Name: 高架加迷宫试验结合视频跟踪软件研究外源性生酮类补充剂的毒性作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: 学习使用高架加迷宫试验结合视频跟踪软件评估啮齿类动物的焦虑水平，研究外源性生酮类补充剂的毒性作用。该方法可可靠记录潜在抗焦虑治疗的效果，为神经科学和药理学研究提供重要数据支持。

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本工作获得了ONR基金N000141310062和GLUT1D基金会基金#6143113500（资助对象：Dominic P. D'Agostino）、匈牙利国家发展署（基金编号TIOP-1.3.1.-07/2-2F-2009-2008；资助对象：Zsolt Kovács）以及美国退伍军人事务部（资助对象：Mark Kindy）的支持。作者谨此感谢Quest Nutrition LLC对本课题持续研究的支持（资助对象：Csilla Ari）。

动物处理和测量程序均按照南佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南（方案编号 #0006R）进行。所有努力均旨在减少所用动物数量。
1. 准备工作
注意：该实验方案通常需要使用实验室培育的大鼠或小鼠进行高架十字迷宫（EPM）测试。然而，其他动物（如豚鼠）也已在EPM上进行过测试。13使用视频追踪时，需考虑迷宫中动物与迷宫背景颜色之间的色彩对比度。对于直接观察动物行为的研究人员而言，这种对比度的重要性较低 通过 视频。视频追踪软件的设置需要进行配置，以确保能够记录动物在黑色或白色迷宫背景上的黑色或白色体色。使用透明亚克力迷宫时可能会出现配置问题，而哑光灰色迷宫则对两种毛色的啮齿类动物均较为理想。
<ol>
	<li>根据品系、性别、动情周期、年龄以及体重等可能的影响因素选择实验动物2.</li>
	<li>根据具体实验确定每组测试动物的数量。 
	注意：组的大小取决于试验处理预期产生的效应量。通常在实验开始前进行功效分析，以确定在给定动物对任一任务反应的变异性以及实验分组/条件数量的情况下，所需纳入的最少受试对象数量。</li>
	<li>仔细设计实验方案（将使用一系列不同的行为学测试，如旷场实验、高架十字迷宫实验、洞板实验和强迫游泳实验）。 
	注意：在高架十字迷宫（EPM）测试前立即让啮齿类动物预先暴露于新的测试环境（例如开放旷场实验）中，可能会改变其在EPM中的行为表现1,2.</li>
	<li>在高架十字迷宫实验前，以相同方式对待所有动物。 
	注意：已有研究表明，不同的应激因素、药物处理（例如、注射）、运输应激和操作可能改变大鼠在高架十字迷宫（EPM）中的行为及行为反应16因此，动物对动物房的适应例如，运输后，在EPM测试前1-2周，实验条件及处理步骤（例如，灌胃）是必需的。此外，在实验前对啮齿类动物的处理以及它们先前接触应激源的经历，尤其是在测试前的短时间内，必须在各动物之间及各处理组之间保持一致。</li>
	<li>在夜间活动的动物（如大鼠和小鼠）中开展行为学研究时，应采用反转光周期，以便在动物处于黑暗、活跃阶段时进行行为评估。 
	注意：不同饲养条件和光照周期/昼夜节律对行为的影响及其对高架十字迷宫实验结果的作用此前已有报道17因为动物的激素受光周期调节。</li>
	<li>在实验过程中应使用相同的实验人员，并要求他们避免使用气味强烈的香水或肥皂。</li>
	<li>实验过程中，要求实验人员不要在动物附近交谈或在高架十字迷宫（EPM）环境附近移动物体。 
	注意：在采集行为数据时，观察者必须尽量减少移动，且不得发出任何噪声。</li>
	<li>每次试验后应彻底清洁高架十字迷宫（EPM），以去除先前动物留下的任何气味，避免对测试动物的探索行为造成干扰。</li>
	<li>（推荐）在高架十字迷宫实验前数天开始对动物进行抓握适应（轻轻抓住其躯干并握住一分钟或两分钟），使其适应实验操作者。</li>
	<li>将动物放置于高架十字迷宫（EPM）时，应以一致的方式操作所有动物，并将每只啮齿类动物以相同姿势放置在EPM的同一臂内，使其朝向相同的臂例如，置于中央，朝向远离实验者的开放臂。</li>
</ol>
2. 外源性酮补充剂的应用
<ol>
	<li>在开始任何处理之前测量动物的体质量，以确定处理的剂量计算（例如，经胃灌注）。</li>
	<li>在酮补充剂干预前，使用水对动物进行5天的经胃灌注方法适应期（标准啮齿类动物饲料/标准饮食 [SD] + 水灌注；例如，每日灌注水量为2.5 g/kg体质量）。排除任何未能适应经胃灌注方法的动物。</li>
	<li>适应期结束后，对动物进行为期83天的慢性喂养和为期7天的亚慢性喂养，继续给予标准饮食（SD），并每日经胃灌注水（例如，5 g/kg体质量/天；对照组：n = 8）、酮补充剂（如酮酯（KE；1,3-丁二醇-乙酰乙酸二酯）；例如，5 g/kg体质量/天；n = 8）、酮盐（KS；Na+/K+‒β-羟基丁酸 [βHB] 矿物盐；例如，5 g/kg体质量/天；n = 8），或酮盐+中链甘油三酯（1:1比例，KSMCT；n = 8）18,19,20。 
	注：接受经胃灌注的动物在处理后1小时进行高架十字迷宫（EPM）测试。喂食标准啮齿类动物饲料并经胃灌注水（不含酮补充剂）的动物作为对照组。</li>
</ol>
3. 焦虑行为检测
<ol>
	<li>高架十字迷宫装置 
	<ol>
		<li>在研究中使用相同的装置以标准化实验结果。高架十字迷宫（EPM）是一种呈十字形的装置，由四个臂组成例如，臂部宽10 cm、长50 cm）：两个相对的臂开放，两个相对的闭合臂装有高（例如，30 厘米）的壁。该装置被抬高置于地面以上（例如，55 厘米）2. 
		注意：最常用的参数是动物在开放臂中累积停留的时间和进入开放臂的次数；然而，也会测量动物在闭合臂和中心区域的停留时间、进入闭合臂和中心区域的次数，以及在每个区域中移动的距离。</li>
		<li>使用间接照明点亮高架十字迷宫（EPM）即，将光源朝向天花板，而不是直接照射高架十字迷宫装置），并确保四个臂的光照均匀（无阴影，参见 图2). 
		注意：光照强度的变化会影响啮齿类动物在高架十字迷宫（EPM）中的行为表现。因此，连续实验中的动物及不同实验日之间需保持相似的照明条件。例如，房间内2,800流明2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>视频追踪系统 
	注意：使用带有计算机接口和视频摄像机的视频追踪系统进行数据采集，该系统可自动收集大鼠的行为学数据（图3）。对于视频追踪系统，可使用多种标准模拟相机或用户自定义的图像源（如红外相机、摄像机、符合WIA标准的USB相机、网络摄像头， 等等。) 可被使用。在分析录制的视频时，运动追踪软件支持所有常见的视频格式，例如 .avi、.vob、.wmv、.asf、.mov、.qt、.mpg、.mpeg、.mp4、.3gp 和 .mkv。如果视频无法正常播放，可能需要安装特定的编解码器；只要系统中安装了相应的编解码器，其他视频格式也可得到支持。该运动追踪软件还可用于分析先前获取的视频，并处理来自不同来源的图像，例如 DVD/HD 录像机、数字视频文件（.avi、.divx、.mpeg、 等等。）、网络摄像头、DV 摄像机以及支持 WIA 的成像设备。
	<ol>
		<li>系统设置
		<ol>
			<li>将运动追踪软件的安装密钥插入 USB 2.0 端口，并启动安装工具。</li>
			<li>将相机固定在实验区域上方，并确保其在实验过程中保持静止不动。</li>
			<li>使用说明书在运动追踪软件系统中设置一个新实验。选择 新 实验. 双击新实验应遵循的方案图标（图3, 补充文件 1).</li>
			<li>输入详细信息以标记/描述实验 实验信息 对话。</li>
			<li>指定要处理的视频序列的来源。</li>
			<li>定义正确距离测量的转换规则。校准过程可使运动追踪软件获知实验区域的实际尺寸，从而获得准确的距离和速度数值。</li>
			<li>确定工作区域中的感兴趣区域（区域）。</li>
			<li>调整检测过程的参数。
			<ol>
				<li>为了使运动追踪软件能够精确定位图像中动物的位置，必须设置一些检测参数。</li>
				<li>追踪过程需要通过精细调整图像的总体亮度和对比度参数，以获得清晰且对比度良好的图像 亮度 &amp;#38; 对比度 部分 检测设置 面板。根据需要，针对整张图像或用户自定义区域调整这些设置。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>将一只大鼠放入每个实验区域以测试检测过程。</li>
			<li>按压 开始测试 点击按钮以验证检测过程是否能正确识别受试者。通过屏幕上出现的圆点确认检测已激活。测试开始前必须完成校准过程。</li>
			<li>当播放器中显示的唯一黑点为被追踪的动物时，视为检测确认成功。红色追踪线需紧密跟随动物的所有位移。通过显示动物编号及基于位移对应坐标的白色标签，可进一步确认追踪正确。若未获得此类检测结果，应调整 阈值 和 侵蚀 优化检测与追踪过程的参数。</li>
			<li>调节 阈值 和 侵蚀 参数以获得更清晰且无噪声的测试图像。</li>
			<li>如果跟踪路径被正确检测到，请按 停止测试 按钮（图 4）。如果这些调整将用于每个新的实验文件，请按下 保存为默认 按钮。按下 接受 单击按钮以保存新的检测设置。</li>
			<li>设置试验的时间条件。</li>
			<li>如果实验方案要求在将受试对象放入实验区域的同时开始轨迹采集过程，则可以设置随软件附带的遥控装置，或使用无线鼠标。 
			注意：此选项提供了远程控制启动和停止的可能性。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>受试者在系统中的设置
		<ol>
			<li>管理实验对象数据库。要创建实验对象数据库，请输入 受试者数据库 通过按下管理器 受试者 按钮 实验助手 巴</li>
			<li>按压 + 单击按钮以向数据库添加新受试者。</li>
			<li>在已选择单个受试者选项的情况下，输入该受试者的编号。</li>
			<li>填写受试者的其余信息 受试者属性 部分</li>
			<li>按压 创建 单击按钮以添加新主题。</li>
			<li>定义实验方案。使用 调度器 用于定义实验项目中计划执行的不同阶段、会话、试验和受试者。试验将自动被选为即将执行的“下一个试验”，该属性在试验名称左侧以绿色对勾显示。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>同步记录与追踪的数据采集 
		注意：当选择实时图像源时， 播放器 面板提供了一个嵌入式录制模块，可轻松捕获所选摄像头的视频。
		<ol>
			<li>准备运动追踪软件以进行数据采集（校准、区域定义、检测设置、时间设置、调度程序）。</li>
			<li>打开 数据采集 面板</li>
			<li>开始录制实验视频，此时不包含动物，通过按下 开始记录 软件中可用的按钮。</li>
			<li>将动物放入实验区域。</li>
			<li>通过按下开始数据采集过程 开始 按钮 时间对照 面板。追踪过程将与记录过程同时进行。根据需要，要求实验人员手动记录行为学变量，例如直立、探头和跌落。图5).</li>
			<li>在测试室内，由操作者手动收集高架十字迷宫（EPM）数据，同时由一位盲法观察者（用帘子将观察者与EPM隔开）进行独立记录。</li>
			<li>等待追踪过程记录结束，或按下 停止 按钮 时间控制 面板</li>
			<li>将动物移出实验区域。通过按下按钮停止视频录制过程。 停止 运动追踪软件播放器上的按钮。</li>
			<li>清洗并擦干实验区域，为下一只动物做准备。重复该步骤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>数据分析 
		<ol>
			<li>要访问 分析 工具，按下 分析 按钮 实验助手 巴</li>
			<li>生成已完成试验的分析报告时，选择需分析的试验。配置并选择分析报告类型。设置待分析的时间区间。生成报告并进行审阅。将结果导出为电子表格或图像格式（图6).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于焦虑水平测量的高架十字迷宫实验
	<ol>
		<li>在口服灌胃后，于低光照且安静的非应激条件下进行高架十字迷宫实验。 
		注意：确保实验在较短的时间间隔内进行（例如，介于1200至1400之间，因为昼夜节律可能影响啮齿类动物在高架十字迷宫中的行为15,17避免在实验过程中产生不必要的移动和噪音。</li>
		<li>测试开始前，确保高架十字迷宫已清洁并晾干，且视频追踪系统已准备就绪可供使用。</li>
		<li>将大鼠连同其饲养笼一起转移至实验室内，于实验开始前30分钟放置。</li>
		<li>将一只大鼠置于高架十字迷宫四臂交叉处，使其朝向与实验者相对的开放臂。</li>
		<li>运行视频追踪软件，同时手动记录动物行为，持续5分钟。</li>
		<li>若动物从高架十字迷宫（EPM）掉落，应将其拾起并放回掉落的同一位置。该动物的行为学数据应从分析中剔除。 
		注意：较大的噪音或突然的动作可能导致动物在开放臂上僵直不动。若实验过程中出现较大噪音，应将当时正在接受实验的动物的行为学数据从分析中剔除。</li>
		<li>5分钟测试结束后，停止视频追踪软件，将动物从高架十字迷宫中取出，并放回其饲养笼中。</li>
		<li>下次实验/动物使用前，用消毒清洁剂清洁高架十字迷宫（EPM）例如，四联杀菌剂）处理，随后用自来水冲洗。用纸巾将装置擦干。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 视频追踪系统采集数据的分析
<ol>
	<li>根据记录的数据，分析动物在开放臂和闭合臂中停留的时间、进入开放臂、闭合臂及中心区域的次数、首次进入闭合臂的潜伏期，以及在开放臂、闭合臂和中心区域中移动的距离。 
	注：当动物身体质量中心位于某区域时，即视为处于该区域。</li>
	<li>采用方差分析（ANOVA）结合Fisher最小显著性差异（LSD）检验或Tukey多重比较检验，确定不同处理对行为的影响。</li>
</ol>

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</ol>

D'Agostino, D.P., Kesl, S., Arnold, P. 提高并维持酮症的组合物与方法。国际专利 # PCT/US2014/031237。南佛罗里达大学。
Ari, C., D'Agostino, D.P.，用于减少焦虑相关行为的外源性酮补充剂。临时专利 #62289749。南佛罗里达大学。
Dominic P. D'Agostino 和 Csilla Ari 是 Ketone Technologies LLC 公司的共同所有人。
这些利益关系已根据该大学的机构和个人利益冲突政策进行了审查和管理。所有作者声明不存在其他利益冲突。

通常，有几种常用的测试方法，如明暗箱选择实验、社交互动实验和高架十字迷宫（EPM）实验，可用于评估不同动物模型的焦虑水平。然而，仅使用EPM实验即是一种适合研究外源性酮补充剂对啮齿类动物焦虑水平影响的方法18,20。
EPM 方法的主要优势在于&#160;它依赖于啮齿类动物对黑暗、封闭空间的本能偏好，以及对高处的非条件性恐惧和对开阔空间的回避。另一方面，其他用于研究类焦虑行为的方法则是基于动物对某些有害刺激的行为反应，例如电击、食物/饮水剥夺、巨大噪音以及暴露于捕食者气味。3。这些测试通常会引发条件化反应，而高架十字迷宫还是一种更为人道的替代方法。此外，高架十字迷宫可作为研究不同脑区参与功能的有用工具（例如，边缘区域，海马）及其潜在机制（例如，焦虑行为的γ-氨基丁酸、谷氨酸、5-羟色胺、腺苷2.
当施加对动物具有较大应激性的处理时（例如,&#160;口服灌胃）时，所有动物应以相同方式由同一人操作，尤其是在评估潜在的微弱抗焦虑效应时。如果可能，可将药物/化合物加入饮水中给予 通过 一种可口的“零食”可能是更理想的方法。为确保每只动物接受相同剂量，可使用口服灌胃法。根据化合物的药代动力学特性，通常建议在灌胃后1小时内进行高架十字迷宫（EPM）测试。在选择实验动物时，应根据实验目的和受试物质，综合考虑其品系、性别、动情周期、年龄以及体重等因素。2关于年龄，在设计高架十字迷宫实验研究和解读数据时，需考虑到开放臂进入次数的百分比随年龄呈线性增加21 且EPM行为中与衰老相关的变化具有品系特异性22.
在进行高架十字迷宫实验时，可能会遇到一些需要解决的问题。有时由于动物表现出极端行为倾向，需将其排除在分析之外。例如动物从未离开其被放置的区域，几乎从装置上跌落，或被装置外的噪音或事件所干扰。高架十字迷宫实验的其他复杂因素可能包括引起镇静或过度活跃的处理，因为这类效应需要进行评估 通过 高架十字迷宫参数
仅应让动物接受一次高架十字迷宫（EPM）测试，因为在第二次（重复）暴露时，啮齿类动物在开放臂上的活动减少，且在中央平台停留的总时间较第一次暴露时缩短14,15。因此，强烈建议对啮齿类动物仅进行一次EPM测试。然而，如果第一次与第二次EPM测试之间至少间隔三周，且EPM装置被移至另一房间（不同环境），则可对动物进行多次EPM测试2。
高架十字迷宫可采用不同材质、尺寸（例如，用于小鼠或大鼠）和颜色，选择实验动物时需考虑这些因素。需要注意的是，前一只动物在装置上留下的气味可能会影响后续动物的行为。因此，我们建议使用易于清洁的材料制成的高架十字迷宫，例如不透明的丙烯酸玻璃，这种材料在清洗后不会残留气味。应避免使用木质的高架十字迷宫。最好选用与在高架十字迷宫上测试的动物体色不同的哑光颜色（例如，测试白色动物时使用黑色）。动物与装置背景之间的对比度越高，动物的检测效果越好，所获得结果的可靠性和精确性也越高（如移动距离、速度、轨迹追踪）。由哑光灰色材料制成的高架十字迷宫适用于白色、黑色以及黑白相间的动物。
视频追踪系统的另一个优势是，除了高架十字迷宫实验（EPM）外，它还能灵活、简便地与多种行为学实验结合使用，例如水迷宫、旷场、十字臂/放射臂/T-Y迷宫、位置偏爱、强迫游泳和悬尾实验。
综上所述，本文旨在描述高架十字迷宫实验（EPM）与视频追踪软件结合使用的方法，以收集和分析针对新型抗焦虑治疗所引起的行为改变。EPM 的潜在应用包括对新开发的药理学制剂进行预筛选，用于治疗与焦虑相关的疾病。除了抗焦虑和致焦虑药物外，还可研究不同激素和滥用药物对行为的影响。此外，也可评估衰老以及暴露于各种应激源的影响。本研究得出结论：在采取适当操作步骤的前提下，EPM 已被证实是一种敏感的方法，可用于评估与酮类补充相关的行为变化18,20。

本文旨在描述高架十字迷宫（EPM）测试结合视频追踪软件的方法学，以监测实验啮齿类动物模型中与焦虑相关行为的变化及新型治疗方法的效果。EPM测试是一种相对简单的行为评估方法，最初开发用于量化药物处理后大鼠的焦虑行为水平和焦虑反应1。事实上，已有研究表明，EPM测试是研究啮齿类动物焦虑水平变化的一种广泛应用且有效的行为学检测手段1,2。该测试在啮齿类动物（主要是大鼠和小鼠）中的适用性基于以下行为特征：对封闭、黑暗空间的趋向性（趋近行为）、对开阔空间/高度的非条件性恐惧（回避行为），以及探索新环境的强烈先天动机。因此，EPM测试是一种建立在趋近-回避冲突基础上的成熟方法学2,3。
高架十字迷宫（EPM）是一种呈十字形的装置，由四个抬高的臂组成，由Handley和Mithani4首次描述（图1），其中两个相对的臂向周围环境开放（开放臂），而另外两个相对的臂则设有侧壁（闭合臂）。在给予处理后，若实验动物在开放臂上停留的时间较对照组（未处理动物）更长和/或进入开放臂的次数增多，则表明具有抗焦虑效应2,3。研究表明，在EPM实验开始后的前5分钟内（即将大鼠放置于EPM四个臂的交叉区域后），回避反应最为显著5；因此，通常在EPM上记录给药后5分钟内的行为表现。作为焦虑水平的其他评估指标，还可记录探头次数、直立行为（啮齿类动物以后肢直立站立）、排泄的粪便颗粒数、总臂进入次数（自发运动活性）以及不同姿势（伸展或僵直）等参数2。因此，可通过整合多种行为学参数，对与焦虑相关的行为进行全面评估。
为了提高实验结果的可靠性，通常联合使用两到三种行为学检测方法，例如明暗选择实验、社交互动实验和高架十字迷宫（EPM）实验，以评估不同动物模型的焦虑水平6。单独在啮齿类动物上进行的EPM实验也是研究不同药物抗焦虑或促焦虑作用的合适方法7。EPM实验不仅对苯二氮䓬类抗焦虑药（例如，地西泮）8敏感，还对其他多种化合物具有敏感性，包括氨基酸类、单胺类、肽类和核苷类物质（例如，N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）拮抗剂AP7、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMPA）拮抗剂CNQX、μ-阿片受体激动剂吗啡、NPY1拮抗剂BIBP3226、P物质、胃饥饿素、催产素、5-羟色胺受体激动剂和拮抗剂如8-OH-DPAT和WAY-100635，以及β1-肾上腺素能受体拮抗剂贝他洛尔）9,10,11,12。因此，在啮齿类动物上进行的EPM实验是一种合适且敏感的方法，可用于研究不同干预措施对与抗焦虑作用相关的大脑区域（例如，杏仁核、海马和边缘系统区域）以及焦虑相关作用机制（例如，5-羟色胺能、GABA能和腺苷能系统）的影响2。这些EPM研究中测试的物质包括外源性酮类补充剂，其以细微方式改变脑内信号传导，可能需要敏感的方法来检测行为变化。
本文介绍了高架十字迷宫实验（EPM）与视频追踪软件结合使用的方法，该方法有助于消除实验偏差，并便于收集和分析针对新型抗焦虑治疗所引起的行为改变。

<table><tbody><tr><td>小鼠和大鼠高架十字迷宫</td><td>Coulbourn Instruments</td><td>H10-35-EPM</td><td></td></tr><tr><td>SMART 视频追踪软件</td><td>Harvard Apparatus</td><td>SMART 3.0</td><td></td></tr></tbody></table>

高架十字迷宫实验结合视频追踪软件研究外源性生酮补充剂的抗焦虑作用

Elevated Plus Maze Test Combined with Video Tracking Software to Investigate the Anxiolytic Effect of Exogenous Ketogenic Supplements

本研究的总体目标是描述高架十字迷宫（EPM）实验结合视频追踪软件的方法学。该方法旨在记录各种潜在抗焦虑治疗对实验啮齿类动物模型的影响。EPM实验基于啮齿类动物偏好受保护、封闭且阴暗空间的天性，以及其对开阔空间和高处的无条件恐惧，同时还利用了它们探索新环境的强烈本能动机。EPM实验是一种广泛使用的行为学检测方法，用于研究已知影响行为的药物对啮齿类动物产生的抗焦虑或促焦虑反应。观察结果显示，若动物在EPM测试中停留在闭臂的时间比例减少、在开臂的时间比例增加、进入闭臂的次数减少、进入开臂的次数增多，则可能反映其焦虑水平降低。本研究采用该方法检测外源性酮类补充剂对Sprague Dawley（SPD）大鼠焦虑相关行为的影响。实验前，将外源性酮类补充剂长期饲喂大鼠83天，或在短期和急性条件下连续7天每日经口灌胃给药。行为学数据在干预结束后由不知分组情况的观察者使用SMART视频追踪系统进行采集。主要研究结果表明，EPM实验是一种有效检测酮类补充剂诱导抗焦虑效应的方法，可作为评估药物或代谢干预疗法引起焦虑行为变化的敏感指标。

本实验旨在验证以下假设：长期（饲喂83天）或亚急性期（口服灌胃7天）给予外源性酮补充剂对中国台湾Sprague-Dawley（SPD）雄性大鼠（250 - 350 g，两个月龄）具有抗焦虑作用。长期给药包括以下酮补充剂：低剂量酮酯（LKE；1,3-丁二醇-乙酰乙酸二酯，约10 g/kg/天，LKE）、高剂量酮酯（HKE；约25 g/kg/天，HKE）、β-羟基丁酸矿物盐（bHB-S；约25 g/kg/天，KS）以及bHB-S联合中链甘油三酯（MCT；约25 g/kg/天，KSMCT）。亚急性期实验采用以下处理组：KE、KS和KSMCT（5 g/kg/天）。对照组包括SD组或SD组加水灌胃（对照组）。所有数据均以均值±均值标准误（SEM）表示。当p &lt; 0.05时认为差异具有统计学意义。显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Fisher's LSD检验确定。
长期喂养后，KSMCT组大鼠在开放臂停留的时间显著长于对照组（p = 0.0094）。LKE、KS和KSMCT组在闭合臂停留的时间显著缩短（p = 0.0389、0.0077 和 0.0019， respectively），而KS组在中央区域停留的时间显著长于对照（SD）组（p = 0.0239）（图7A）18。
与对照组（SD）相比，KS组和KSMCT组大鼠在开放臂中行走的距离显著更长（p = 0.036 和 0.0165）；而LKE、KS和KSMCT组大鼠在闭合臂中行走的距离显著缩短（p = 0.0252、0.00041 和 0.0032）（图7B）。与对照组相比，KS组和KSMCT组在中心区域行走的距离更长（p = 0.0206 和 0.0482）；而在KSMCT组中，经长期喂养后首次进入闭合臂的潜伏期显著延长（p = 0.0038）18（图7C）。
经7天灌胃后，KE组大鼠在开放臂停留的时间显著长于对照组（p = 0.0281）；而在KE、KS和KSMCT组中，大鼠在中心区域停留的时间均减少（p = 0.0005、&lt; 0.0001 和 = 0.023，分别）（图8A）18。在KE和KS组中，大鼠进入封闭臂的次数在给药7天后显著降低（p = 0.0436 和 0.0234，分别）（图8B）；此外，KS组大鼠进入中心区域的频率也低于对照（SD）组（p = 0.0193）。
<img alt="静态平衡；抽象建筑模型；反射表面；平衡概念；设计研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58396/58396fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：用于大鼠测试的高架十字迷宫（EPM）。 每条臂宽10 cm，长50 cm，其中相对的两条臂为开放臂，边缘略高；相对的另两条臂为封闭臂，配有高30 cm的侧壁。迷宫距地面高度为55 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58396/58396fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="直接照明与间接照明示意图；展示建筑设计中不同照明方式的光线路径。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58396/58396fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：直接照明与间接照明的示例。应将光源朝向天花板，同时遮挡实验区域上方的直射光。在高架十字迷宫（EPM）实验过程中，使用间接照明至关重要，以确保四个臂被均匀照亮且无阴影。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58396/58396fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="实验助手界面；数据源配置、分析选项、实验设置工具栏。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58396/58396fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：运动追踪软件的实验助手工具栏。 该工具栏旨在提供对主要操作的访问。按钮对应典型实验流程中的各项任务，仅当前允许执行的任务为可激活状态。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58396/58396fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="行为研究中的小鼠追踪示意图；空间导航实验，运动分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58396/58396fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：受试动物的运动轨迹由一条红线标记，跟随其移动路径。 通过调整阈值，可降低背景干扰，直至仅动物本体被检测并由红线追踪。该轨迹基于受试动物质量中心的移动，当前坐标位置已标出。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58396/58396fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠行为实验装置；用于决策研究的迷宫装置可视化示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58396/58396fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：Sprague Dawley (SPD) 大鼠位于开放臂的高架十字迷宫（EPM）。 展示了一个实验装置的示例。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58396/58396fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="带有彩色边界框的物体追踪路径分析图；追踪设置可视化示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58396/58396fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
图6：实验期间动物累积运动轨迹。 作为数据分析的一部分，可显示受试对象在追踪区域内的轨迹路径。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58396/58396fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="行为学分析，柱状图显示在各区域的时间、距离以及进入闭臂的潜伏期结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58396/58396fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7：外源性酮补充物长期喂养83天后SPD大鼠在高架十字迷宫（EPM）中的行为反应。 这些图示展示了通过EPM及运动追踪系统收集的代表性结果18。(A) 与对照组（SD）相比，KSMCT组在开臂中停留的时间比例更高，而LKE、KS和KSMCT组在闭臂中停留的时间更短。(B) KS和KSMCT组在开臂中移动的距离更长，而LKE、KS和KSMCT组在闭臂中移动的距离更短，表明其焦虑水平低于对照组（SD）。(C) KSMCT组进入闭臂的时间更晚，提示其焦虑水平低于对照组（SD）。缩写：SD = 标准啮齿类动物饲料 + 水（每日25 g/kg体重（b.w.）水）；LKE = SD + LKE（1,3-丁二醇-乙酰乙酸二酯，每日10 g/kg b.w.）；HKE = SD + HKE（每日25 g/kg b.w.）；KS = SD + β-羟基丁酸矿物盐（bHB-S；每日25 g/kg b.w.）；KSMCT = SD + bHB-S + 中链甘油三酯（MCT；每日25 g/kg b.w.）；SPD = Sprague-Dawley大鼠；EPM = 高架十字迷宫（* p &lt; 0.05；** p &lt; 0.01；*** p &lt; 0.001；**** p &lt; 0.0001）。本图经修改自Ari et al.18。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58396/58396fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="在各区域花费的时间和进入次数；柱状图；行为分析；实验区域比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58396/58396fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图8"> 
图8：外源性酮补充物经口灌胃7天后SPD大鼠的行为反应。 代表性结果通过高架十字迷宫（EPM）实验并使用运动轨迹追踪软件系统获得18。(A) KE组在开放臂中停留的时间百分比更高，而KE、KS和KSMCT组在中心区域停留的时间较对照组（SD组）更少，表明焦虑水平降低。(B) 与对照组（SD组）相比，KE组和KS组大鼠进入封闭臂的次数减少。缩写：SD = 标准啮齿类动物饲料 + 水（5 g/kg 体重/天）；KE = SD + 酮酯（1,3-丁二醇-乙酰乙酸二酯，5 g/kg 体重/天）；KS = SD + β-羟基丁酸矿物盐（bHB-S；5 g/kg 体重/天）；KSMCT = SD + bHB-S + 中链甘油三酯（MCT）（5 g/kg 体重/天）；SPD = Sprague-Dawley大鼠；EPM = 高架十字迷宫（* p &lt; 0.05；*** p &lt; 0.001；**** p &lt; 0.0001）。该图改编自Ari et al.18。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58396/58396fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种用于研究啮齿类动物模型焦虑水平变化的实验方案。在临床前实验室环境中，高架十字迷宫（EPM）实验结合视频追踪软件，可提供一种可靠的方法，用于记录各种潜在抗焦虑治疗手段的效果。

本研究的总体目标是描述高架十字迷宫（EPM）实验与视频追踪软件联合使用的方法学。

高架十字迷宫是一种以更人道的方式记录各种潜在抗焦虑治疗对实验啮齿类动物模型影响的方法。该方法的主要优势在于，它利用了啮齿类动物对黑暗和封闭空间的本能偏好，以及对高处的非条件性恐惧和对开放空间的回避行为。我实验室的合作者 Collin Park 将协助演示该操作流程。测试前数天，通过抓握动物躯干并将其握住约一分钟来对动物进行操作，使其适应实验人员。然后，在开始任何处理之前，测量动物的体重，以确定给药剂量。接下来，在酮补充开始前的五天内，通过灌胃给予水，使动物适应经胃灌胃的方法。进行焦虑行为检测时，使用高架十字迷宫（Elevated Plus Maze，EPM）装置，该装置呈十字形，包含两个开放臂和两个封闭臂。通过天花板间接照明来照亮EPM装置，避免直接照射。确保四个臂的光照条件基本一致。将运动追踪软件的安装密钥插入 USB 2.0 端口并安装软件。然后，将摄像头固定在实验区域上方，并确保其在实验过程中保持静止不动。最后，根据使用说明书在运动追踪软件系统中设置一个新实验。将动物放入实验区域。然后，通过按下时间控制面板上的开始按钮来启动数据采集过程。在测试室内，通过手动方式和使用软件两种方式收集EPM数据。将盲法观察者用帘子隔开。等待追踪过程记录结束，或按下时间控制面板上的停止按钮。然后，将动物从实验区域移除。最后，要访问分析工具，请在实验助手工具栏中按下分析按钮。选择需要分析的试验和时间区间，以生成报告。首先，在开始实验前30分钟，将大鼠连同其饲养笼一起转移到实验室内。将大鼠放置在高架十字迷宫（EPM）四臂交叉处，使其朝向与实验者相对的开放臂。启动视频追踪软件，同时手动记录动物行为，持续五分钟。若动物从EPM上掉落，应将其拾起，并放回其掉落时在EPM上的相同位置。将该动物的行为学数据从分析中排除。在五分钟测试结束时，停止视频追踪软件。将动物从高架十字迷宫（EPM）中取出，并放回其居住的笼具中。最后，使用消毒清洁剂清洁高架十字迷宫，随后用自来水冲洗。用纸巾将装置擦干。慢性喂养后，KSMCT组大鼠在开放臂中停留的时间显著长于对照组。与对照组相比，KS组在中心区域停留的时间显著更长。在LKE、KS和KSMCT组中，大鼠在闭臂中停留的时间较对照组更短。KS组和KSMCT组的大鼠在开臂中行走的距离显著更长。与对照组相比，LKE、KS 和 KSMCT 组大鼠在闭臂中行进的距离显著减少。此外，在连续七天经口灌胃给药后，KE 组大鼠在开臂中停留的时间增加，但 KE、KS 和 KSMCT 组在中心区域的停留时间减少。在给药七天后，KE 组和 KS 组进入闭臂的次数也显著降低。将所有大鼠以一致的方式放置在设备上，使其位于交叉处且朝向远离实验者的方位，这一点非常重要。在啮齿类动物中进行高架十字迷宫实验是一种合适且敏感的方法，可用于研究不同处理对参与抗焦虑作用及相关作用机制的脑区所产生的影响。

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