Name: 生理活性类囊体的分离及其在能量依赖性蛋白转运检测中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 学习从豌豆幼苗中高效分离具有生理活性的类囊体，并检测能量依赖性蛋白质转运机制。该方法可精确控制温度、pH和离子条件，为研究叶绿体蛋白定位提供可靠方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本手稿由美国能源部基础能源科学办公室化学科学、地球科学和生物科学司资助，项目编号为 DE-SC0017035

1. 初始材料
<ol>
	<li>将约55 g豌豆在400 mL蒸馏水中浸泡3小时，然后播种于塑料托盘（35 cm × 20 cm × 6 cm）的土壤中，并用一层薄蛭石覆盖。</li>
	<li>在20 °C、12/12小时光照/黑暗（50 µE/m²/s）条件下培养豌豆托盘2s）循环持续9至15天。</li>
	<li>根据首选方法制备蛋白质底物。 
	注意：我们已采用多种方法制备蛋白质底物，包括 1） 体外 使用小麦胚芽提取物或兔网织红细胞裂解物进行体外转录翻译，反应体系中加入[3H]-亮氨酸或[35S]-甲硫氨酸，2） 体外 使用偶联的转录/翻译试剂盒（如Promega的TnT试剂盒）进行翻译，并按上述方法进行放射性标记，以及3) 过表达蛋白的纯化 E. coli放射性 体外 翻译产物通常在用于转运反应前，用50 mM冷氨基酸淬灭。这些方法通常需要针对每种新的蛋白质底物进行一定的优化。有关偶联反应的示例 体外 系统，参见 Ling 和 Jarvis（2016）9.</li>
</ol>
2. 叶绿体的分离与定量
注意：制备类囊体的第一步是分离完整的叶绿体10。所有材料在制备过程中应保持低温。重悬叶绿体时应轻柔操作，因为此步骤中叶绿体的破裂会严重降低后续类囊体的得率。
<ol>
	<li>提前准备好以下溶液。
	<ol>
		<li>2倍研磨缓冲液（2xGB）：100 mM K-HEPES（pH 7.3），660 mM 山梨醇，2 mM MgCl2，2 mM MnCl2，4 mM EDTA，0.2% BSA。</li>
		<li>2倍导入缓冲液（2xIB）：100 mM K-Tricine 或 K-HEPES（pH 8.0），660 mM 山梨醇，8 mM MgCl2。 
		注意：MgCl2 浓度在 3 mM 至 10 mM 范围内使用时未观察到明显差异。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 15 mL Percoll 与 15 mL 2xGB 混合，在固定角转子中于 4 °C 以 30,900 g 离心 30 分钟（关闭刹车），制备连续密度梯度。</li>
	<li>收获约 25 g 生长 9 至 15 天的豌豆，加入 95 mL 1xGB 中匀浆。可使用刀片锋利的搅拌器或 Polytron 匀浆器，两者均已被成功应用。将匀浆液通过漏斗中的至少两层 Miracloth 滤布过滤。 
	注意：无需严格限制茎组织的量，但减少茎组织可能使匀浆过程更顺利，从而减少因长时间搅拌导致的叶绿体破裂。</li>
	<li>在 4 °C 下，于水平转子中以 3,000 g 离心 5 分钟，弃上清，轻轻将沉淀重悬于 1 mL 1xGB 中。使用画笔可能是最温和的重悬方法。</li>
	<li>小心地将绿色悬液铺在 Percoll 梯度上方，在水平转子中于 4 °C 以 8,000 g 离心 10 分钟（关闭刹车）。</li>
	<li>小心收集含有完整叶绿体的下层绿色条带至新离心管中。将回收的完整叶绿体在水平转子中于 4 °C 以 1,800 g 离心 5 分钟，弃上清，轻轻将沉淀重悬于 1xIB 中。重复洗涤一次，每次用 30 mL 1xIB 重悬，最后一次重悬于 1 mL 1xIB 中。</li>
	<li>为定量叶绿素（Chl）含量，取 10 µL 充分重悬的叶绿体与 5 mL 80% 丙酮混合，通过 Whatman 1 滤纸（标称厚度 180 µm）过滤。使用分光光度计测定 720 nm、663 nm 和 645 nm 处的吸光度，并使用以下公式11计算叶绿素浓度： 
	[Chl] mg/mL = [40.2*(A663 – A720) + 101.4*(A645 – A720)]*0.1</li>
	<li>用 1xIB 将叶绿体调整至叶绿素浓度为 1 mg/mL。</li>
</ol>
3. 类囊体的分离
注意：类囊体通过低渗裂解完整的叶绿体来制备。该过程通过将叶绿体暴露于不含山梨醇的低渗缓冲液中实现。分离的类囊体可用于检测任何一种转运途径，但如果需要研究cpSec1或cpSRP途径，则必须在此制备过程中同时分离基质提取物（SE）。
<ol>
	<li>提前准备好以下溶液。
	<ol>
		<li>低渗裂解缓冲液：50 mM K-Tricine 或 K-HEPES，pH 8.0，8 mM MgCl2。</li>
		<li>2× 粗制基质缓冲液（用于 SE 浓缩）：100 mM K-HEPES，pH 8.0，660 mM 山梨醇，8 mM MgCl2。</li>
		<li>Laemmli 上样缓冲液（用于 SDS-PAGE，含 EDTA）：125 mM Tris，pH 6.8，10% SDS，20% 甘油，0.05 mg/mL 溴酚蓝，10% β-巯基乙醇，10 mM EDTA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若无需回收类囊体腔内容物（SE），则将完整叶绿体在 4 °C 下以 1,000 g 转速于摆桶转子中离心 6 分钟。
	<ol>
		<li>弃去上清液，用低渗裂解缓冲液重悬至浓度为 1 mg/mL。冰上避光孵育 10 分钟，期间偶尔混匀。</li>
		<li>在 4 °C 下以 3,200 g 转速于摆桶转子中离心 8 分钟，收集类囊体膜。用裂解缓冲液每次 1 至 2 mL 洗涤类囊体膜两次，每次均重悬。最后用 1 mL 的 1×IB 重悬，并按照叶绿体分离方案中的方法重新测定叶绿素含量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 间质提取物的回收与浓缩
<ol>
	<li>如果需要回收可溶性基质组分（SE），将完整的叶绿体分装至1.5 mL微量离心管中，每管600 µL，于4 °C下以1,000 g转速在摆桶转子中离心6分钟。 
	注意：使用1.5 mL微量离心管时，此体积较为方便，有助于防止最终沉淀物中的残余膜结构受到扰动。
	<ol>
		<li>用低渗裂解缓冲液将沉淀重悬至叶绿素浓度为1 mg/mL，并如步骤3.2.1所述，在冰上避光孵育10分钟。</li>
		<li>于4 °C下以3,200 × g转速在摆桶转子中离心8分钟，收集叶绿体裂解后呈浅绿色或黄色的上清液，与等体积的2×粗制基质缓冲液混合后转移至新的微量离心管中。</li>
		<li>用两倍体积的裂解缓冲液（约0.5 mg/mL）洗涤类囊体，并于4 °C下以3,200 g转速在摆桶转子中离心8分钟收集沉淀。将沉淀用1×IB缓冲液在冰上重悬至叶绿素浓度为1 mg/mL。</li>
		<li>将粗制基质在4 °C下以42,000 g转速在固定角转子中离心30分钟，以去除残余膜成分。可通过外膜和内膜蛋白的免疫印迹分析验证上清液的纯度。</li>
		<li>从每管中收集95%的上清液体积，注意不要扰动底部少量黄绿色沉淀。记录每管中取出的体积。</li>
		<li>为制备浓缩的可溶性基质提取物（SE），合并所收集的上清液，并使用4 mL、截留分子量为30 kDa的浓缩装置将其浓缩五倍。 
		注意：以此方法制备的SE相当于由叶绿素浓度为2.5 mg/mL的叶绿体制备的基质。如有需要，SE可进一步浓缩十倍至相当于5 mg/mL叶绿素浓度。SE呈金黄色且具有黏性。在实验室的Legend RT离心机配摆桶转子条件下，每毫升浓缩样品约需10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 通过 cpTat 途径的转运
注意：与cpSec1或cpSRP不同，cpTat途径不需要可溶性组分或外源添加的能量来源；仅需光驱动的质子动力势3。因此，该检测仅需分离的类囊体和底物蛋白。典型的底物是放氧复合物的17 kDa（如图1所示）和23 kDa亚基的中间形式，分别为iOE17和iOE23，但前体形式prOE17和prOE23也可成功转运。前体形式含有完整的双相N端靶向序列，而中间形式仅含有类囊体靶向序列。
<ol>
	<li>在冰上配制cpTat转运反应混合液，包含0.33 mg/mL叶绿体类囊体、由1xIB缓冲液配制的5 mM ATP，以及由1xIB缓冲液配制的8 mM二硫苏糖醇（DTT）。若反应在光照条件下进行，则ATP并非严格必需。</li>
	<li>通过在运输混合物中加入体积比为1:30的底物蛋白来启动运输。如果底物蛋白未用1xIB缓冲液配制，应先用2xIB缓冲液进行1:1稀释，然后再按1:30比例使用&#160; 运输混合液中稀释底物的体积比。 
	注意：底物的浓度将根据制备方法的不同而有所变化。通常情况下， 体外 制备样品可获得纳摩尔至微摩尔浓度的产物，而过表达则可获得微摩尔至毫摩尔浓度的产物。还需考虑检测方法，因为放射自显影和荧光自显影比免疫印迹更灵敏。</li>
	<li>在80 - 100 µE/m的光照下孵育悬浮液2在室温下对光合有效辐射（PAR）暴露10分钟。如需测定运输动力学，需先将类囊体和反应混合物均预平衡至室温，然后照射最多30分钟。</li>
	<li>用预冷的1xIB缓冲液将反应体系稀释8倍以终止转运反应，随后在3,200 ×g下离心回收类囊体 g 在4 °C下，以微量离心机离心5分钟。</li>
	<li>去除未转运的残留底物，将类囊体沉淀重悬于120 µL 1xIB中，加入6 µL 2 mg/mL嗜热菌蛋白酶和10 mM CaCl₂，消化外部蛋白2 在1xIB中。</li>
	<li>将蛋白酶反应在冰上孵育 40 分钟，然后加入等体积的 1xIB 中配制的 25 mM EDTA 终止蛋白酶反应。</li>
	<li>通过在 3,200 × g 条件下离心回收类囊体 g 在4 °C下以微量离心机离心5分钟。用120 μL含5 mM EDTA的1xIB缓冲液洗涤回收的类囊体，并转移至新管中。</li>
	<li>3,200 离心 g 在4 °C下以微量离心机离心5分钟。用适量含有10 mM EDTA的Laemmli上样缓冲液重悬沉淀。通常40 µL的体积足以在SDS-PAGE凝胶上检测底物，并可在需要时保留样品用于重复电泳。</li>
	<li>将样品置于沸水浴中10分钟，随后进行SDS-PAGE分析。放射自显影、荧光自显影或对非天然状态或表位标签蛋白的Western印迹已成功用于检测转运蛋白。</li>
</ol>
6. 通过 cpSec1 途径的转运
注意：通过cpSec1易位子的转运需要基质蛋白cpSecA112,13，该蛋白可通过在E. coli14,15中过表达获得，或在类囊体分离过程中通过浓缩基质回收。典型的底物是放氧复合体的33 kDa亚基（prOE33），如图2所示。
<ol>
	<li>在冰上配制cpSec1转运反应混合液，包含0.33 mg/mL叶绿素的类囊体、0.83 mg/mL叶绿素当量的SE或1.5 μg重组cpSecA1蛋白，以及5 mM ATP，孵育10分钟。由于添加了SE，典型的转运反应体系体积由此前的60 μL增加至72 μL。
	<ol>
		<li>若使用重组cpSecA1代替SE，则用等体积的2xIB缓冲液调整纯化的cpSecA1，并稀释至适宜浓度后加入转运反应体系中（例如， 0.75 µg/µL 
		注意：由于冷冻会消除活性，因此纯化后的cpSecA1需在受控的冷藏室内冰上保存，以用于长期储存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过向运输混合物中加入体积比为1:10的底物蛋白来启动运输。如果底物蛋白未用1xIB缓冲液配制，则先用2xIB缓冲液进行1:1稀释，再将稀释后的蛋白以1:10的体积比加入运输混合物中。</li>
	<li>在 80 – 100 µE/m 条件下，室温孵育反应 10 分钟2s PAR。对于动力学研究或某些底物，可能需要更长的时间。</li>
	<li>光照处理后，用预冷的1xIB缓冲液稀释8倍，并在3200 × g下离心反应物 g 在4 °C下，以微量离心机离心5分钟。</li>
	<li>用嗜热菌蛋白酶处理，并按上述步骤5.5至5.7用EDTA终止反应。</li>
	<li>3,200 离心 g 在4 °C下以微量离心机离心5分钟，将沉淀重悬于适量含有10 mM EDTA的Laemmli样品缓冲液中。在沸水浴中孵育10分钟后，上样至SDS-PAGE凝胶。</li>
</ol>
7. 通过cpSRP途径的插入
注意：图3 中所示的由cpSRP介导的光捕获复合体蛋白（LHCP）整合过程需要cpSRP54、cpSRP43和cpFtsY16。这些组分通过浓缩的基质提取物提供，具体方法如cpSec1转运实验方案所述。
<ol>
	<li>在冰上配制cpSRP转运反应液，其中包含0.33 mg/mL叶绿素等量的类囊体、0.83 mg/mL叶绿素等量的SE以及5 mM ATP，冰上孵育10分钟。</li>
	<li>通过向转运反应液中加入体积比为1:10的底物蛋白来启动转运反应。若底物蛋白未用1xIB缓冲液配制，请先用2xIB缓冲液进行1:1稀释，然后取稀释后蛋白液以1:10体积比加入转运反应液中。</li>
	<li>在室温下，于80–100 µE/m2s PAR光照条件下孵育反应10分钟。</li>
	<li>光照处理后，用预冷的1xIB缓冲液进行8倍稀释，随后在4 °C下以3,200 g离心5分钟（使用微量离心机）。弃去上清液，将沉淀重悬于120 µL的1xIB缓冲液中。</li>
	<li>按前述第5.5至5.7节方法进行嗜热菌蛋白酶（thermolysin）处理。此处进行嗜热菌蛋白酶消化是为评估膜成功整合的情况。用含5 mM EDTA的1xIB缓冲液120 μL洗涤回收的类囊体，并转移至新管中。</li>
	<li>在4 °C下以3,200 g离心5分钟（微量离心机），再次将沉淀重悬于适量体积的含10 mM EDTA的2x Laemmli缓冲液中。在进行SDS-PAGE分析前，将样品置于沸水浴中处理10分钟。 
	注意：成熟LHCP（mLHCP）的整合情况通过出现一个约比未切割的mLHCP小1.5–2 kDa的蛋白酶保护性降解产物（mLHCP-D）来判断17。</li>
</ol>

<ol><li>Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+protein+synthesis%3A+principles+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Sub-cellular+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chloroplast protein synthesis: principles and problems.</a> Sub-cellular biochemistry. 9, 237(1983).</li>
<li>Li, H. -m, Chiu, C. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transport+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Protein transport into chloroplasts.</a> Annual review of plant biology. 61, (2010).</li>
<li>Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-specific+energy+requirements+for+protein+transport+across+or+into+thylakoid+membranes.+Two+lumenal+proteins+are+transported+in+the+absence+of+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).</li>
<li>Skalitzky, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastids+contain+a+second+sec+translocase+system+with+essential+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Plastids contain a second sec translocase system with essential functions.</a> Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).</li>
<li>Dabney-Smith, C., Storm, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDabney-Smith%2C+C+%22Plastid+Biology%22">Plastid Biology</a>. , Springer. 271-289 (2014).</li>
<li>Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+%26%2334%3Bassisted%26%2334%3B+and+%26%2334%3Bspontaneous%26%2334%3B+mechanisms+for+the+insertion+of+polytopic+chlorophyll-binding+proteins+into+the+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct &#34;assisted&#34; and &#34;spontaneous&#34; mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).</li>
<li>Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. hloroP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChloroP%2C+a+neural+network-based+method+for+predicting+chloroplast+transit+peptides+and+their+cleavage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites.</a> Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).</li>
<li>Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locating+proteins+in+the+cell+using+TargetP%2C+SignalP+and+related+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools.</a> Nature protocols. 2 (4), 953(2007).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54717(2016).</li>
<li>Lo, S. M., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLo%2C+SM+%22Photosynthesis+Research+Protocols%22">Photosynthesis Research Protocols</a>. , Springer. 139-157 (2011).</li>
<li>Vernon, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+determination+of+chlorophylls+and+pheophytins+in+plant+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts.</a> Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).</li>
<li>Knott, T. G., Robinson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secA+inhibitor%2C+azide%2C+reversibly+blocks+the+translocation+of+a+subset+of+proteins+across+the+chloroplast+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).</li>
<li>Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SecA+homolog+in+protein+transport+within+chloroplasts%3A+evidence+for+endosymbiont-derived+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting.</a> Science. 266 (5186), 796-798 (1994).</li>
<li>Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+cDNA+for+pea+chloroplast+SecA+Evolutionary+conservation+of+the+bacterial-type+SecA-dependent+protein+transport+within+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts.</a> FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).</li>
<li>Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-assisted+post-translational+transport+of+plastidic+type+I+signal+peptidase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).</li>
<li>Luirink, J., Sinning, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRP-mediated+protein+targeting%3A+structure+and+function+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).</li>
<li>Yuan, J., Henry, R., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+factor+plays+an+essential+role+in+protein+integration+into+thylakoids+that+cannot+be+replaced+by+unfolding+or+by+heat+shock+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Hsp70.+Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein.</a> Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).</li>
<li>Tjalsma, H., van Dijl, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics-based+consensus+prediction+of+protein+retention+in+a+bacterial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane.</a> Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).</li>
<li>Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Facile+Reporter+System+for+the+Experimental+Identification+of+Twin-Arginine+Translocation+%28Tat%29+Signal+Peptides+from+All+Kingdoms+of+Life%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life.</a> Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).</li>
<li>Yuan, J., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastocyanin+and+the+33-kDa+subunit+of+the+oxygen-evolving+complex+are+transported+into+thylakoids+with+similar+requirements+as+predicted+from+pathway+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).</li>
<li>Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transversal+and+lateral+exciton+energy+transfer+in+grana+thylakoids+of+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach.</a> Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).</li>
<li>Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+pool+of+TatA+promotes+Tat-dependent+protein+transport+across+the+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).</li>
<li>Tu, C. -J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+FtsY%2C+chloroplast+signal+recognition+particle%2C+and+GTP+are+required+to+reconstitute+the+soluble+phase+of+light-harvesting+chlorophyll+protein+transport+into+thylakoid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

叶绿体和类囊体的分离
过度破碎可能导致叶绿体分离效果不佳，从而在梯度离心中造成类囊体得率低下。最好轻柔地匀浆收获的组织，确保所有材料在搅拌前均完全浸没，并以15秒为周期间歇脉冲，直至完全匀浆。如有必要，可分多次进行较短时间的匀浆，每次减少组织量。
将所有与收获组织接触的材料进行冷藏，有助于分离的叶绿体在2小时内保持活性。分离后，将叶绿体置于冰上并避光保存也至关重要。
在接触分离的类囊体缓冲液中，必须包含镁离子。否则会导致基粒解堆叠，并严重影响光照下质子动力势的产生21。分离后的类囊体在冰上避光保存时，可用于转运反应长达2小时。
优化转运反应
分离的类囊体沉淀迅速，可能导致不同反应之间的叶绿素含量不均。因此，在使用前必须充分混匀类囊体，尤其是在准备大量样品时更应注意。
<e...

几乎所有负责叶绿体正常功能的蛋白质机器都必须从细胞质中转运而来1。在叶绿体被膜上，蛋白质底物通过外膜转运子（TOC）和内膜转运子（TIC）被导入2。进一步向类囊体膜和腔的靶向运输则通过双精氨酸转运途径（cpTat）3、分泌途径（cpSec1）4、信号识别颗粒途径（cpSRP）5以及自发插入途径完成6。为了测量转运事件的能量学和动力学，理解各途径中多样的转运机制，并将特定的蛋白质底物定位到叶绿体六个不同区室中的任意一个，必须采用一种能够高效分离生理活性叶绿体和类囊体膜的方法。
从叶绿体中分离膜组分可对影响运输热力学和动力学测定的环境因素（如盐浓度、底物浓度、ATP/GTP的存在以及pH条件）实现更佳的实验控制。 体外 环境也因相同的原因适用于研究易位的机制细节。此外，尽管用于预测叶绿体蛋白定位的软件已得到改进7,8, 体外 转运实验相较于基于显微镜的荧光检测方法更为快速，后者需要基因编码的荧光标签、植物转化和/或特异性抗体。本文介绍了从豌豆中分离叶绿体和类囊体的实验方案。Pisum sativum以及针对每种依赖能量的类囊体转运途径优化的运输实验。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Pisum sativum&lt;/em&gt; 种子</td><td>Seedway LLC，美国纽约州霍尔</td><td>8686 - 小奇迹</td><td></td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Calbiochem，美国新泽西州吉布斯敦</td><td>475855-1</td><td></td></tr><tr><td>80% 丙酮</td><td>Sigma，美国密苏里州圣路易斯</td><td>67-64-1</td><td></td></tr><tr><td>带锋利刀片的搅拌机</td><td>Waring Commercial</td><td>BB155S</td><td></td></tr><tr><td>Polytron 10-35</td><td>Fischer Sci</td><td>13-874-617</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma，美国密苏里州圣路易斯</td><td>GE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Beckman J2-MC 配 JA 20 转子</td><td>Beckman-Coulter</td><td>8043-30-1180</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC-5B 配 HB-4 转子</td><td>Sorvall</td><td>8327-30-1016</td><td></td></tr><tr><td>1xIB 中含 100 mM 二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma，美国密苏里州圣路易斯</td><td>12/3/83</td><td>可分装后冷冻保存以供将来使用</td></tr><tr><td>1xIB 中含 200 mM MgATP</td><td>Sigma，美国密苏里州圣路易斯</td><td>74804-12-9</td><td>可分装后冷冻保存以供将来使用</td></tr><tr><td>1xIB 中含嗜热菌蛋白酶（2 mg/mL）</td><td>Sigma，美国密苏里州圣路易斯</td><td>9073-78-3</td><td>可分装后冷冻保存以供将来使用</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma，美国密苏里州圣路易斯</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>K-Tricine</td><td>Sigma，美国密苏里州圣路易斯</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>山梨醇</td><td>Sigma，美国密苏里州圣路易斯</td><td>50-70-4</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma，美国密苏里州圣路易斯</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>氯化锰</td><td>Sigma，美国密苏里州圣路易斯</td><td>13446-34-9</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma，美国密苏里州圣路易斯</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma，美国密苏里州圣路易斯</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma，美国密苏里州圣路易斯</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma，美国密苏里州圣路易斯</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma，美国密苏里州圣路易斯</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma，美国密苏里州圣路易斯</td><td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Sigma，美国密苏里州圣路易斯</td><td>60-24-2</td><td></td></tr></tbody></table>

分离具有生理活性的类囊体及其在依赖能量的蛋白质转运实验中的应用

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

叶绿体是绿色植物中负责执行多种重要代谢途径的细胞器，其中最显著的是光合作用。在叶绿体内，类囊体膜系统包含了所有的光合色素、反应中心复合物以及大部分电子传递体，并负责依赖光的ATP合成。超过90%的叶绿体蛋白由细胞核基因编码，在细胞质中翻译后被导入叶绿体。进一步将蛋白质转运至或穿越类囊体膜则依赖于四种转运途径之一。本文介绍了一种从豌豆（Pisum sativum）中高效分离具有转运能力的类囊体的方法，并结合了通过三种依赖能量的cpTat、cpSec1和cpSRP介导途径的转运实验。这些方法可用于研究类囊体蛋白的定位、转运能量学以及蛋白质穿越生物膜的转运机制。

为了评估成功转运的底物量，建议设置一个或多个“百分比上样量”泳道。下图数据中使用了不含类囊体的最终转运反应液的10%作为上样量。“百分比上样量”还有助于观察前体底物的大小。该百分比代表已知且定义明确的底物上样量，可用于与实际转运的底物进行比较，并可根据预先制备的蛋白量按需调整上样比例。此外，建议在0.75 mm聚丙烯酰胺凝胶的单个泳道中上样少于4 µg的叶绿素当量，以避免条带扭曲和弥散。以下所有底物均通过in vitro翻译试剂盒进行制备并进行放射性标记。
iOE17 通过 cpTat 途径的转运
<img alt="蛋白质运输实验，类囊体反应，嗜热菌蛋白酶处理，凝胶电泳显示结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58393/58393fig1.jpg" data-altu...

本文介绍了高效分离具有生理活性的类囊体以及用于叶绿体双精氨酸转运（cpTat）、分泌（cpSec1）和信号识别颗粒（cpSRP）途径的蛋白质转运实验方法。

叶绿体是绿色植物中负责执行多种重要代谢途径的细胞器，其中最显著的是光合作用。在……

该方法有助于解答有关蛋白质跨叶绿体膜运输的机制与能量学，以及蛋白质在质体内的定位等关键问题。该技术用于类囊体蛋白靶向的主要优势在于，可在运输过程中完全控制类囊体的环境条件，包括温度、pH、离子条件和前体蛋白浓度。首先，将约55克豌豆浸泡于400毫升蒸馏水中，持续三小时。将浸泡过的豌豆播种于塑料托盘中的土壤内，表面覆盖一层薄薄的蛭石，按照文本方案所述培养9至15天。在分离叶绿体当天，制备连续密度梯度：取15毫升Percoll与15毫升2xGB缓冲液混合，于15毫升聚碳酸酯高速离心管中，在4°C条件下，使用固定角转子以30,900 ×g离心30分钟（关闭刹车）。随后收获约25克培养9至15天的豌豆幼苗。将它们加入装有95毫升预冷的1xGB缓冲液的冷藏搅拌器中，搅拌器刀片需锋利。然后进行匀浆。将此混合物通过置于漏斗上、覆盖至少两层纱布的冷藏烧杯过滤。将滤液加入15毫升聚碳酸酯离心管中，使用水平转子在4°C条件下以3,000 ×g离心5分钟。弃去上清液，用毛笔轻轻将沉淀重悬于1毫升1×GB溶液中。随后，用玻璃巴斯德移液管小心地将筛分悬液铺加在Percoll梯度液的上层。在4°C条件下，使用水平转子以8,000 ×g离心10分钟，离心时关闭刹车。再次使用移液器小心地将含有完整叶绿体的下层绿色条带转移至一个新的50毫升聚碳酸酯离心管中，并加入30毫升1×IB缓冲液。将离心管在水平转子中以1,800 ×g于4°C离心5分钟。弃去上清液后，用毛笔将沉淀物轻轻重悬于1毫升1xIB溶液中。用30毫升1xIB溶液洗涤，并在相同条件下再次离心。最后一次离心后，将沉淀物重悬于1毫升1xIB溶液中。为测定叶绿素浓度，将10微升完全重悬的叶绿体与5毫升80%丙酮混合。使用厚度为180微米、孔径为11微米的滤纸过滤，然后通过分光光度计测定叶绿素浓度。用预冷的1×IB缓冲液将叶绿体混合物稀释至每毫升含1毫克叶绿素。当无需制备基质提取物时（例如进行叶绿体Tat转运实验），可开始分离类囊体。将完整叶绿体分装于1.5毫升离心管中，在4°C条件下，使用水平转子以1,000 ×g离心6分钟。随后弃去上清液，用低渗裂解缓冲液重悬沉淀物，使用微量移液器调节浓度至1毫克/毫升。冰上避光孵育10分钟，期间偶尔轻轻混匀。为回收类囊体，将样品在摆动转子离心机中于 4 °C、3,200 ×g 条件下离心 8 分钟。通过将沉淀物用 1 至 2 毫升裂解缓冲液重新悬浮，然后在相同条件下再次离心，洗涤类囊体两次。最后一次离心后，将沉淀物重新悬浮于 1 毫升 1×IB 缓冲液中，并使用分光光度计按照此前所示方法测定分离类囊体中的叶绿素浓度。对于需要回收基质提取物的途径，如CPSec1和CPSRP，将分离的叶绿体在摆桶转子中以600微升体积于4°C、1,000 ×g条件下离心6分钟。为裂解叶绿体，我们用600微升低渗裂解缓冲液重悬沉淀。在冰上避光孵育10分钟，期间偶尔混匀。然后在4°C条件下，使用水平转子以3,200 ×g离心8分钟。为保留基质，将浅绿色至黄色的上清液转移至新的微量离心管中，并加入等体积的2×粗制基质缓冲液。为洗涤类囊体，加入两倍体积的裂解缓冲液，并在4°C条件下以3,200 ×g离心8分钟。将沉淀重悬于1×IB中，使叶绿素浓度达到1毫克/毫升，并置于冰上备用，用于后续转运实验。通过在4°C下以42,000 ×g离心30分钟，使用固定角转子去除粗制基质中的残留膜成分。然后从每根离心管中收集95%的上清液体积，注意避免扰动底部少量黄绿色沉淀，同时记录每管中取出的体积。为制备浓缩的基质提取物，汇集收集的上清液。然后使用4毫升、截留分子量为30千道尔顿的浓缩管将提取物浓缩至原体积的五分之一。在冰上，于1.5毫升离心管中进行cpTat转运测定：将分离的类囊体与最终浓度为0.33毫克/毫升的叶绿素、在1×IB中配制的5毫摩尔ATP以及在1×IB中配制的8毫摩尔DTT混合。为启动转运，将底物蛋白加入转运反应混合物中。在室温下，用80至100微爱因斯坦每平方米每秒的光合有效辐射照射悬浮液10分钟，以进行反应。为终止转运反应，用预冷的1×IB缓冲液将悬浮液稀释至原体积的八倍。在4°C条件下，使用微量离心机以3,200 ×g离心五分钟，以收集类囊体。弃去上清液后，将沉淀物重悬于120 µL预冷的1×IB缓冲液中。为检测CPSec1或PSRP通路，于冰上在1.5 mL离心管中混合以下组分。将类囊体调整至叶绿素终浓度为0.33毫克/毫升，加入含0.83毫克/毫升叶绿素当量的基质提取物，以及在1xIB中配制的5毫摩尔ATP。用预冷的1xIB将反应体系补至所需体积，冰上孵育10分钟。通过向该转运混合物中加入体积分数为10%的底物蛋白，启动转运反应。在室温下，使用80至100微爱因斯坦每平方米每秒的光合有效辐射照射10分钟。为终止反应，用预冷的1×IB缓冲液将悬浮液稀释至原体积的8倍。在4摄氏度下，于微量离心机中以3,200×g离心5分钟。弃去上清液后，将沉淀重悬于120微升预冷的1×IB缓冲液中。为去除未被转运的残留底物，向其中加入6微升浓度为2毫克/毫升的嗜热菌蛋白酶以及10毫摩尔/升氯化钙（溶于1×IB缓冲液），以消化胞外蛋白。将蛋白酶反应体系置于冰上孵育40分钟。通过加入等体积的含25毫摩尔EDTA的1xIB缓冲液终止蛋白酶反应。在4摄氏度下，以3,200 ×g在微量离心机中离心5分钟，以收集类囊体。去除上清液后，将收集的类囊体重悬于120微升含5毫摩尔EDTA的1xIB缓冲液中，并转移至新的1.5毫升离心管中。在4°C条件下，以3,200 ×g在微量离心机中再次离心5分钟后，弃去上清液，并将沉淀物重悬于适量体积的含10毫摩尔/升EDTA的Laemmli样品缓冲液中。将样品置于沸水浴中10分钟。随后通过SDS-PAGE对样品进行分析。iOE17蛋白通过cpTat途径转运后，其引入的底物与成熟加工形式之间出现了两到三千道尔顿的大小迁移。这是由于N端信号肽被切除，表明cpTat转运成功。经嗜热菌蛋白酶处理后，仅保留成功转运因而具有蛋白酶抗性的成熟条带。OE33前体通过CPSec1途径转运后，成熟底物出现分子量偏移，并对蛋白酶具有保护作用。LHCP前体通过cpSRP途径插入类囊体膜，经嗜热菌蛋白酶消化分析，其分子量减少了1.5至2千道尔顿，表明成功实现了膜插入，因为膜结构保护了未切割的成熟LHCP降解产物免遭完全蛋白水解。观看本视频后，您应能充分理解如何分离类囊体，并检测物质通过依赖能量的cpTat、cpSec1和cpSRP途径的转运能力。若操作熟练，该技术在正确执行时可在三到四小时内完成。尽管本视频未作展示，但我们在实验室中分离和处理具有光合作用活性的叶绿体及类囊体时，通常会关闭实验室的顶灯。进行此操作时，务必将分离的叶绿体和类囊体保持在4摄氏度。开始时请轻柔地重悬叶绿体。第一次离心后，避免扰动Procoll梯度。此外，可同时制备输入样品的百分比样品，并与转运反应一同上样至同一凝胶，以估算底物的转运情况。请注意，操作放射性底物时必须谨慎处理，并穿戴适当的个人防护装备。该技术建立后，为蛋白质靶向领域的研究人员探索蛋白质跨类囊体膜转运的能量学、动力学及独特机制开辟了道路。

isolation-physiologically-active-thylakoids-their-use-energy

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

生理活性类囊体的分离及其在能量依赖性蛋白转运检测中的应用

所述的比较性定量蛋白质组学方法旨在深入了解不同条件下多蛋白复合物的组成 ，并通过比较遗传背景不同的菌株来加以示范。在定量分析中，将蔗糖密度梯度离心中不同组分的等体积样品混合后，通过质谱进行分析。...

基于15N代谢标记与定量质谱法的多蛋白复合物比较分析新方法

比较样品间线粒体膜电位可提供有关细胞状态的重要信息。本文详细描述了分离线粒体以及利用荧光法检测其对抑制剂和解偶联剂反应的实验步骤。通过细胞培养和细胞应激动物模型的应用，展示了该实验方案的方法学特点及其应用价值。...

从培养细胞和小鼠组织中分离线粒体及其功能分析

蛋白脂质体用于在明确的生化环境中研究纯化的通道蛋白和转运蛋白。本文图示了一种用于检测这些蛋白介导的外排作用的实验方法。详细描述了制备蛋白脂质体、进行记录以及分析数据以定量确定重组蛋白功能特性的各个步骤。...

基于蛋白脂质体的外排实验测定 Cl⁻ 通道单分子特性- 通道蛋白与转运蛋白

由于线粒体仅占植物细胞的一小部分，因此需要对其进行纯化以开展多种研究。可通过匀浆处理，随后进行差速离心和密度梯度离心，从多种植物器官中分离得到高度纯化的线粒体组分。...

线粒体的分离与呼吸功能测定 拟南芥

本文介绍了一种从硅藻中分离岩藻黄素叶绿素a/c结合蛋白（FCP），并将其整合到具有天然脂质组成的脂质体中，以研究离子组成变化对激发能传递影响的实验方案。...

从羽纹硅藻 Cyclotella meneghiniana 中分离光捕获天线并将其与类囊体脂质共同组装入脂质体

一种利用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）和二维SDS-PAGE解析植物类囊体蛋白复合物结构与组成的实验方案被详细描述。该方案已针对 拟南芥,...

通过蓝色天然凝胶电泳分析类囊体膜蛋白复合物

本文介绍了一种通过天然绿色凝胶电泳分离可溶性类囊体复合物的实验方案。随后利用时间相关单光子计数法（TCSPC）对绿色凝胶条带进行表征，并提供了数据分析的基本步骤。...

利用天然绿色凝胶电泳分离菠菜类囊体蛋白复合物及通过时间相关单光子计数进行条带表征

本文介绍一种从拟南芥（Arabidopsis）叶片中分离完整叶绿体及其三个主要亚区室（被膜、基质和类囊体）的方法，该方法结合了差速离心、连续Percoll梯度离心和不连续蔗糖梯度离心。该方法可用于通过免疫印迹和蛋白质组学手段进行蛋白质的亚叶绿体及亚细胞定位研究。...

拟南芥叶绿体亚区室的制备及其用于免疫印迹或蛋白质组学分析的蛋白质定位研究

我们提出了一种两步法高纯度线粒体分离方案，适用于蛋白质组水平的蛋白质鉴定与定量分析。该方案无需基因工程操作，因此适用于从任何原代细胞和组织中提取线粒体进行研究。...

无标记两步法分离线粒体以提升蛋白质发现与定量

AviTag特异性定位限制性光照增强生物素化（ALIBi）是一种新型的光遗传学激活方法，用于标记和亲和纯化亚细胞区域的核糖体亚群，以进行后续的测序和蛋白质组学分析。...

基于重组肽标签特异性定位限制性光照增强生物素化的亚细胞核糖体亚群分离

学习从豌豆幼苗中高效分离具有生理活性的类囊体，并检测能量依赖性蛋白质转运机制。该方法可精确控制温度、pH和离子条件，为研究叶绿体蛋白定位提供可靠方案。

分离具有生理活性的类囊体及其在依赖能量的蛋白质转运实验中的应用

探索更多视频