用于软骨再生的脂肪组织来源基质血管组分制备的临床方案

骨关节炎是老年人群中最常见的致残性疾病之一。目前尚无明确方法治愈骨关节炎的根本病因。本临床方案描述了一种创新性操作流程，旨在通过再生类似软骨的组织，为人类膝骨关节炎提供一种具有前景、微创且可替代的治疗方法。

骨关节炎是老年人群中最常见的致残性疾病之一。目前尚无明确方法治愈骨关节炎的根本病因。本临床方案是一种创新性操作，旨在通过再生类似软骨的组织，为人类膝骨关节炎提供一种具有前景、微创且替代性的治疗方法。

将患者送入配备生物危害A级罩的手术室，并使其仰卧。用5%聚维酮碘溶液清洁患者腹部区域，采用无菌技术为患者铺巾，暴露腹部拟进行吸脂术的清洁区域。在脐部下方约五厘米处偏外侧，于脐部左右两侧各麻醉一个部位，作为即将进行切口的位置。

使用5毫升注射器，装有2毫升不含肾上腺素的2%利多卡因，采用25号1.5英寸针头，于表皮层水平对每个部位进行注射。使用5毫升肿胀液和10毫升注射器，配合25号1.5英寸针头，对拟切开部位进行局部麻醉。通过捏起皮肤以增加皮下层次的深度，在脐部外侧下方约5厘米处，做两个长约0.5厘米的切口。

使用11号刀片，协助隆起的皮肤穿透至皮下层，但不要穿透腹壁。使用20厘米长的60规格套管，将700至800毫升肿胀液注入拟进行吸脂的整个下腹部皮下层以实施麻醉。完成整个下腹部的肿胀液浸润后，准备吸脂装置：将一根3.0毫米套管连接至60毫升或30毫升注射器用于手动吸脂，或使用特制的3.0毫米套管连接至离心套件。

一种由我们自主研发并获得美国FDA CDRH批准的封闭系统注射器，用于在负压辅助吸脂过程中保持无菌状态，并连接至真空设备。进行吸脂手术以获取100至110克脂肪组织（不包括肿胀液）。在实施吸脂时，脂肪组织将与肿胀液一同被抽出，但需将其分离并去除。

为了首先通过重力分离肿胀液，可将离心套件中的脂肪组织转移至一个60毫升注射器中，并将注射器垂直放置，例如针头开口端朝下。静置五到六分钟后，脂肪组织与肿胀液即可实现分离。

通过按压注射器推杆顶部，移除注射器底部的液体。重复上述步骤9到11次，直至每个膝关节累积获得100克至110克的脂肪组织脂质抽吸物。通过重力分离肿胀液后，每套60毫升离心装置无菌封闭系统中累积50克至55克脂质抽吸物，将两套装有抽吸物的离心装置放入离心机容器吊桶中，在1600 ×g 条件下离心5分钟，使脂质抽吸物浓缩，并将液体与脂肪组织分离。

此过程会进一步浓缩脂质抽吸物，并在某些情况下可能产生脂肪油。注意不要晃动，取下离心套件底部的安全帽和塞子。通过缓慢下压离心套件推杆的顶部，移除底部液体。

另取一个60毫升注射器，加入10毫克胶原酶、5毫克特异性针对结缔组织的胶原酶和5毫克特异性针对脂肪组织的胶原酶，用50毫升生理盐水溶解。将约25至30毫升浓缩脂肪抽吸物与上述溶解的胶原酶溶液（含5毫克特异性针对结缔组织的胶原酶和5毫克特异性针对脂肪组织的胶原酶）按1:1的体积比混合，使用专用连接器将60毫升注射器与离心套件相连。通过推杆或推注器反复推动内容物在60毫升注射器与离心套件之间转移，充分混匀，以使抽吸物与胶原酶充分接触并浓缩。

将脂质抽吸物与胶原酶的混合物转移回60毫升注射器中。将装有该混合物的每个60毫升注射器连接至含有刀片的组织匀浆器。将一个空的60毫升注射器连接至匀浆器的另一端。

通过匀浆器将混合物推入另一个60毫升注射器中，重复四到六次，从而使脂肪抽吸物被剪切和切碎。通过专用连接器，将匀浆后的脂肪抽吸物和胶原混合物转移回60毫升离心套件中。将离心套件放入容器中，并置于已预热至37摄氏度的培养箱内。

将两个离心管套件与匀浆混合物在37摄氏度下孵育40分钟，同时以45 rpm的速度旋转。孵育40分钟后，以无菌方式从培养箱中取出容器。然后取出离心管套件，并将其放入离心机中。

将混合物在800 G条件下离心五分钟，以分离脂肪组织来源的基质血管组分（SVF）。离心结束后，通过移除柱塞顶部的注射器帽，并通过注射器锁紧连接在柱塞开口处安装一个30毫升注射器，将含有胶原酶和消化后脂肪组织的上清液从每个离心套件中移除。缓慢下压30毫升注射器的筒体部分，使上清液缓缓进入该注射器内。

将30毫升注射器筒完全下压，直至离心套件底部仅剩最后3至4毫升，保留最后3至4毫升的脂肪组织来源基质血管组分（SVF）。弃去上清液。将30毫升注射器从柱塞顶部取下，并用5%葡萄糖乳酸林格液（又称D5LR）充满注射器。

将装有 D5LR 的 30 毫升注射器连接到活塞开口顶部，向含有 3 至 4 毫升脂肪组织来源 SVF 的离心套件中加入 D5LR，直至总体积达到 55 毫升。随后取下 30 毫升注射器，封闭活塞开口，并以 300 G 再次离心约 4 分钟。重复步骤 17 至步骤 21，共完成四次洗涤。

第四次离心后，为获得最终用于注射的基质血管组分（SVF），请在不摇动或翻转离心套件的情况下，取下离心套件顶部的安全帽和底部开口处的塞子。使用特制连接器将一个20毫升注射器连接至离心套件的底部开口。来回多次抽拉20毫升注射器的活塞，以重悬已沉降至离心套件底部的细胞。

取出含有ASTs和ECM以及其他细胞和组织的SVF所需总体积。通常每个离心套件用于膝关节注射时约为三到四毫升。我们使用了30毫升自体血液以及2.5毫升抗凝剂枸橼酸右旋糖溶液。

然后将采集的血液转移至60毫升离心管套件中，在730 ×g 条件下离心5分钟。弃去上清液，并将其转移至新的60毫升离心管套件中。

将上清液以1350重力离心4分钟，获得4.4毫升PRP。用5%聚维酮碘清洁患者膝关节，并以无菌方式铺巾。触诊膝关节前方，确定胫骨与股骨之间的关节间隙。

用稀释的利多卡因对注射部位进行表皮麻醉，即从皮肤至关节囊外层使用1毫升1%利多卡因与4毫升生理盐水稀释后的溶液。然后用稀释的罗哌卡因对关节囊内部进行麻醉，即使用1毫升0.75%罗哌卡因与3毫升生理盐水稀释后的溶液。通过注射器连接器，将2毫升透明质酸（HA）与装有6至8毫升SVF的20毫升注射器中的SVF混合。

使用注射器连接器，将0.4毫升氯化钙加入已制备好的3至4毫升自体富血小板血浆（PRP）中，该PRP已置于5毫升注射器内待用。通过注射器连接器，将5毫升注射器中的3.5至4.5毫升PRP-氯化钙混合物与20毫升注射器中的8至10毫升HA-SVF混合物充分混合。立即缓慢注射约12至15毫升的混合液至膝关节前胫股关节腔内，使用38毫米18号针头，可选择在超声引导下或无超声引导进行注射。

注射后，将4×4棉纱布折叠四次，覆盖于注射部位并用胶带固定，以加压包扎。指导患者静卧60分钟，以利于细胞附着。指导患者在离开诊所后至少一周内限制活动。

返回诊所，在三周内再接受三次经氯化钙激活的PRP注射。该3期骨关节炎患者接受了方案部分所述的治疗。在注射ASV-ECM混合物第二周后，患者的疼痛和关节活动范围（ROM）得到改善。

到第16周时，患者的疼痛和关节活动范围（ROM）改善超过70%。第16周后的治疗后MRI显示，膝关节内侧软骨样组织厚度增加。另一位三期骨关节炎患者接受了方案部分所述的治疗。在注射ASV-ECM混合物后的第二周，患者的疼痛和关节活动范围即有所改善。

到第18周时，疼痛和关节活动范围（ROM）显著改善，达到80%。第18周后重复进行的MRI显示，膝关节前内侧软骨样组织的高度增加。第三位处于三期骨关节炎的患者接受了方案部分所述的治疗。在注射ASV-ECM混合物后的第二周，患者的疼痛和关节活动范围改善了约50%。到第22周时，疼痛和关节活动范围显著改善，超过80%。第22周后重复进行的MRI显示，膝关节内侧软骨样组织的高度增加。

目前尚无可用于治疗骨关节炎（OA）的治愈性疗法。然而，通过经皮注射脂肪来源干细胞（ASCs）和均质化的细胞外基质（ECM），联合透明质酸（HA）以及经氯化钙激活的富血小板血浆（PRP）类似物，可能为当前膝关节OA的治疗提供一种替代方案。