Name: 利用高效液相色谱-电化学检测仪检测大气环境中的 3-硝基酪氨酸 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 了解利用高效液相色谱-电化学检测仪检测大气环境中3-硝基酪氨酸的高灵敏度方法。该技术通过空气采样器预滤膜收集样本，为环境研究人员评估空气质量对健康的影响提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢美国环境保护局的Masayuki Kubo在TSP/PM2.5采样方面提供的帮助。本工作部分由日本学术振兴会科学研究费补助金（JP16K15373和JP18H03039）资助。

1. 总悬浮颗粒物、PM2.5 或 PM7 的采集及颗粒物蛋白质的水解方法
<ol>
	<li>从预过滤器或备用过滤器中收集颗粒物（PM）。
	<ol>
		<li>在采集总悬浮颗粒物（TSP）、PM2.5 和 PM7 之前，称量石英滤膜。 
		注意：由于颗粒物中的蛋白质和多肽污染不会影响酪氨酸硝基化（3-硝基酪氨酸，3-NT）的检测（因其不含硝基），因此我们在测量前未对石英滤膜进行高温处理。此外，经高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ECD）测定，石英滤膜中的3-NT含量低于检测限。</li>
		<li>将石英滤膜安装在带有粒径选择器的高流量空气采样器上，以1,000 L/min的流速连续采集PM7，持续7天（图1B）。TSP可在无粒径选择器的情况下直接用石英滤膜采集（图1A）。</li>
		<li>使用带有粒径分级装置的低流量空气采样器，以116 L/min的流速连续采集PM2.5，持续7天。利用该装置，可将颗粒物分级为PM4.5-2.5、PM7.3-4.5、PM15-7.3 和 TSP-PM15，并分别收集到石英滤膜上进行分类分析。PM2.5 可收集至备用滤膜上（图1C）。</li>
		<li>记录滤膜采样结束时的总采样体积。通过采样前后滤膜重量之差，测定TSP、PM2.5 和 PM7 的质量。将滤膜密封于塑料袋中，并在-30 °C下保存，直至进行下一步操作（见第2节）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对样品进行蛋白水解。
	<ol>
		<li>用0.1 M醋酸盐缓冲液（pH 7.4）溶解非特异性蛋白酶混合物。将该溶液装入透析膜（截留分子量 = 5,000 Da）中，浸入1 L的0.1 M醋酸盐缓冲液中，在4 °C下搅拌透析。每12小时更换缓冲液一次，共更换两次，随后继续透析过夜，以去除蛋白酶溶液中内源性的3-NT和亚硝酸根（NO2-）。透析完成后，收集溶液，并采用双辛可宁酸（BCA）蛋白定量法测定蛋白浓度。</li>
		<li>从预过滤器或备用过滤器上打取直径为6 mm的圆形滤膜片，并将其放入微量离心管中。每次分析最多可使用五片6 mm的滤膜样品（图2）。</li>
		<li>向离心管中加入300 µL含有50 µg蛋白的非特异性蛋白酶混合物溶液（按步骤1.2.1制备），在50 °C下旋转孵育16小时，以水解滤膜上的颗粒物蛋白。 
		注意：为扣除非特异性蛋白酶混合物溶液中内源性3-NT的干扰，需同时制备并消化仅含非特异性蛋白酶混合物的对照样品。</li>
		<li>由于超滤膜及其配套离心管中可能存在与3-NT结构相似的化学污染物，需加入0.1 M醋酸盐缓冲液并离心（10,000 × g，30秒；具体转速依膜材质而定）进行冲洗。重复冲洗一次。</li>
		<li>蛋白水解完成后，将样品在2,500 × g下离心10分钟。取上清液加入超滤膜装置中，在10,000 × g和4 °C条件下进行超滤（截留分子量 = 10,000），直至收集到足够体积的滤出液。将滤出液避光保存于4 °C。 
		注意：由于离心柱中可能检测到与3-NT相似的峰，因此在使用前必须用去离子水或HPLC级水、0.1 M醋酸盐缓冲液等充分洗涤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. TSP 和 PM 中 3-NT 含量的测定2.5，以及 PM7 通过 高效液相色谱-电化学检测系统
注意：参见图3。
<ol>
	<li>配制流动相。
	<ol>
		<li>配制含50 mg/L EDTA的0.2 M磷酸盐缓冲液（pH 2.5）。量取98体积的缓冲液和2体积乙腈（HPLC级），倒入洁净的玻璃瓶中，加盖后剧烈混合。</li>
		<li>将流动相在室温下静置数小时，直至溶解的空气完全释放。 
		注意：如果提前启动系统，流动相可在真空条件下进行超声脱气。然而，过度脱气将改变水相与有机相之间的比例。 通过 蒸发</li>
	</ol>
	</li>
	<li>HPLC-ECD 系统由泵、HPLC 柱、脱气装置、ECD 和进样器组成。平衡流动相并稳定系统，以降低背景信号和噪声。
	<ol>
		<li>安装流动相和高效液相色谱柱至高效液相色谱系统中。启动高效液相色谱泵，在分析开始前一天，以500 µL/min的流速和25 °C的柱温，用流动相冲洗并平衡色谱柱。</li>
		<li>第二天，点燃ECD并设置参数（还原电压为-900 mV，激发电压为400 mV），稳定至少3小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定PM中的3-NT浓度7.
	<ol>
		<li>在0.1 M醋酸盐缓冲液中配制一系列浓度的3-NT标准品（5 - 500 nM）以及一个空白对照（不含3-NT标准品和非特异性蛋白酶混合液，以确保样品瓶或缓冲液未被污染）。</li>
		<li>运行高效液相色谱数据处理器。</li>
		<li>将样品瓶放入自动进样器中，并设置进样体积为 25 µL。流动相组成和流速操作条件同 2.2.1 步骤所述。 
		注意：如果样品制备已完成，应包含样品、标准品（5 - 500 nM）、仅非特异性蛋白酶混合物的样品以及空白瓶。</li>
		<li>确保色谱图的基线平坦，然后开始进样。 
		注意：通常3-NT在20至21分钟时被检测到；然而，建议每样品进样运行时间为30分钟左右。否则，杂质峰将可能残留在下一次运行中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. PM7中3-NT含量的色谱图分析与定量
<ol>
	<li>检查色谱图中的 3-NT 峰并计算其含量。
	<ol>
		<li>数据采集完成后，使用分析软件打开色谱图数据文件。</li>
		<li>从平坦的基线处画一条线穿过 3-NT 峰，并从所画的线读取峰高。 
		注意：定量限约为 5 nM（25 µL 进样量中为 125 fmol）。 
		警告：ECD 中的电极会缓慢耗尽，由于信噪比（S/N）下降，检测限将升高。</li>
		<li>根据 3-NT 标准品的峰绘制回归线，计算斜率和截距。</li>
		<li>将这些常数代入以下方程，计算样品中的 3-NT 含量： 
		样品 3-NT (nM) = [样品峰高 – 截距] / 斜率          公式 (1) 
		注意：标准曲线在 5 nM 至 500 nM 范围内应良好地呈现为一条直线。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算样品瓶中空气环境及 PM7 中的 3-NT 含量。
	<ol>
		<li>将 3-NT 浓度乘以反应体积（如有稀释，还需乘以稀释因子），评估圆片区内 PM7 中的绝对 3-NT 含量。</li>
		<li>测量滤膜采集区域面积，并通过以下公式计算整个 PM7 滤膜上的 3-NT 含量： 
		总 PM7 = [圆片区 PM7 中的 3-NT 含量] × [PM7 滤膜面积与圆片区面积之比] × 226.19（在将摩尔数转换为克数的情况下）              公式 (2)</li>
		<li>通过将总 PM7 含量除以总空气流量体积或 PM7 质量（记录于步骤 1.1.3 中），评估空气环境或 PM7 中的 3-NT 含量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Castillo, J. A., Staton, S. J. R., Taylor, T. J., Herckes, P., Hayes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+feasibility+of+bioaerosol+analysis+as+a+novel+fingerprinting+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Exploring the feasibility of bioaerosol analysis as a novel fingerprinting technique.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (1), 15-26 (2012).</li>
<li>Franze, T., Weller, M. G., Niessner, R., Pöschl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+nitration+by+polluted+air%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Protein nitration by polluted air.</a> Environmental Science & Technology. 39 (6), 1673-1678 (2005).</li>
<li>Abe, R. Y., Akutsu, Y., Kagemoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+amino+acids+as+markers+for+biological+sources+in+urban+aerosols%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Protein amino acids as markers for biological sources in urban aerosols.</a> Environmental Chemistry Letters. 14 (1), 155-161 (2016).</li>
<li>D'Amato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergenic+pollen+and+pollen+allergy+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%3A+European+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Allergenic pollen and pollen allergy in Europe.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 62 (9), 976-990 (2007).</li>
<li>Bolzacchini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-phase+reaction+of+phenol+with+NO3%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Gas-phase reaction of phenol with NO3.</a> Environmental Science & Technology. 35 (9), 1791-1797 (2001).</li>
<li>Shiraiwa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphase+chemical+kinetics+of+the+nitration+of+aerosolized+protein+by+ozone+and+nitrogen+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Multiphase chemical kinetics of the nitration of aerosolized protein by ozone and nitrogen dioxide.</a> Environmental Science & Technology. 46 (12), 6672-6680 (2012).</li>
<li>Gruijthuijsen, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitration+enhances+the+allergenic+potential+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22International+Archives+of+Allergy+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Nitration enhances the allergenic potential of proteins.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 141 (3), 265-275 (2006).</li>
<li>Kubo, M., Ogino, K. Analytical Procedures for Nitrative/Nitrosative Stress. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKubo%2C+M+%22Studies+on+Pediatric+Disorders%22">Studies on Pediatric Disorders</a>. Tsukahara, H., Kaneko, K. , Humana Press. 149-158 (2014).</li>
<li>Thomson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-nitrotyrosine+modified+proteins+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Markers%22%5BJournal%5D)">3-nitrotyrosine modified proteins in atherosclerosis.</a> Disease Markers. 2015, 708282(2015).</li>
<li>Kuhn, D. M., Sakowski, S. A., Sadidi, M., Geddes, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrotyrosine+as+a+marker+for+peroxynitrite-induced+neurotoxicity%3A+the+beginning+or+the+end+of+the+end+of+dopamine+neurons%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Nitrotyrosine as a marker for peroxynitrite-induced neurotoxicity: the beginning or the end of the end of dopamine neurons?</a> Journal of Neurochemistry. 89 (3), 529-536 (2004).</li>
<li>Teixeira, D., Fernandes, R., Prudêncio, C., Vieira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Nitrotyrosine+quantification+methods%3A+Current+concepts+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">3-Nitrotyrosine quantification methods: Current concepts and future challenges.</a> Biochimie. 125, 1-11 (2016).</li>
<li>Hitomi, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disposition+of+protein-bound+3-nitrotyrosine+in+rat+plasma+analysed+by+a+novel+protocol+for+HPLC-ECD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Disposition of protein-bound 3-nitrotyrosine in rat plasma analysed by a novel protocol for HPLC-ECD.</a> Journal of Biochemistry. 141 (4), 495-502 (2007).</li>
<li>Ogino, K., Wang, D. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+of+oxidative%2Fnitrosative+stress%3A+an+approach+to+disease+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Medica+Okayama%22%5BJournal%5D)">Biomarkers of oxidative/nitrosative stress: an approach to disease prevention.</a> Acta Medica Okayama. 61 (4), 181-189 (2007).</li>
<li>Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. -T., Gutzki, F. -M., Stichtenoth, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+3-nitrotyrosine+in+human+urine+at+the+basal+state+by+gas+chromatography-tandem+mass+spectrometry+and+evaluation+of+the+excretion+after+oral+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+B%2C+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 827 (1), 146-156 (2005).</li>
<li>Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+particulate+matter+and+ozone+with+3-nitrotyrosine+in+the+atmosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Relationship of particulate matter and ozone with 3-nitrotyrosine in the atmosphere.</a> Environmental Pollution. 236, 948-952 (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种定量方法，用于评估使用高灵敏度高效液相色谱-电化学检测（HPLC-ECD）技术在石英滤膜上采集的大气颗粒物中的3-硝基酪氨酸（3-NT）。
总体而言，3-硝基酪氨酸（3-NT）的检测方法已被开发作为人类疾病中氧化应激的生物标志物。基于抗体的检测方法（例如，酶联免疫吸附测定）通常被视为半定量方法，因为缺乏严格的检测验证，且难以评估其可靠性。高效液相色谱结合电化学检测（ECD）以及基于质谱的检测方法对3-NT的定量具有足够的灵敏度13。尽管质谱方法（如GC-MS或GC-MS/MS）灵敏度较高，但其需要对氨基酸进行衍生化处理，而衍生化过程常会导致人工产物的形成14。
与气相色谱法（GC）和液相色谱法（LC）相比，高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ECD）成本相对较低，且具有足够的灵敏度来检测3-硝基酪氨酸（3-NT）。此外，气相色谱-质谱法（GC-MS）和液相色谱-质谱法（LC-MS）中的衍生化步骤通常需要额外的时间。&#160;尽管本文所述方法的蛋白质消化步骤需要16小时，但仍可过夜进行（如上所述，每个样品仅需约30分钟的手动操作时间）。使用自动进样器进行重复自动检测，可实现高通量的检测系统。以往研究曾报道采用免疫学方法检测细颗粒物（PM2,7）中的3-NT；然而，由于冬季细颗粒物中3-NT水平较低，这些方法无法在冬季检测到3-NT（PM15）。
与其它标准方法相比，HPLC-ECD 方法具有额外的优势；例如，(i) 该方法无需提取过程，(ii) 完全&#160;不含去垢剂，(iii) 对样品需求量极小，且重要的是，(iv) 具有高灵敏度。收集在滤膜上的颗粒物通常通过超声处理进行分离，以便进一步分析，包括对多种组分的定量。此外，也常使用去垢剂从滤膜上分离与颗粒物结合的蛋白质。然而，这些额外步骤会增加污染、样品损失以及因提取效率不足导致结果低估的风险，而且大多数去垢剂与液相色谱-质谱联用技术（LC/MS）不兼容。在本 HPLC-ECD 方法中，HPLC 样品可通过简单的空心打孔器直接从滤膜上分离，无需额外的样品前处理过程。圆形样品的面积为 28.3 mm2，与原始石英滤膜的尺寸（8 × 10 英寸 = 203.2 × 254 mm = 51,600 mm2）相比非常小。
高效液相色谱-电化学检测（HPLC-ECD）条件已经过仔细优化，以避免对3-硝基酪氨酸（3-NT）信号产生干扰，如先前所述12。&#160;流动相需保持较强的酸性pH，并含有适当浓度的乙腈，这对检测至关重要。在这些条件下，其他化合物（包括硝基碱基）可与硝基酪氨酸实现分离。当前条件适用于从具有不同物理性质的样品（例如，颗粒物和血浆）中检测3-NT。
为评估空气中的3-硝基酪氨酸（3-NT），滤膜称重及背景干扰的消除是关键步骤。通常，在四到七天内可收集到约100 mg以上的PM7颗粒物；然而，多个因素会影响PM7采集前后滤膜的重量，包括湿度和静电荷。为避免这些影响，必须在温度和湿度相对恒定的条件下，对滤膜进行长时间的重量稳定处理。电子天平的安装位置应保持稳定的环境条件。在样品制备过程中，需校正非特异性蛋白酶混合物和超滤膜带来的背景干扰，因为这些物质常会产生与3-NT相似的色谱峰。
该方法可应用于其他颗粒物，包括室内环境中的颗粒物。蛋白质的硝化作用可能会增加其致敏性2。因此，该方法可能有助于评估环境清洁度并预防亚硝化应激。
本研究报道了一种高灵敏度的大气3-硝基酪氨酸（3-NT）检测方法，该方法使用操作简便且成本低廉的设备对空气采样滤膜进行测定。大气中3-NT的生成与臭氧（O3）、二氧化氮（NO2）、颗粒物（PM）中的蛋白质等环境污染物以及影响人体过敏反应的气象因素密切相关。综上所述，本研究所建立的方法有助于评估在不同气象条件下，大气中O3、多种污染物及颗粒物蛋白质之间的化学反应。通过发展高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ECD）用于大气中3-硝基酪氨酸的定量分析，我们期望能够促进环境质量的改善，进而提升人类健康水平。

气溶胶或空气中的颗粒物（PM）含有来自多种生物来源的蛋白质，包括病毒、原核生物、真菌、植物（花粉）以及动物（昆虫、人类）1。&#160;颗粒物中蛋白质含量的比例估计接近5%，被认为在空气中作为过敏原发挥重要作用2。最近的研究报告表明，不同粒径的城市环境气溶胶中含有氨基酸，其比例范围在0.5%至2%之间3。此外，有研究提出，颗粒物中的蛋白质可能通过与臭氧（O3）、二氧化氮（NO2）和二氧化硫（SO2）等各类污染物发生反应而产生化学修饰4。
3-硝基酪氨酸（3-NT）是一种蛋白质修饰，由酪氨酸残基的硝化反应生成。&#160;研究表明，在拟大气环境中，较高浓度的O3和NO2可促进蛋白质分子的硝化5,6。&#160;多肽链中酪氨酸残基的硝化会增强花粉蛋白的致敏潜能7。因此，对空气中3-NT的定量与评估是解决环境健康问题的重要环节。
3-NT 还被称为氧化应激和亚硝化应激的生物标志物8。&#160;越来越多的证据表明，3-NT 含量与多种人类疾病存在显著关联9,10。&#160;由于其有害效应，检测和定量生物样本中的 3-NT 对评估个体健康状况具有重要意义。近年来，已提出多种用于测定 3-NT 含量的方法，包括酶联免疫吸附测定法、高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱-质谱联用法（LC/MS）11。在先前的研究中，我们报道了一种采用高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ECD）的检测方法，该方法相较于以往方法具有多项优势。例如，HPLC-ECD 无需提取或衍生化步骤，因此是一种相对简单的分析体系12。我们已证实该方法适用于检测生物样本（人和大鼠血浆）中的 3-NT。
尽管许多研究都强调了在生物样品中检测3-硝基酪氨酸（3-NT）的重要性，但其在非生物样品中的检测仍不明确，因此本研究得以开展。事实上，为了评估气载3-NT的有害影响，需要一种能够直接从空气颗粒物中定量检测3-NT的方法；因此，我们采用了现有的高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ECD），用于检测采集在玻璃纤维滤膜上的PM2.5中的3-NT。&#160;利用该技术，可直接从小块样品（直径6 mm的圆形孔）中检测到PM采集滤膜上的3-NT。我们进一步评估了不同粒径PM中3-NT的含量，并测定了3-NT的检测限。本文提出了一种高灵敏度、高通量的方法，可用于直接从非生物和生物样品中检测3-NT。

<table><tbody><tr><td>石英滤膜，备用石英滤膜</td><td>PALL life sciences</td><td>7204</td><td>Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10英寸</td></tr><tr><td>大流量空气采样器</td><td>SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td><td>HV-1000F</td><td></td></tr><tr><td>SPM颗粒物粒径选择器</td><td>SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td><td>080130-061</td><td>在日本，SPM（悬浮颗粒物）定义为切割直径为10 µm时去除效率达100%的颗粒物。&amp;nbsp; SPM与PM7基本相同。</td></tr><tr><td>低流量空气采样器</td><td>SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td><td>AH-600F</td><td></td></tr><tr><td>PM2.5粒径分级单元</td><td>SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td><td>AH-600</td><td></td></tr><tr><td>用于粒径分级的石英滤膜（PM4.5&amp;ndash;2.5、PM7.3&amp;ndash;4.5、PM15&amp;ndash;7.3，以及TSP-PM15）</td><td>Tokyo Dylec</td><td>AHQ-630</td><td></td></tr><tr><td>非特异性蛋白酶混合物</td><td>Roche</td><td>11459643001</td><td>来自灰色链霉菌（Streptomyces griseus）的蛋白酶（Pronase）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>3-硝基酪氨酸</td><td>SIGMA</td><td>N7389</td><td></td></tr><tr><td>超滤膜</td><td>Millipore</td><td>UFC5010BK</td><td>AMICON ULTRA 0.5 mL - 10 kDa截留分子量</td></tr><tr><td>电化学检测器（ECD）</td><td>Eicom</td><td>HTEC-500, PEC-510</td><td>独立式高效液相色谱-电化学检测系统（HTEC-510）和前置电解池（PEC-510），包含泵</td></tr><tr><td>高效液相色谱柱</td><td>Eicom</td><td>SC-5ODS</td><td></td></tr><tr><td>数据处理器</td><td>Eicom</td><td>EPC-300</td><td></td></tr><tr><td>进样器</td><td>Hitachi High-Tech Science&amp;nbsp;</td><td>L-7200</td><td>自动进样器</td></tr><tr><td>分析软件</td><td>eDAQ Japan</td><td>ES280&amp;nbsp;</td><td>PowerChrom软件</td></tr></tbody></table>

大气环境中3-硝基酪氨酸的检测 通过 高效液相色谱-电化学检测系统

Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System

3-硝基酪氨酸（3-NT）是大气生物气溶胶蛋白质中的酪氨酸残基与臭氧（O3）和二氧化氮（NO2）反应生成的产物。via 该反应生成的稳定型3-NT是氧化损伤的特异性标志物，据报告具有促进过敏反应的作用。在本研究中，我们报道了一种高灵敏度检测方法的建立，用于定量城市环境空气中采集的空气采样滤膜上的3-NT，所采集的颗粒物包括生物气溶胶，且空气动力学直径&#60; 2.5 µm（PM2.5）。该方法从空气采样器滤膜上切取直径为6 mm的圆形滤片，加入非特异性蛋白酶混合液以水解蛋白质。将蛋白质样品完全消化至氨基酸水平后，采用高效液相色谱-电化学检测器（HPLC-ECD）检测其中的3-NT含量。检测结果显示，最大3-NT含量出现在粒径为4.5至7.3 μm颗粒物的前置滤膜中，检测限为1.13 pg/m3。

HPLC-ECD 的原理很简单。含有目标物的样品通过 HPLC 柱和流动相进行分离，分离后的目标化合物在电化学检测器中发生还原和/或氧化反应。
在HPLC-ECD系统中，3-NT峰的出峰时间约为22分钟。ECD（PEC-510和HTEC-500）以串联方式连接在HPLC管路中。第一个ECD将化合物中的羟基还原，随后的ECD将还原后的化学物质氧化。ECD的检测灵敏度范围极高，可达10-15 M。HPLC-ECD系统的检测限为1.13 pg/m3，该值是根据10个部分×3的基线信号平均值（mV）计算得出。
典型的色谱图如图4所示。通过分析纯的3-NT标准品，可检测到一个具有稳定基线的明确峰（图4A）。PM7中的3-NT也使用直径为6 mm的圆形样品进行了测定（图4B）。
关于3-硝基酪氨酸（3-NT）检测能力的准确性，当注入3-NT标准品进行高效液相色谱分析时，对应于3-NT的色谱峰在20分钟的保留时间被检测到。在PM样品中，3-NT与其他物质实现分离，并在与标准品相同的保留时间处检测到独立的色谱峰。典型的标准曲线如图5所示，在5至40 nM范围内呈现良好的线性关系。线性范围可延伸至500 nM（数据未显示）。
表1显示了大气中3-NT的含量，以pg/m3空气计。在#3（PM7.3-4.5）的PM2.5预滤膜中观察到最高浓度的3-NT。
<img alt="空气采样滤膜示意图：总悬浮颗粒物滤膜（TSP）、粒径选择器、前置滤膜和备用滤膜。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：TSP、PM7 和 PM2.5 的采集方案。（A）总悬浮颗粒物（TSP）直接采集到采集滤膜上（采样流速为 1,000 L/min）。（B）采集 PM7 时，大颗粒物被粒径选择器截留（采样流速为 1,000 L/min）。（C）PM2.5 通过四个前置滤膜进行采集（采样流速为 116 L/min）。石英滤膜通常用作 PM7 和 PM2.5 的备用滤膜，或用作 TSP 的采集滤膜，如本图所示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="光谱样品转移示意图、光谱分析、吸收测量过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：制备直径为 6 mm 的圆形样品。 使用直径为 6 mm 的空心打孔工具切割采集滤膜，然后将样品储存于 1.5 mL 微量离心管中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="HPLC 系统示意图；色谱装置；氧化还原反应；数据分析；色谱柱泵送过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：HPLC-ECD 系统的示意图。 注入样品中的 3-NT 在流动相流经的 HPLC 色谱柱中实现分离。3-NT 在检测器中先被还原为氨基酪氨酸，再氧化为亚氨基酪氨酸，并通过电化学方法进行检测。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="色谱图、峰分析、保留时间（分钟）、示意图、分离效率比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：HPLC-ECD 系统中的典型色谱图。 （A）通过 HPLC-ECD 系统分析的纯 3-NT。（B）用于检测 3-NT 的 PM7 滤膜上 6 mm 圆形样品。箭头指示 3-NT 峰的位置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="校准曲线，峰高 vs. 3-NT 标准品，nM，带线性回归，R²=0.9946，图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：纯 3-NT 样品的标准曲线。 较低浓度下的结果在另一张图中显示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">主题</td>
			<td>天数 
			样本采集</td>
			<td>斑点</td>
			<td>3-NT 
			(pg/mL3 空气</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM2.5</td>
			<td>预滤器 #1</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>8.25 ± 0.37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>预滤器 #2</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>29.66 ± 1.94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>预滤器 #3</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>74.37 ± 4.09</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>预滤器 #4</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>32.70 ± 0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>背滤</td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
			<td>4.21 ± 0.91</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM7</td>
			<td>反向过滤</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>89.16 ± 6.36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSP</td>
			<td>过滤</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>10.34 ± 2.09</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：通过HPLC-ECD系统测定的大气中3-NT含量。 使用HPLC-ECD系统测定各滤膜上的6 mm圆形斑点。预滤膜#1 - #4在相同时间段内采集。需注意，空气中3-NT的浓度受多种因素影响，如采样日期、年份或采样地点。数据（n = 3 - 10）以均值 ± 标准误差表示。

我们介绍一种利用高效液相色谱-电化学检测器（HPLC-ECD）检测大气蛋白质中3-硝基酪氨酸化学修饰的方法，样品采用空气采样器预滤膜上切割的直径为6 mm的圆片。

3-硝基酪氨酸（3-NT）是大气生物气溶胶蛋白质中的酪氨酸残基与臭氧（O₃）和二氧化氮发生反应后生成的产物……

该方法有助于解答环境研究中关于硝化抑制剂Nitrapyrin和3-硝基酪氨酸的关键问题。该技术的主要优势在于，它是一种独特且高度敏感的方法，可用于检测空气样品滤膜上的3-硝基酪氨酸。为采集总悬浮颗粒物或粒径小于7微米的颗粒物，首先称量一张Binder 3型石英滤膜，并将其固定在大流量空气采样器上。在滤膜上覆盖粒径选择器以采集PM7，或不加覆盖以采集总悬浮颗粒物。以每分钟1000升的流速连续运行空气采样器七天。将预过滤器装入粒径分级单元，并将该单元与一张备用滤膜安装至小流量空气采样器上。以每分钟116升的流速连续运行空气采样器七天，以在备用滤膜上采集PM2.5。采样结束后，记录总流量体积。称量滤膜并计算所收集颗粒物的质量。将滤膜密封于塑料袋中，并在30摄氏度下保存。接下来，准备500微升含6倍非特异性蛋白酶混合液的醋酸盐缓冲液，并将其置于截留分子量为5000道尔顿的透析膜中。将装有溶液的透析膜浸入1升醋酸盐缓冲液中，在4摄氏度下搅拌24至36小时，每12小时更换一次缓冲液，以去除内源性3-硝基酪氨酸和亚硝酸盐。随后，使用二辛可宁酸（BCA）蛋白定量法测定透析后蛋白酶溶液中的蛋白浓度。之后，从冰箱中取出一张滤膜，在保持密封状态下使其升至室温。从滤膜上覆盖有颗粒物的区域打取最多五个直径6毫米的圆片，并将这些圆片放入一个1.5毫升的微量离心管中。准备300微升含有50

detection-3-nitrotyrosine-atmospheric-environments-via-high

Research

科研

JoVE Journal

Environment

环境

利用高效液相色谱-电化学检测仪检测大气环境中的 3-硝基酪氨酸

采用电子顺磁共振（EPR）波谱法，分别利用二价铁-Ｎ-甲基-Ｄ-葡糖胺二硫代氨基甲酸复合物 Fe(MGD)2 和 5,5-二甲基-1-吡咯啉-Ｎ-氧化物...

使用自旋捕获剂通过电子顺磁共振波谱法检测细胞中的一氧化氮和超氧阴离子自由基

关键词：电子顺磁共振波谱法，自旋捕获，一氧化氮，超氧阴离子，自由基，细胞氧化应激

采用程序升温脱附系统联用带有电子捕获检测器的气相色谱仪，对吸附在填充吸附剂的热脱附管上的TNT和RDX痕量爆炸物蒸气进行分析。该仪器分析方法结合直接液体沉积法，以降低样品变异性，并校正仪器漂移和样品损失。...

程序化升温脱附气相色谱-电子捕获检测器定量检测痕量爆炸物蒸气

先前的研究表明，大气氮氧化物的氮同位素组成可能用于区分环境中不同来源的影响。本文报道了一种自动化、可移动、基于野外的高效率收集大气NOx的方法，可用于每小时时间分辨率下的氮同位素分析。...

用于NOx氮同位素分析的自动化高分辨率移动采集系统

建立了一种高通量的液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS），该方法选择性强、灵敏度高，并结合高效的混合模式阳离子交换（MCX）96孔微孔板固相萃取技术，用于测定人尿液中游离的3-硝基酪氨酸（3-NT），适用于临床应用。...

用于临床应用的人尿中3-硝基酪氨酸的微型固相萃取与液相色谱-串联质谱检测整合方法

细胞色素P450对致癌性亚硝胺的α-羟基化是公认的代谢途径，可产生导致DNA损伤并引发突变的中间产物。然而，新数据表明可进一步氧化生成亚硝酰胺。本文描述了一种检测由亚硝胺生成的亚硝酰胺的通用方法 体外 细胞色素P450催化的亚硝胺代谢...

一种检测亚硝基酰胺形成的通用方法 体外 细胞色素P450对亚硝胺的代谢

酪氨酸硝化蛋白的蛋白质组学分析一直是一项具有挑战性的技术，原因是3-硝基酪氨酸修饰的丰度极低。本文以血管紧张素II为模型，介绍一种新型的硝基肽段富集与分析方法。该方法可推广应用于其他 体外 或 体内...

硝基肽的分析与鉴定：以血管紧张素II为例

本文介绍了利用基于化学发光的高灵敏度检测方法来检测一氧化氮及其生物学相关衍生物的实验方案。...

基于化学发光的检测方法用于检测一氧化氮及其自氧化和亚硝化化合物衍生物

发电厂烟气是一种廉价的CO2 藻类生长的来源。我们已构建了原型 "烟气用于藻类培养" 系统，并描述了如何放大藻类培养过程。我们展示了利用传质生物反应模型来模拟和设计烟气最优操作条件以促进藻类生长的方法。 小球藻 藻类光生物反应器中的sp.

通过计算机模拟优化烟气参数以促进光生物反应器中微藻的生长

本研究的总体目标是展示在零售熟食店环境中食源性致病菌Listeria...

使用荧光粉末追踪零售环境中的微生物污染——以零售熟食店环境为例

本文介绍了一种用于设计和构建与小型气候可控风洞相连的土壤槽的方案，以研究大气强迫对蒸发作用的影响。该土壤槽和风洞均配备了传感器技术，可对环境条件进行连续的原位（in...

探究大气强迫对蒸发的影响：大气边界层与浅层地下环境的实验整合

了解利用高效液相色谱-电化学检测仪检测大气环境中3-硝基酪氨酸的高灵敏度方法。该技术通过空气采样器预滤膜收集样本，为环境研究人员评估空气质量对健康的影响提供可靠工具。

大气环境中3-硝基酪氨酸的检测通过高效液相色谱-电化学检测系统

探索更多视频

大气环境中3-硝基酪氨酸的检测 通过 高效液相色谱-电化学检测系统

探索更多视频

大气环境中3-硝基酪氨酸的检测通过高效液相色谱-电化学检测系统