重建。...

人脂肪来源基质细胞的分离与富集以增强成骨作用

本研究旨在报道一种利用微骨折技术结合纯化脂肪来源干细胞进行距骨软骨损伤关节镜治疗的操作方案。...

自体微骨折并纯化脂肪组织用于踝关节镜下距骨骨软骨损伤的治疗

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脂肪抽吸物的机械微粒化用于再生治疗

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机械分离基质血管组分与纤维蛋白水凝胶的联合应用：一种处理方案

本文介绍了一种可将自体脂肪组织转化为多种具有不同理化特性和功能的脂肪组分物质的实验方案。...

创新的脂肪组织分选技术：将脂肪转化为特化组分

富含肌成纤维细胞的癌相关成纤维细胞（CAFs）存在于肿瘤间质中，在驱动肿瘤进展中发挥重要作用。我们建立了一种共移植肿瘤异种移植模型，用于从人乳腺成纤维细胞实验性地生成CAFs。本方案描述了如何建立获得促肿瘤发生能力的CAF肌成纤维细胞。...

从人乳腺成纤维细胞实验性生成癌相关成纤维细胞（CAFs）

激光显微切割技术能够从微量的实质组织中分离特定细胞。本文描述了一种从手术标本中获取人胰腺胰岛用于转录组学研究的实验方案。该方案可增强人β细胞固有的自发荧光，从而便于其收集。...

改进的人类胰岛手术标本激光显微切割操作方案

了解从脂肪组织中分离基质血管部分用于膝关节骨关节炎治疗的临床方案。该方法通过微创技术促进软骨样组织再生，改善患者膝关节功能，为再生医学领域提供创新治疗策略。

用于软骨再生的脂肪组织来源基质血管组分制备的临床方案

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