低血清条件下诱导心脏前体细胞向内皮细胞分化

心脏前体细胞（CPCs）在扩增后发生分化，需要从增殖阶段向定向分化阶段转换，本方案可实现CPCs向内皮细胞系的高效分化。该技术的主要优势在于适用于采用不同分离技术及来自不同物种的CPCs。本方案可用于增强CPCs在细胞治疗中的治疗潜力。

该方法还可用于研究分化潜能与分化机制，以及心脏疾病对这些过程的影响。CPCs 是一类异质性的细胞群体，其形态、大小和分化潜能可能存在差异。因此，该实验方案需根据所使用的特定 CPC 亚群进行相应调整。

小鼠麻醉后，用70%乙醇擦拭其胸部。使用剪刀剪开皮肤和胸壁以暴露胸腔。用镊子提起心脏，然后用剪刀在基部将其剪下。

将心脏转移至含有5毫升冷PBS的P60培养皿中，然后用镊子挤压心脏，排出心腔内的血液。将心脏放入含有5毫升冷PBS的P60培养皿中清洗。用小剪刀去除心房，将心脏沿纵轴切成两半，并在5毫升冰冻PBS中清洗。

使用小型剪刀将心脏组织切成更小的片段。加入一滴含有浓度为每毫升一毫克胶原酶B的汉克斯平衡盐溶液，并用无菌剃刀片充分剪碎心脏小块。接着，向培养皿中加入2.5毫升胶原酶B溶液。

将培养皿置于37摄氏度培养箱中，倾斜30度。将剪碎的心脏组织在培养箱中孵育最多30分钟，孵育期间每10分钟用巴斯德吸管反复吹打一次。首先，向剪碎并均质化的心脏组织中加入5毫升含2% FBS的冷HBSS。

使用100微米滤器过滤心肌组织碎片，以去除未消化的组织。在室温下以470 × g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀物重悬于5毫升红细胞裂解缓冲液中。

置于冰上孵育五分钟，期间偶尔振荡。随后加入10毫升PBS，通过40微米滤膜过滤样品，以去除包括残留心肌细胞在内的较大细胞。在室温下以470 × g离心五分钟，离心时不用刹车。

随后，将细胞重悬于添加了10% FBS的DMEM培养基中，调整细胞浓度至每毫升一百万个细胞。将细胞分装到两个试管中用于染色和分选，向其中一个试管加入1.5毫升细胞悬液，向另一个试管加入3.5毫升细胞悬液。加入Hoechst溶液，在37°C孵育90分钟，期间偶尔轻柔翻转试管，以确保染料均匀分布并防止细胞聚集。

侧群细胞出现在主细胞群的Hoechst低荧光左下角区域。在FACS图中，可通过阴性对照识别该侧群细胞，其中维拉帕米可使侧群细胞消失。将培养基预热至37摄氏度，并将离心机预冷至4摄氏度。

在470 × g、4摄氏度条件下离心分选管6分钟。然后，将细胞重悬于1号培养基中。将细胞转移至含有4毫升1号培养基的透气性P60培养皿中。

每三天更换一次培养基，直至细胞融合度达到70%至80%。在T75培养瓶中，每瓶加入八毫升培养基一，培养SP-CPCs两至三天。随后，小心吸除培养基，并用五毫升预热的HBSS轻轻冲洗培养瓶。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，用五毫升胰蛋白酶EDTA处理细胞五分钟。

然后，加入 5 毫升培养基一以终止胰蛋白酶活性，并将细胞悬液转移至 15 毫升离心管中。在室温下以 470 × g 离心 5 分钟。接着，将细胞重悬于培养基一或培养基二中。

将细胞接种于P60培养皿中，每皿接种250,000个SP-CPCs，并加入3毫升含不同血清浓度的培养基。培养两天后，将每皿中的培养基收集至15毫升离心管中以收集死亡细胞。按照前述方法用胰蛋白酶消化贴壁细胞，并将细胞悬液收集至含有已收集培养基的15毫升离心管中。

在室温下以840 × g离心五分钟，然后吸除上清液，加入一毫升介质一或介质二用于细胞计数。用台盼蓝染色SP-CPCs，并计数活细胞和死细胞。首先，吸除已准备好的细胞中的培养基，并用五毫升预热的HBSS轻轻冲洗。

在细胞培养箱中用 5 毫升胰蛋白酶 EDTA 处理细胞 5 分钟。然后加入 5 毫升培养基一以终止胰蛋白酶活性。将细胞悬液转移至 15 毫升离心管中，在室温下以 470 × g 离心 5 分钟。

吸去上清液，加入培养基二进行细胞计数。随后，将80,000个细胞接种至预先包被的六孔培养板中，每孔加入三毫升培养基二。将培养板置于37摄氏度环境中培养20至24小时，然后将每孔中的培养基更换为三毫升培养基三。

将培养板培养21天，每三天更换一次培养基。此后，使用内皮细胞标志物对细胞进行染色，并进行荧光显微镜观察，以验证分化细胞的内皮特性。首先，吸除已制备细胞中的培养基，并用5毫升温热的HBSS轻轻冲洗细胞。

在细胞培养箱中用两毫升胰蛋白酶EDTA处理细胞五分钟，然后加入三毫升培养基三以终止胰蛋白酶活性。将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在室温下以470 × g离心五分钟。吸除上清液，加入一毫升培养基三，轻轻吹打混匀。

计数细胞，并将2,000至4,000个细胞接种到96孔板中每个包被基质的孔内，每孔体积为100微升培养基，每种条件设三个复孔。将培养板在37摄氏度下孵育16小时。之后，在2倍放大倍数下使用明场显微镜拍摄细胞图像。

本研究探讨了促进心脏祖细胞向内皮细胞系分化的适宜条件。当细胞汇合度在60%或以下时，使用3.5%FBS处理的样本之间未观察到显著差异。当在此汇合度下的细胞用0.1%FBS处理时，与纤连蛋白相比，在层粘连蛋白上细胞增殖减少，但细胞死亡未见增加。

相比之下，在高密度培养条件下，两种处理之间的细胞增殖或细胞死亡均无显著差异。细胞形态的变化似乎是内皮分化能够成功进行的适宜培养条件的一个指标。在内皮分化培养基中培养7至14天后，成功的培养体系中可见细胞体积增大且形态发生改变。

有趣的是，这些细胞在分化阶段末期逐渐消失，在高密度培养中出现的数量较少且时间较晚。在低密度接种并接种于层粘连蛋白上的细胞中，管状结构形成 consistently 成功；而在高密度接种的细胞中，该过程大多失败。无论细胞密度如何，在纤连蛋白上培养的细胞中管状结构形成大多不成功，仅在低密度条件下分化的细胞有时可形成初级管状结构。

诱导内皮细胞系的血清浓度和细胞密度至关重要，必须进行调整以确保在维持细胞活力的同时减缓增殖速度。在诱导细胞系分化后，可利用来自人类或临床前疾病模型的心脏祖细胞（CPCs）开展细胞移植研究，以评估其体内分化潜能。该方案有助于研究或建立新的心脏再生工具，此前已被用于研究早期谱系定向的分子机制。