Name: 低血清条件下心脏祖细胞内皮分化的诱导作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 了解心脏祖细胞在低血清条件下诱导内皮分化的标准化实验方案。该方法通过优化细胞密度和层粘连蛋白基质，实现高效的内皮谱系定向分化，适用于心脏再生医学与疾病机制研究。

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作者感谢Vera Lorenz在实验过程中提供的有益支持，以及巴塞尔大学和巴塞尔大学医院生物医学系（DBM）流式细胞术平台工作人员的帮助。本研究由巴塞尔大学的Stay-on track项目（资助Michika Mochizuki）提供支持。Gabriela M. Kuster获得了瑞士国家科学基金会的资助（资助号310030_156953）。

用于细胞分离的小鼠使用遵循《实验动物护理和使用指南》以及瑞士动物保护法，并已获得瑞士州级主管部门的批准。
注意：从小鼠心脏分离 Sca-1+/CD31- SP-CPC 的方法基本如先前所述34，但有部分修改。所用材料与试剂详见材料表。所有实验中，从小鼠分离的心脏 SP-CPC 均以类似细胞系的方式进行扩增、传代和使用。本研究使用第 7 至 20 代的细胞。
1. 组织制备
注意：所有使用小鼠的实验必须根据相关指南和法规进行。本方案使用四只小鼠。在本方案的以下部分中，直径为100 mm的培养皿记为P100，直径为60 mm的培养皿记为P60。
<ol>
	<li>每只小鼠按 200 mg/kg 剂量腹腔注射戊巴比妥钠，通过夹趾反应确认其完全麻醉。</li>
	<li>用 70% 乙醇擦拭胸部，用剪刀剪开皮肤和胸壁，暴露胸腔。</li>
	<li>用镊子提起心脏，用剪刀在基部剪下心脏，将心脏放入含 25 mL（P60 为 5 mL）冷磷酸盐缓冲液（PBS）的 P100 培养皿中（每 P100 放 3 至 5 个心脏，每 P60 放 1 至 2 个心脏）。</li>
	<li>用镊子挤压心脏，将心腔内的血液挤出（图 1A）。</li>
	<li>将心脏放入另一含 25 mL（P60 为 5 mL）冷 PBS 的 P100 培养皿中进行清洗，用小剪刀去除心房，将心脏纵向切成两半，并再次用冰冻 PBS（25 mL/P100，5 mL/P60）清洗。</li>
	<li>将组织块转移至新的含 25 mL（P60 为 5 mL）冷 PBS 的 P100 培养皿中，用小剪刀将组织块进一步剪碎（图 1B），加入一滴用汉克平衡盐溶液（HBSS）稀释的 1 mg/mL 胶原酶 B，再用无菌剃刀刀片充分剪切组织（图 1C）。</li>
</ol>
2. 消化
<ol>
	<li>向步骤1.6中的培养皿中加入10 mL（P60使用2.5 mL）1 mg/mL的胶原酶B溶液。</li>
	<li>将含有剪碎的心脏组织的胶原酶B溶液置于倾斜（约30°）的P100（或P60）培养皿中，放入37 °C培养箱中（图1D）。</li>
	<li>剪碎的心脏组织最多孵育30分钟；孵育期间每10分钟用巴斯德移液管反复吹打以进行匀浆（图1E）。 
	注意：步骤1.3的总孵育时间不得超过30分钟。</li>
</ol>
3. 过滤
<ol>
	<li>向剪碎并均质化的心脏组织中加入 10 mL（P60 培养皿用 5 mL）含 2% FBS 的冷 HBSS。 
	注意：含 2% FBS 的 HBSS 可终止胶原酶 B 活性。</li>
	<li>将心脏组织通过 100 µm 滤膜过滤，以去除未消化的组织，随后在室温（RT）下以 470 × g 离心 5 分钟（图 1F，黄色滤膜）。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀物重悬于 5 mL（P60 培养皿用 3 mL）红细胞裂解缓冲液中，冰上孵育 5 分钟，期间偶尔轻轻振荡。</li>
	<li>加入 10 mL PBS（以终止裂解反应），并通过 40 µm 滤膜过滤样品，以排除包括残留心肌细胞在内的较大细胞（图 1F，蓝色滤膜）。</li>
	<li>在室温（RT）下以 470 × g 离心 5 分钟（不启用刹车）。弃去上清液，将沉淀物重悬于 1 mL 含 10% FBS 的 DMEM 中。</li>
	<li>用血细胞计数板对部分细胞进行计数。用含 10% FBS 的 DMEM 重悬细胞，调整细胞浓度至 1 × 106 个细胞/mL。 
	注意：每只小鼠可获得约 5 × 106 个去除了心肌细胞和红细胞的细胞。</li>
	<li>将细胞分装至两个离心管中（图 2）：在 管 A 中加入 1.5 mL 用于 Hoechst 33342 染色并加入维拉帕米；在 管 B 中加入 18.5 mL 用于 Hoechst 33342 染色，随后进行染色和流式细胞术分选（步骤 4.1 和 4.2）心脏侧群（SP）细胞。</li>
</ol>
4. 通过流式细胞术分选心脏SP细胞
注意：维拉帕米通过抑制多药耐药性（MDR）ABC转运蛋白的活性来阻断 Hoechst 的外排。Hoechst 33342 是一种可与DNA结合的染料，可用于活细胞中检测细胞周期，因其荧光信号与DNA含量相关。能够外排 Hoechst 33342 的细胞在两个发射波长通道（450 nm，Hoechst 蓝色；650 nm，Hoechst 红色）的低荧光区域呈现，位于保留 Hoechst 的“主群体”之外，因此被称为“侧群”（side population, SP）。SP细胞富集具有前体细胞特性的细胞，并高表达多药耐药性ABC转运蛋白（如 MDR1 和 ABCG2）。在本方案后续部分，Hoechst 33342 简称为 Hoechst。为获得理想结果，需注意对光敏感材料进行避光保护。
<ol>
	<li>在有无维拉帕米存在下用Hoechst染色
	<ol>
		<li>向细胞悬液中加入维拉帕米（终浓度为83.3 µM）和Hoechst（终浓度为5 µg/106细胞）。对于试管A，使用维拉帕米和Hoechst；对于试管B，仅使用Hoechst。在37 °C水浴中孵育90分钟，每20分钟颠倒一次试管（图1G）。</li>
		<li>在室温下以470 × g离心5分钟，弃去上清液，将每管沉淀重悬于HBSS中（1 × 106细胞/mL）。</li>
		<li>从试管B中取1.5 mL等分试样用于单染和阴性对照（图2）：(i) 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗Sca-1抗体；(ii) 别藻蓝蛋白（APC）标记的抗CD31抗体；(iii) 未染色细胞（阴性对照）。 
		注：此处使用同型对照以建立分离方案。</li>
		<li>将试管A和B以及单染和阴性对照等分试样在室温下以470 × g离心5分钟，以洗去Hoechst和维拉帕米。</li>
		<li>弃去上清液，将试管A和(iii) 阴性对照的沉淀分别重悬于250 µL HBSS中，置于冰上避光保存直至分选。</li>
		<li>将试管B的沉淀重悬于200 µL HBSS中，将(i, ii) 单染等分试样的沉淀分别重悬于100 µL HBSS中。加入FITC标记的抗Sca-1抗体（0.6 µg/107细胞）和APC标记的抗CD31抗体（0.25 µg/107细胞）。在冰上避光孵育30分钟，期间不时轻轻振荡。</li>
		<li>向各管中加入2 mL HBSS，在室温下以470 × g离心5分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将所有沉淀用1 mL HBSS重悬，再次按上述条件离心。弃去上清液。将单染等分试样的沉淀重悬于200 µL HBSS中，将试管B的沉淀重悬于HBSS中（20 × 106细胞/mL）。</li>
		<li>将样品置于冰上并避光保存，直至进行分选。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流式细胞术分选
	<ol>
		<li>在无菌的1.5 mL分选管中加入含2% FBS的500 µL HBSS。</li>
		<li>在冰上用7-氨基放线菌素D（7-AAD）（0.15 µg/106细胞）染色10分钟，以排除死细胞。</li>
		<li>使用以下参数分选心脏侧群细胞（SP）：采用350 nm（紫外光）激发Hoechst，通过450/50 nm带通滤光片收集Hoechst蓝光发射荧光，通过670/30 nm带通滤光片收集Hoechst红光发射荧光，喷嘴尺寸为100 µm，压力为15 psi。</li>
		<li>分析时，对分选样品记录5 × 105个事件，对阴性对照、维拉帕米对照和单染样品各记录1 × 105个事件。 
		注：心脏SP细胞约占0.5%–2%（图1H），但不同实验室和不同样本之间可能存在差异。Sca-1+/CD31-亚群约占总心脏SP细胞的1%–11%（图1I），不同实验室和样本间也可能存在差异。在本方案后续部分中，Sca-1+/CD31- SP-CPCs简称为SP-CPCs。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 分离的SP-CPCs原代培养
注意：本实验方案中使用了三种不同的培养基，分别称为培养基1（依据Noseda et al.）8、培养基2和培养基3，其组成详见材料表。
<ol>
	<li>使用前将培养基1预热至37 °C，并将离心机冷却至4 °C。在4 °C条件下以470 × g离心分选管6分钟，然后用培养基1重悬细胞。</li>
	<li>将细胞接种于含4 mL培养基1的透气性P60培养皿中。每3天更换一次培养基，直至细胞融合度达到70% - 80%。 
	注意：步骤5.2可能需要约2 - 3周时间。</li>
</ol>
6. SP-CPCs 的扩增与分化
<ol>
	<li>细胞培养
	<ol>
		<li>培养 3 × 10⁵ 个细胞5 T75 培养瓶中含 8 mL 培养基 1 的 SP-CPCs。</li>
		<li>将SP-CPCs在37℃孵育 &#176;C，5% CO₂2 待细胞融合度达到70% - 80%时，每2 - 3天更换一次培养基。 
		注意：细胞数量应根据所用CPCs的类型、倍增时间及细胞大小进行调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>不同血清浓度下SP-CPC的生长与存活
	<ol>
		<li>在 T75 培养瓶中用 8 mL 培养基 1 培养 SP-CPCs 2 - 3 天。小心吸除培养基，用 5 mL 预热（37 °C）的 PBS 温和洗涤一次。 &#176;C）HBSS。</li>
		<li>在细胞培养箱中用5 mL胰蛋白酶-EDTA处理细胞5分钟，加入5 mL培养基1以终止胰蛋白酶活性，然后将细胞悬液转移至15 mL离心管中。</li>
		<li>以 470 × g 离心细胞 g 在室温下孵育5分钟。</li>
		<li>将细胞重悬于培养基1或培养基2（谱系诱导培养基）中，并以2.5 × 10⁵细胞/孔的密度接种于6孔板中。5 将SP-CPCs接种于含不同血清浓度培养基的P60培养皿中，每皿3 mL。</li>
		<li>从步骤6.2.4的培养皿中收集在培养基1或培养基2中培养2天后的培养液，用于收集死亡细胞，并将其置于15 mL离心管中。</li>
		<li>将贴壁细胞按照步骤 6.2.2 进行胰酶消化，并将细胞悬液收集至步骤 6.2.5 的 15 mL 离心管中。在 840 x g 室温下孵育5分钟。</li>
		<li>吸弃上清液，加入1 mL培养基1或培养基2用于细胞计数。用0.4%台盼蓝对SP-CPCs染色，计数台盼蓝阳性（死亡细胞）和台盼蓝阴性（活细胞）的细胞数量。 
		注：细胞活力（步骤 6.2.7）以台盼蓝染色阴性细胞数占总细胞数的比例表示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>内皮分化诱导 
	<ol>
		<li>用10 μg/mL的层粘连蛋白预包被（6孔）培养板 &#181;微克/毫升的层粘连蛋白（LN）或纤连蛋白（FN）
		<ol>
			<li>配制含有10的基质溶液 &#181;g/mL 的 LN 或 FN 与 F12 培养基（或 PBS）混合。每孔加入 2 mL 基质溶液，在 37 °C 下孵育 30 分钟 &#176;C.</li>
			<li>吸出孔板中的溶液，每孔加入 2 mL PBS，直至使用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>吸弃步骤 6.1.2 中细胞的培养基，用 5 mL 温热（37 &#176;C) HBSS 洗涤后，在细胞培养箱中用 5 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液处理 5 分钟，加入 5 mL 培养基 1 以终止胰蛋白酶活性，将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中。</li>
		<li>以 470 x g 离心细胞 g 室温下孵育5分钟。吸除上清液，加入培养基2用于细胞计数。</li>
		<li>接种 8 × 10⁴ 个细胞4 每孔加入3 mL Medium 2重悬细胞，接种于包被好的培养板中，并置于37℃培养 &#176;在37°C下孵育20 - 24小时。将培养基更换为3 mL的Medium 3。 
		注意：我们建议在最初 20 - 24 小时内使用含低浓度血清且不含补充物的培养基。我们建议使用 &#60;60% 细胞汇合度（即（步骤6.3.4的细胞数量需根据细胞大小和生长速率进行调整）。</li>
		<li>将细胞培养21 d，每3 d更换一次培养基。</li>
		<li>通过使用内皮细胞标志物（如血管性血友病因子，vWF）对分化细胞进行染色，并进行荧光显微镜观察，以验证其内皮细胞特性。
		<ol>
			<li>用 1 mL PBS 洗涤细胞，并在室温下用 3.7% 甲醛固定 2 分钟。</li>
			<li>用含 0.1% Triton X 的 ddH₂O 处理细胞使其通透2O（或 PBS）孵育 30 分钟，并在室温下用 10% 山羊血清封闭 1 小时。</li>
			<li>在4℃下用抗血管性血友病因子抗体（1:100）孵育细胞48小时 &#176;C</li>
			<li>用 1 mL PBS 洗涤细胞 3 次，每次 10 分钟。在避光条件下，室温下用 Alexa Fluor 546 标记的山羊抗兔二抗（1:500）孵育 1 小时。</li>
			<li>用1 mL PBS再次洗涤3次，每次10分钟。在避光条件下，室温用4’6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI；1:500）染色细胞核5分钟。</li>
			<li>用 1 mL PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。将细胞装片后于 4 ℃ 保存 &#176;C 
			注意：步骤6.1和6.3中的培养条件（基质、培养基、添加试剂和FBS浓度）在文中有所描述。 图3.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>管形成实验
	<ol>
		<li>制备基底膜基质（例如，Matrigel（下文简称基质）板。
		<ol>
			<li>在 4 ℃ 解冻基质 &#176;C 过夜。</li>
			<li>用100 μL的0.1%明胶溶液包被96孔板 &#181;冰上放置基质液 L。 
			注意：必须避免基质中出现任何气泡。为防止基质凝胶化，必须在冰上进行培养板的包被。</li>
			<li>将培养板置于37 &#176;30 分钟，C</li>
		</ol>
		</li>
		<li>吸弃细胞培养基（在完成步骤 6.3.5 后），用 5 mL 预热至 37℃ 的 PBS 温和地冲洗细胞 &#176;C) HBSS洗涤，并在细胞培养箱中用胰蛋白酶-EDTA处理5分钟。加入培养基3以终止胰蛋白酶活性，将细胞悬液转移至15 mL离心管中。</li>
		<li>以 470 × g 离心细胞 g 在室温下孵育5分钟。吸除上清液，加入1 mL Medium 3，轻轻吹打混匀。</li>
		<li>使用35 μm细胞滤网过滤细胞 &#181;若细胞发生聚集体，则使用 m 细胞滤筛。</li>
		<li>计数细胞，并接种 2 x 103 至 4 × 103 细胞在100 &#181;在每个基质包被的孔中加入 L 的培养基3。将培养板置于37 &#176;在细胞培养箱中孵育16小时。</li>
		<li>使用明场显微镜在2倍放大倍数下拍摄图像。 
		注意：如果胰蛋白酶消化不完全，可将胰蛋白酶-EDTA作用时间延长至最多7 - 8分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案的优势：
本方案提供了一种CPCs向内皮细胞分化的技术。我们发现，在低血清浓度和低细胞密度条件下，内皮分化效率得以提高，且在此条件下，层粘连蛋白（LN）比纤连蛋白（FN）更适合作为基质。我们使用了两种不同类型的CPCs：大鼠CPCs（以类似细胞系的方式使用）和小鼠SP-CPCs（经分离与扩增获得）。值得注意的是，该方案适用于这两种CPCs。目前的技术已能够使科研人员从基因修饰小鼠、临床前疾病模型以及人体中分离并扩增原代CPCs28,36。将本方案应用于分离获得的CPCs，不仅有助于疾病机制的研究，也有助于探索新的治疗靶点。
心肌前体细胞目前正处于细胞治疗的临床试验阶段4,5，通过从患者体内分离细胞，并在体外处理后回输 体外 扩增。在这方面，本文所述方案有助于在移植前识别出增强此...

近期研究表明，成年哺乳动物心脏中存在常驻的心脏祖细胞（CPCs）1,2,3，且CPCs可能在心脏损伤后细胞治疗中具有应用价值4,5。此外，从患有罕见心肌病的患者或相应疾病模型中分离出的扩增CPCs，可为药物筛选和疾病机制研究提供有效的模型6,7。
从成年心脏中分离出的心脏祖细胞（CPCs）具有干细胞/祖细胞特性1,2,3,8，表现为多能性、克隆形成能力以及自我更新能力。然而，存在多种不同的（亚）群CPCs，其表面标志物谱各不相同，例如c-kit、Sca-1等，或通过不同的分离技术获得（表1）。目前已建立多种培养与分化方案1,2,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18。这些方案主要在生长因子和血清成分上存在差异，通常根据培养目的进行调整，可能导致实验结果和结局的不同，包括分化效率的差异。
基于标记物的分离技术：
可根据特定的表面标志物表达来分离CPCs1,2,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18。先前的研究表明，c-kit和Sca-1&#160;可能是分离驻留型CPCs的最佳标志物1,11,14,19,20。由于这些标志物中没有一种对CPCs具有真正的特异性，通常会联合使用多种标志物。例如，尽管CPCs表达低水平的c-kit21，但其他细胞类型（包括肥大细胞22、内皮细胞23和造血干细胞/祖细胞24）也表达c-kit。另一个问题是并非所有标志物在所有物种中均有表达。Sca-1即为一例，其在小鼠中表达，但在人类中不表达25。因此，在涉及临床试验及使用人类样本的研究中，采用不依赖于分离标志物的方案可能更具优势。
不依赖标记物的分离技术：
目前存在多种主要的CPC分离技术，这些技术主要不依赖于表面标志物的表达，但可根据需要通过连续筛选特定标志物阳性的亚群进行优化（另请参见 表1）。(1) 侧群（side population, SP）技术最初基于原始造血干细胞群体排出DNA染料Hoechst 33342的能力而被鉴定26 通过ATP结合盒（ABC）转运蛋白27心脏SP细胞已被不同研究团队分离，并报道其表达多种标志物，各研究间的报告存在一些细微差异。2,8,13,14(2) 成纤维细胞集落形成单位（CFU-Fs）最初是基于类似间充质基质细胞（MSC）的表型定义的。分离得到的MSC在培养皿中培养以诱导集落形成。这类具有集落形成能力的、类似MSC的CFU-Fs可从成年心脏中分离获得，并具有向心脏谱系分化的潜能。15. （3）心脏球来源细胞（CDC）是从组织活检或外植体培养形成的细胞簇中分离得到的单个细胞28,29,30,31最近研究表明，主要是 CD105+/CD90-c-kit- 细胞组分具有心肌生成和再生潜能32.
本文利用从小鼠中分离的SP-CPCs，提供了一种高效诱导内皮细胞谱系的实验方案，该方案基于先前在大鼠CPCs和小鼠SP-CPCs中的研究33。该方案针对细胞密度、培养基中的血清含量以及培养基质等方面，对细胞的培养与扩增技术进行了特定优化。该方法不仅适用于小鼠SP-CPCs，还可应用于其他类型的CPCs，以诱导细胞从扩增状态向内皮细胞定向分化的命运转变，无论其目的是用于细胞移植，还是用于机制性的in vitro研究。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove's 改良 Dulbecco's 培养基（IMDM）</td><td>ThermoFisher</td><td>#12440</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco改良型Eagle培养基（DMEM）/F12营养混合物</td><td>默克</td><td>#D8437</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（P/S）</td><td>ThermoFisher</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Hyclone</td><td>#SH30071</td><td>3.5%（谱系诱导时为0.1%）</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>#25030</td><td>终浓度 2 mM</td></tr><tr><td>谷胱甘肽</td><td>默克</td><td>#G6013</td><td></td></tr><tr><td>重组人表皮生长因子（EGF）</td><td>Peprotech</td><td>#AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>重组碱性成纤维细胞生长因子（FGF）</td><td>Peprotech</td><td>#AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>B27 补充剂</td><td>ThermoFisher</td><td>#17504044</td><td></td></tr><tr><td>心肌营养素1&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>#250-25</td><td></td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>Diagontech AG，瑞士</td><td>#100-125</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td><td>ThermoFisher</td><td>#14170</td><td></td></tr><tr><td>0.05 % 胰蛋白酶-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>#25300</td><td></td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>Sarstedt</td><td>#83.3911</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;内皮分化&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基（EGM）-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>#CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12K（Kaighn's）培养基</td><td>ThermoFisher</td><td>#21127</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白&amp;nbsp;</td><td>默克</td><td>#L2020</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白&amp;nbsp;</td><td>默克</td><td>#F4759</td><td>用ddH2O稀释</td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Falcon</td><td>#353046</td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>默克</td><td>#F1635</td><td>在 PBS 中稀释 1:10（终浓度为 3.7%）</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>默克</td><td>#93420</td><td>0.1% 的 ddH2O 溶液</td></tr><tr><td>正常山羊血清（10%）</td><td>ThermoFisher</td><td>#50062Z</td><td></td></tr><tr><td>抗血管性血友病因子抗体</td><td>Abcam</td><td>#ab6994</td><td>1:100，溶于10%山羊血清中</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG，Alexa Fluor 546</td><td>ThermoFisher</td><td>#A11010</td><td>1:500，溶于10%山羊血清中</td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）</td><td>ThermoFisher</td><td>#62247</td><td>1:500，溶于ddH2O&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SlowFade 抗荧光淬灭试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>#S2828</td><td></td></tr><tr><td>BX63 宽场显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;管状结构形成&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Falcon</td><td>#353072</td><td></td></tr><tr><td>带滤网帽的5 ml圆底管</td><td>Falcon</td><td>#352235</td><td></td></tr><tr><td>基质胶生长因子减量</td><td>康宁</td><td>#354230</td><td></td></tr><tr><td>IX50 宽场显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sca-1+/CD31- 心脏侧群细胞的分离&lt;sup&gt;34&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠 50 mg/ml 兽用</td><td>院内医院药房</td><td>#9077862</td><td>工作溶液：200 mg/kg</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），不含 CaCl₂，不含 MgCl₂</td><td>ThermoFisher</td><td>#20012</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), 酚红(-)</td><td>ThermoFisher</td><td>#14175</td><td>配制 500 mL HBSS 加 2% FBS&amp;nbsp; 用于淬灭胶原酶B活性&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），含1 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸</td><td>ThermoFisher</td><td>#331885</td><td>配制 DMEM + 10% FBS&amp;nbsp; + 25 mM HEPES + P/S 用于Hoechst染色</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&amp;nbsp; (P/S)</td><td>ThermoFisher</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>ThermoFisher</td><td>#15630080</td><td>终浓度 25 mM</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Hyclone</td><td>#SH30071</td><td></td></tr><tr><td>RBC裂解缓冲液（10X）</td><td>BioLegend</td><td>#420301/100mL</td><td>用ddH₂O稀释至1×，并通过0.2 μm滤膜过滤 &amp;micro;m 滤膜</td></tr><tr><td>胶原酶B</td><td>默克</td><td>#11088807001</td><td>终浓度为1 mg/mL的HBSS溶液，经0.2 μm滤膜过滤 &amp;micro;m 滤膜</td></tr><tr><td>双苯并咪唑 H33342 三盐酸盐（Hoechst）</td><td>默克</td><td>#B2261</td><td>用ddH₂O配制1 mg/mL溶液</td></tr><tr><td>盐酸维拉帕米&amp;nbsp;</td><td>默克</td><td>#V4629</td><td>终浓度 83.3 &amp;micro;M&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>APC 小鼠抗大鼠 CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>#551262</td><td>0.25 &amp;micro;克/10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;细胞</td></tr><tr><td>FITC 标记大鼠抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>#557405</td><td>0.6 &amp;micro;克/10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;细胞</td></tr><tr><td>7-氨基放线菌素D (7-ADD)</td><td>ThermoFisher</td><td>#A1310</td><td>0.15 &amp;micro;克/10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;细胞</td></tr><tr><td>APC 标记的大鼠 IgG2a k 同型对照</td><td>BD Biosciences</td><td>#553932</td><td>0.25 &amp;micro;克/10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;细胞</td></tr><tr><td>FITC 标记的大鼠 IgG2a κ 同型对照</td><td>BD 生物科学</td><td>#554688</td><td>0.6 &amp;micro;克/10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;细胞</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27G针头</td><td>Terumo</td><td>#NN-2719R</td><td></td></tr><tr><td>18G针头</td><td>Terumo</td><td>#NN-1838S</td><td></td></tr><tr><td>一次性使用无菌1 mL注射器</td><td>CODAN</td><td>#62.1640</td><td></td></tr><tr><td>移液管 3.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>#86.1171.001</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛 40 &amp;micro;m blue</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>#352340</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤网 100 &amp;micro;m 黄色</td><td>BD Biosciences</td><td>#352360</td><td></td></tr><tr><td>Lumox 培养皿 50</td><td>Sarstedt</td><td>#94.6077.305</td><td></td></tr><tr><td>P100 培养皿</td><td>康宁</td><td>#353003</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>康宁</td><td>#353004</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;小鼠&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;行&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;年龄&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;繁殖&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6NRj / 雄性</td><td>12 周</td><td>自主研发</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;产品名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove's 改良 Dulbecco's 培养基 (IMDM)</td><td>ThermoFisher</td><td>#12440</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）/F12 Ham营养混合物</td><td>默克</td><td>#D8437</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&amp;nbsp; (P/S)</td><td>ThermoFisher</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Hyclone</td><td>#SH30071</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>#25030</td><td></td></tr><tr><td>谷胱甘肽</td><td>默克</td><td>#G6013</td><td></td></tr><tr><td>B27 补充剂</td><td>ThermoFisher</td><td>#17504044</td><td></td></tr><tr><td>重组人表皮生长因子（EGF）</td><td>Peprotech</td><td>#AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>重组碱性成纤维细胞生长因子（FGF）</td><td>Peprotech</td><td>#AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>心肌营养素1&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>#250-25</td><td></td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>Diagontech AG，瑞士&amp;nbsp;</td><td>#100-125</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基（EGM）-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>#CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养基成分概述。部分信息与上述内容相同，但按培养基1-3的成分顺序进行整理。&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;产品名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;培养基1&lt;sup&gt;8&lt;/sup&gt;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;培养基2&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;培养基3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;培养&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;谱系诱导&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;内皮分化&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Iscove's 改良 Dulbecco's 培养基 (IMDM)</td><td>35%</td><td>35%</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）/F12 Ham营养混合物</td><td>65%</td><td>65%</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&amp;nbsp; (P/S)</td><td>1%</td><td>1%</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>3.5%</td><td>&amp;le;0.1%</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺&amp;nbsp;</td><td>2 mM</td><td>2 mM</td><td></td></tr><tr><td>谷胱甘肽</td><td>0.2 nM</td><td>0.2 nM</td><td></td></tr><tr><td>B27 补充剂</td><td>1.3%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>重组人表皮生长因子（EGF）</td><td>6.5 ng/mL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>重组碱性成纤维细胞生长因子（FGF）</td><td>13 ng/mL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>心肌营养素1&amp;nbsp;</td><td>0.65 ng/mL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>0.0005 U/mL</td><td></td><td>试剂盒中包含的所有必要组分</td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基（EGM）-2 BulletKit</td><td></td><td></td><td>试剂盒中包含所有必需组分</td></tr></tbody></table>

低血清条件下诱导心脏前体细胞向内皮细胞分化

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

心脏祖细胞（CPCs）在损伤后心脏再生中可能具有治疗潜力。在成年哺乳动物心脏中，内源性CPCs极为稀少，但扩增后的CPCs可能对细胞治疗具有应用价值。其应用的前提是能够通过明确且高效的方案，可控地分化为多种心脏谱系细胞。此外，从患者或临床前疾病模型中分离的CPCs在体外扩增后，可为研究疾病机制提供有价值的工具。 体外 扩增后，从患者或临床前疾病模型中分离的CPCs可为疾病机制的研究提供有效的研究工具。
目前的研究使用不同的标志物来鉴定心脏祖细胞（CPCs）。然而，并非所有这些标志物均在人类中表达，这限制了某些临床前研究的转化价值。无论分离技术或标志物表达如何，均可适用的分化方案将有助于实现CPCs在细胞治疗应用中的标准化扩增与预处理。本文描述了在低胎牛血清（FBS）浓度和低细胞密度条件下对CPCs进行预处理，可促进其向内皮细胞分化。通过使用小鼠和大鼠CPCs的两个不同亚群，我们证明在以下方案中，层粘连蛋白（laminin）比纤连蛋白（fibronectin）更适合作为此目的的基质：在含有维持多能性添加剂并添加3.5% FBS的培养基中培养2–3天后，将CPCs以低于60%融合度接种于层粘连蛋白上，并在不含添加剂、仅含低浓度FBS（0.1%）的培养基中培养20–24小时，随后转入内皮细胞分化培养基进行分化。由于CPCs为异质性细胞群体，血清浓度和孵育时间可能需要根据特定CPC亚群的特性进行调整。考虑到这一点，该技术也可应用于其他类型的CPCs，为研究CPCs的分化潜能与机制及其在来源于相应疾病模型的CPCs中如何受疾病影响提供了有效方法。 &#60;60%融合度，并在无添加物、低浓度FBS（0.1%）的培养基中培养20–24小时，随后转入内皮细胞分化培养基进行分化。由于CPCs为异质性细胞群体，血清浓度和孵育时间可能需要根据特定CPC亚群的特性进行调整。考虑到这一因素，该技术也可适用于其他类型的CPCs，为研究CPCs的分化潜能与机制及其在来源于相应疾病模型的CPCs中如何受疾病影响提供了有效方法。

小鼠 SP-C 阳性肺泡上皮细胞的分离：
本研究中，我们采用了根据侧群（SP）表型分离的小鼠CPCs，而大鼠CPCs的结果则经修改并添加自先前的报告（已获许可）（图8）33。
高密度和低密度细胞在不同血清浓度下的细胞增殖：
我们之前的研究表明，心源性谱系标志物的mRNA表达在培养的最初24小时内即发生变化。已知细胞外基质会影响细胞命运的决定，包括内皮分化35。为了探索促进心脏前体细胞（CPCs）向内皮谱系分化的适宜条件，本研究在6孔板（生长面积：9.6 cm2<...

本方案描述了一种心脏前体细胞的内皮分化技术，重点介绍血清浓度和细胞接种密度如何影响内皮分化潜能。

心脏祖细胞（CPCs）可能在损伤后心脏再生中具有治疗潜力。在成年哺乳动物心脏中，内源性CPCs数量极为稀少，但扩增后的CPCs可能适用于细胞治疗。其应用的前提是能够利用明确且高效的方案，将这些细胞可控地分化为各种心脏谱系。此外，从患者或临床前疾病模型中分离的CPCs在体外扩增后，可为研究疾病机制提供有价值的工具。目前的研究采用不同的标志物来鉴定CPCs，但并非所有标志物均在人类中表达，这限制了部分临床前研究的转化价值。无论分离方法和标志物表达如何，均可适用的分化方案将有助于CPCs的标准化扩增与诱导，从而服务于细胞治疗目的。本文描述了在低胎牛血清（FBS）浓度和低细胞密度条件下对CPCs进行诱导，可促进其向内皮细胞分化。利用两种不同亚群的小鼠和大鼠CPCs，我们证明在此方案下，层粘连蛋白（laminin）比纤连蛋白（fibronectin）更适合作为培养基质：在含有维持多能性补充物并含3.5% FBS的培养基中培养2–3天后，将CPCs以低于60%融合度接种于层粘连蛋白包被的培养表面，在无补充物、低FBS浓度（0.1%）的培养基中培养20–24小时，随后转入内皮细胞分化培养基进行分化。由于CPCs为异质性细胞群体，血清浓度和孵育时间可能需要根据特定CPC亚群的特性进行调整。考虑到这一点，该技术也可应用于其他类型的CPCs，为研究CPCs的分化潜能与机制及其在来源于相应疾病模型的CPCs中如何受疾病影响提供了有效方法。

心脏前体细胞（CPCs）在扩增后发生分化，需要从增殖阶段向定向分化阶段转换，本方案可实现CPCs向内皮细胞系的高效分化。该技术的主要优势在于适用于采用不同分离技术及来自不同物种的CPCs。本方案可用于增强CPCs在细胞治疗中的治疗潜力。该方法还可用于研究分化潜能与分化机制，以及心脏疾病对这些过程的影响。CPCs 是一类异质性的细胞群体，其形态、大小和分化潜能可能存在差异。因此，该实验方案需根据所使用的特定 CPC 亚群进行相应调整。小鼠麻醉后，用70%乙醇擦拭其胸部。使用剪刀剪开皮肤和胸壁以暴露胸腔。用镊子提起心脏，然后用剪刀在基部将其剪下。将心脏转移至含有5毫升冷PBS的P60培养皿中，然后用镊子挤压心脏，排出心腔内的血液。将心脏放入含有5毫升冷PBS的P60培养皿中清洗。用小剪刀去除心房，将心脏沿纵轴切成两半，并在5毫升冰冻PBS中清洗。使用小型剪刀将心脏组织切成更小的片段。加入一滴含有浓度为每毫升一毫克胶原酶B的汉克斯平衡盐溶液，并用无菌剃刀片充分剪碎心脏小块。接着，向培养皿中加入2.5毫升胶原酶B溶液。将培养皿置于37摄氏度培养箱中，倾斜30度。将剪碎的心脏组织在培养箱中孵育最多30分钟，孵育期间每10分钟用巴斯德吸管反复吹打一次。首先，向剪碎并均质化的心脏组织中加入5毫升含2% FBS的冷HBSS。使用100微米滤器过滤心肌组织碎片，以去除未消化的组织。在室温下以470 × g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀物重悬于5毫升红细胞裂解缓冲液中。置于冰上孵育五分钟，期间偶尔振荡。随后加入10毫升PBS，通过40微米滤膜过滤样品，以去除包括残留心肌细胞在内的较大细胞。在室温下以470 × g离心五分钟，离心时不用刹车。随后，将细胞重悬于添加了10% FBS的DMEM培养基中，调整细胞浓度至每毫升一百万个细胞。将细胞分装到两个试管中用于染色和分选，向其中一个试管加入1.5毫升细胞悬液，向另一个试管加入3.5毫升细胞悬液。加入Hoechst溶液，在37°C孵育90分钟，期间偶尔轻柔翻转试管，以确保染料均匀分布并防止细胞聚集。侧群细胞出现在主细胞群的Hoechst低荧光左下角区域。在FACS图中，可通过阴性对照识别该侧群细胞，其中维拉帕米可使侧群细胞消失。将培养基预热至37摄氏度，并将离心机预冷至4摄氏度。在470 × g、4摄氏度条件下离心分选管6分钟。然后，将细胞重悬于1号培养基中。将细胞转移至含有4毫升1号培养基的透气性P60培养皿中。每三天更换一次培养基，直至细胞融合度达到70%至80%。在T75培养瓶中，每瓶加入八毫升培养基一，培养SP-CPCs两至三天。随后，小心吸除培养基，并用五毫升预热的HBSS轻轻冲洗培养瓶。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，用五毫升胰蛋白酶EDTA处理细胞五分钟。然后，加入 5 毫升培养基一以终止胰蛋白酶活性，并将细胞悬液转移至 15 毫升离心管中。在室温下以 470 × g 离心 5 分钟。接着，将细胞重悬于培养基一或培养基二中。将细胞接种于P60培养皿中，每皿接种250,000个SP-CPCs，并加入3毫升含不同血清浓度的培养基。培养两天后，将每皿中的培养基收集至15毫升离心管中以收集死亡细胞。按照前述方法用胰蛋白酶消化贴壁细胞，并将细胞悬液收集至含有已收集培养基的15毫升离心管中。在室温下以840 × g离心五分钟，然后吸除上清液，加入一毫升介质一或介质二用于细胞计数。用台盼蓝染色SP-CPCs，并计数活细胞和死细胞。首先，吸除已准备好的细胞中的培养基，并用五毫升预热的HBSS轻轻冲洗。在细胞培养箱中用 5 毫升胰蛋白酶 EDTA 处理细胞 5 分钟。然后加入 5 毫升培养基一以终止胰蛋白酶活性。将细胞悬液转移至 15 毫升离心管中，在室温下以 470 × g 离心 5 分钟。吸去上清液，加入培养基二进行细胞计数。随后，将80,000个细胞接种至预先包被的六孔培养板中，每孔加入三毫升培养基二。将培养板置于37摄氏度环境中培养20至24小时，然后将每孔中的培养基更换为三毫升培养基三。将培养板培养21天，每三天更换一次培养基。此后，使用内皮细胞标志物对细胞进行染色，并进行荧光显微镜观察，以验证分化细胞的内皮特性。首先，吸除已制备细胞中的培养基，并用5毫升温热的HBSS轻轻冲洗细胞。在细胞培养箱中用两毫升胰蛋白酶EDTA处理细胞五分钟，然后加入三毫升培养基三以终止胰蛋白酶活性。将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在室温下以470 × g离心五分钟。吸除上清液，加入一毫升培养基三，轻轻吹打混匀。计数细胞，并将2,000至4,000个细胞接种到96孔板中每个包被基质的孔内，每孔体积为100微升培养基，每种条件设三个复孔。将培养板在37摄氏度下孵育16小时。之后，在2倍放大倍数下使用明场显微镜拍摄细胞图像。本研究探讨了促进心脏祖细胞向内皮细胞系分化的适宜条件。当细胞汇合度在60%或以下时，使用3.5%FBS处理的样本之间未观察到显著差异。当在此汇合度下的细胞用0.1%FBS处理时，与纤连蛋白相比，在层粘连蛋白上细胞增殖减少，但细胞死亡未见增加。相比之下，在高密度培养条件下，两种处理之间的细胞增殖或细胞死亡均无显著差异。细胞形态的变化似乎是内皮分化能够成功进行的适宜培养条件的一个指标。在内皮分化培养基中培养7至14天后，成功的培养体系中可见细胞体积增大且形态发生改变。有趣的是，这些细胞在分化阶段末期逐渐消失，在高密度培养中出现的数量较少且时间较晚。在低密度接种并接种于层粘连蛋白上的细胞中，管状结构形成 consistently 成功；而在高密度接种的细胞中，该过程大多失败。无论细胞密度如何，在纤连蛋白上培养的细胞中管状结构形成大多不成功，仅在低密度条件下分化的细胞有时可形成初级管状结构。诱导内皮细胞系的血清浓度和细胞密度至关重要，必须进行调整以确保在维持细胞活力的同时减缓增殖速度。在诱导细胞系分化后，可利用来自人类或临床前疾病模型的心脏祖细胞（CPCs）开展细胞移植研究，以评估其体内分化潜能。该方案有助于研究或建立新的心脏再生工具，此前已被用于研究早期谱系定向的分子机制。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

低血清条件下心脏祖细胞内皮分化的诱导作用

我们已建立了一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导心肌母细胞的方案，该方法能够大量获得用于心血管修复的人心脏前体细胞和功能性心肌细胞。...

高效诱导多能人胚胎干细胞生成人心脏前体细胞和心肌细胞的小分子方法

本研究描述了一种诱导人类胚胎干细胞向胰腺分化的定向分化方法。具有重要意义的发现是，内皮细胞共培养可介导由人类胚胎干细胞衍生的胰腺前体细胞成熟为表达胰岛素的细胞。...

内皮细胞共培养在定向分化策略中促进人胚胎干细胞向胰岛素生成胰腺细胞的成熟

本方案描述了通过强制表达转录因子，从人多能干细胞高效诱导生血内皮细胞和多能造血祖细胞的方法。...

通过转录因子过表达在人多能干细胞中直接诱导生血内皮和血液细胞

本论文描述了利用表面标志物表达和细胞分选技术构建明确组成的工程化心肌组织的方法。这些明确组成的心肌组织随后可用于多组织生物反应器，以研究心脏细胞治疗的机制，从而提供一个具有功能性且可控的人类心脏模型系统。...

构建定义明确的人源工程化心肌组织以研究心肌细胞治疗机制

内皮祖细胞（EPCs）在缺血组织的新生血管形成中起着至关重要的作用。本方法描述了从外周血中分离人源EPCs，以及鉴定其对心脏外科患者血清样本的迁移潜能。...

健康志愿者内皮祖细胞的分离及其受心脏术后血清样本影响的迁移潜能

本实验方案的目的是从脐带血中分离内皮祖细胞。这些细胞的一些应用包括将其作为生物标志物用于识别心血管疾病风险患者、治疗缺血性疾病，以及构建组织工程化的血管和心脏瓣膜结构。...

从人脐带血中分离内皮祖细胞

本文介绍一种可扩展的方法，通过简单组合使用Activin...

从人多能干细胞生成第一心场样心脏前体细胞及心室样心肌细胞

本方法的目的是在体外生成心区特异的心脏前体细胞，以研究前体细胞的特化过程和功能特性，并生成心腔特异的心脏细胞用于心脏疾病建模。...

体外生成心脏区域特异性心脏前体细胞

本方案旨在生成含有源自人诱导性多能干细胞的心血管细胞的网状工程化心肌组织，以用于心脏疾病细胞移植治疗的研究。...

由人iPS细胞衍生的网格状工程化心肌组织制备及其在体内心肌修复中的应用

本文介绍了一种在约1周内将人多能干细胞定向分化为生血性内皮细胞的简单方案。...

人多能干细胞向造血内皮细胞的定向分化

了解心脏祖细胞在低血清条件下诱导内皮分化的标准化实验方案。该方法通过优化细胞密度和层粘连蛋白基质，实现高效的内皮谱系定向分化，适用于心脏再生医学与疾病机制研究。

低血清条件下诱导心脏前体细胞向内皮细胞分化

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