Name: 诱导和可逆显性阴性 (dn) 蛋白抑制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 学习利用可诱导显性阴性系统对蛋白质进行条件性失活的方法，适用于多聚体和单体蛋白研究。该技术通过可逆过表达显性阴性突变体实现部分活性敲除，保留内源性残余表达，为神经科学和细胞生物学领域的蛋白质功能分析提供可靠工具。

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pCS2+CB-Myc6 载体由 Marshall Horwitz（美国华盛顿州西雅图市华盛顿大学）惠赠。HEI-OC1 细胞由 Fedrico Kalinec（美国加利福尼亚州洛杉矶市加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院）慷慨提供。技术援助由内布拉斯加大学医学中心小鼠基因组工程核心实验室（C.B. Gurumurthy、Don Harms、Rolen Quadros）和克瑞顿大学综合生物医学成像设施（Richard Hallworth、John Billheimer）提供。内布拉斯加大学医学中心小鼠基因组工程核心实验室获得了美国国立卫生研究院/普通医学科学研究所（NIH/NIGMS）机构发展奖（IDea）的支持，资助号为 P20 GM103471。综合生物医学成像设施得到了克瑞顿大学医学院以及 NIH/NIGMS 资助号为 GM103427 和 GM110768 的项目支持。该设施的建设还获得了美国国立卫生研究院研究资源中心（NCRR）资助号 RR016469 和 NIGMS 资助号 GM103427 的资助。本研究中建立的小鼠品系保藏于克瑞顿大学动物资源设施，其基础设施的改善得益于 NIH/NCRR 资助号 G20RR024001 的支持。本研究曾获得 NIH/NCRR 5P20RR018788-/NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE 项目资助（Shelley D. Smith）、NIH/ORIP R21OD019745-01A1（S.M.R.-S.）以及听力健康基金会（Hearing Health Foundation）新兴研究项目（S. Tarang）的支持。本研究内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

转基因CBRb小鼠的制备以及所有相关的动物护理和实验均经克雷顿大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并依照其指导原则进行。
1. 转基因 CB-Myc6-Rb1 构建体
注意：将CBRb克隆至pTet_Splice载体中是通过多步过程完成的（图&#160;1A 和 1B）。
<ol>
	<li>将第一阶段克隆操作导入 pCS2+CB-Myc6 载体中。
	<ol>
		<li>为构建 CBRb 转基因载体，使用以下引物扩增一段长度为 1583 bp 的 Rb1 cDNA 片段（对应 RB1 蛋白中第 369–896 位氨基酸，共 528 个氨基酸）：EcoRI+RB 1243F 引物序列为 GGGGAATTCATTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTC，XbaI+EcoRV+RB 2826R 引物序列为 CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC。</li>
		<li>如前所述1,12，将所获得的片段（1546 bp）克隆至 pCS2+CB-Myc6 载体的 EcoRI 与 XbaI 限制性酶切位点之间。 
		注：长度为 1012 bp 的 CB-Myc6 构建片段（337 个氨基酸）与 Rb1 片段融合后，表达出的蛋白约为 865 个氨基酸（约 108 kDa），略小于内源性 RB1 蛋白（~110 kDa）（图 1A），其 N 端带有 CB-Myc6 标签，C 端为 Rb1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将第二阶段亚克隆操作导入 pTet-Splice 载体中。
	<ol>
		<li>为扩增 CB-RB-Myc6 融合片段并引入 Tet 启动子，使用含有 EcoRV（XbaI+EcoRV+RB 2826R）和 SalI 酶切位点的引物，对包含 CB-myc6-Rb1 的表达盒进行扩增：SalI+CBF 引物序列为 CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC。</li>
		<li>将所获得的片段（2567 bp）亚克隆至 pTet-Splice 载体中 SalI 与 EcoRV 限制性酶切位点之间，使得包含 SV40 内含子和 PolyA 信号在内的完整 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 转基因能够通过单一的 NotI 酶切被分离出来（图 1B）。 
		注：该 NotI 酶切片段用于生成转基因创始人系（transgenic founders）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. TetO-DN-CB-myc6-Rb1 转基因的体外检测
<ol>
	<li>Dox 调控：NIH3T3 细胞系 
	注意：除非另有说明，所有体积均已按 6 孔板进行调整。
	<ol>
		<li>按照供应商的说明培养 NIH3T3 细胞，使用含有 10% 胎牛血清的推荐细胞培养基，在 37 °C、10% CO2 条件下培养。</li>
		<li>将细胞与 pTet-Splice 和 pCMV-Tet3G 载体（来自步骤 1）共转染 24 小时。按照以下步骤进行共转染：
		<ol>
			<li>在室温下，将每孔 2–4 µL 脂质类转染试剂与 1 mL 无血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）混合，孵育 5 分钟。对于 12 孔板或 24 孔板，分别使用 250 或 500 µL 培养基，并相应调整转染试剂的体积。</li>
			<li>将每孔 2–3 µg 质粒 DNA 加入转染试剂-DMEM 混合物中，室温孵育 20 分钟。</li>
			<li>将含有 DNA 和转染试剂的 DMEM 混合物加入各孔中。孵育 3–4 小时后，加入 1 mL 完全培养基（使最终体积为每孔 2 mL）。取 Dox 储存液（1 mg/mL） aliquot，并向每孔中加入 2 µL（+ Dox）。在 37 °C、5% CO2 条件下继续培养细胞。 
			注意：对照样本应包括未用 Dox 处理的共转染细胞（- Dox），以及仅转染激活载体 pCMV-Tet3G 并用 Dox 处理 24 小时的 NIH3T3 细胞。对于 pCMV-Tet3G，0.1–1 µg/mL 的 Dox 浓度足以诱导转基因表达。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 HEK293 细胞系测试构建体的可逆性。
	<ol>
		<li>为测试 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 转基因的可逆性，按照供应商说明使用 Eagle 最低必需培养基（EMEM）培养 HEK293 细胞，并如上所述（步骤 2.1.2）共转染 pTet-Splice 和 pCMV-Tet3G 载体 24 小时。</li>
		<li>为实现转基因失活，在 24 小时后移除含 Dox 的培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞 2–3 次，然后在无 Dox 培养基中继续孵育 24 小时。 
		注意：在去除 Dox 后，转基因失活及正常蛋白表达应在 24 小时内恢复。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为评估 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 构建体在促进非正常细胞增殖中的功能，使用 HEI-OC1 细胞系进行功能分析，如下所述。
	<ol>
		<li>在允许条件下（33 °C、10% CO2）使用 10% DMEM 培养 HEI-OC1 细胞。进行细胞增殖研究时，使用细胞计数器计数细胞，并将 10,000 个 HEI-OC1 细胞以 200 µL 体积接种于 96 孔板中。孵育过夜。</li>
		<li>次日，使用脂质类转染试剂对 pTet-Splice 和 pCMV-Tet3G 载体进行瞬时共转染（参见步骤 2.1.2）。另设一孔，使用脂质类转染试剂转染 pmR-ZsGreen1 质粒（2 µg，步骤 2.1.2），用于计算转染效率。以未转染细胞作为对照。</li>
		<li>转染后 24 小时，在荧光显微镜下检测转染细胞的绿色荧光（激发波长 = 485 nm，发射波长 = 530 nm）。记录绿色荧光的有无，并计算转染率，即 GFP 阳性细胞数（转染细胞）占 DAPI 标记细胞总数（总细胞）的比例。 
		注意：我们估计转染率约为 70%。</li>
		<li>为诱导转基因表达，向部分转染细胞中加入 1 µg/mL Dox，另一部分作为对照（-Dox）。以未处理的 HEI-OC1 细胞作为额外对照。</li>
		<li>为评估细胞增殖，按照制造商说明书使用细胞增殖试剂盒。
		<ol>
			<li>简而言之，转染 48 小时后，移除细胞培养基，向微孔板各孔中加入 100 µL 1× 染料结合溶液。在 37 °C 下孵育 1 小时。</li>
			<li>随后，使用荧光微孔板读板仪测量各样本的荧光强度（激发波长 = 485 nm，发射波长 = 530 nm）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为进一步通过免疫细胞化学评估细胞增殖，将 HEI-OC1 细胞接种于 12 孔板中的盖玻片上，在 37 °C 下孵育过夜。
		<ol>
			<li>次日，共转染 pTet-Splice 和 pCMV-Tet3G 载体并进行 Dox 处理（+ Dox）。以未转染细胞作为对照。对 HEI-OC1 细胞进行 Ki-67 标记处理。</li>
			<li>在室温下，用 PBS 中含 4% 多聚甲醛（PFA，pH 7.4）固定细胞 10 分钟。用冰浴 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟，然后在 PBS 中含 0.25% 非离子型去污剂的溶液中孵育 10 分钟。</li>
			<li>再次用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟，然后在湿盒中用 10% 血清封闭 1 小时（室温）。</li>
			<li>在室温下或 4 °C 过夜，将细胞与 500 µL Ki-67 一抗（1:200 稀释）孵育 3 小时。</li>
			<li>用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。随后在避光条件下，室温下与二抗孵育 1 小时。</li>
			<li>移除二抗溶液，在避光条件下用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。</li>
			<li>为进行鬼笔环肽标记，在避光条件下将 HEI-OC1 细胞与 1:200 稀释的鬼笔环肽溶液孵育 30 分钟。为标记细胞核，在室温下将细胞与 5 µg/mL DAPI 孵育 10 分钟。 
			注意：确保鬼笔环肽染料偶联物与二抗偶联物不同。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+（CBRb）转基因小鼠的制备及DN-CBRb策略的体内验证
<ol>
	<li>在确认强力霉素（Dox）对目标基因的有效调控后 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 转基因，纯化NotI片段，并将其显微注射到小鼠受精卵中，随后将受精卵移植至假孕雌鼠体内。 
	注意： 上述操作在内布拉斯加大学医学中心（UNMC）小鼠基因组工程核心设施进行。</li>
	<li>分娩后，使用针对目标基因的特异性引物组对仔鼠进行基因型鉴定 CB-Rb1 融合区域：对于CBRb F，使用5' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3′；对于CBRb R，使用5′ GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3′。 
	注意： 琼脂糖凝胶上观察到的PCR产物大小为401 bp（60-bp CB区域 + 341-bp Rb1 区域（表1）。根据是否存在目标序列，鉴定了十个独立的创始品系。 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 转基因。在这五个品系中，后代均继承了该转基因，证实了转基因的种系传递。最终选择其中一个转基因品系用于建立并维持该品系，以及产生实验用个体。 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 用于进一步研究的动物。</li>
	<li>成年动物培育 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 小鼠到 ROSA-CAG-rtTA 四环素诱导系（品系编号 #006965）（或 alternatively 与 tTA 诱导系杂交），以生成实验用 DN-CBRb 小鼠。使用以下引物组合对杂交后代进行基因型鉴定：rtTA-WT R 引物为 GGAGCGGGAGAAATGGATATG；rtTA 突变 R 引物为 GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC；rtTA 共用引物为 AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT。PCR 扩增产物大小分别为：340 bp（突变型）、340 bp 和 650 bp（杂合子）、650 bp（野生型）。</li>
	<li>通过多西环素（Dox）处理后绘制RB1蛋白的剂量-反应曲线，以确定诱导转基因表达所需的Dox处理时间和持续时长。 
	注意： 在本实验中，采用蛋白质印迹法和定量逆转录聚合酶链式反应检测组织特异性转基因激活及RB1表达。</li>
	<li>进行荧光检测 原位 杂交（FISH）以确认转基因的基因组插入。 
	注意： 该实验在加拿大多伦多市病童医院应用基因组学中心完成。可采用ELISA或蛋白质印迹法（使用特异性抗体）来评估外源基因的激活情况、组织特异性以及内源性POI水平的变化。对于 DN-CB-myc6-Rb1 构建时，我们使用了抗RB1抗体。</li>
</ol>

<ol><li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li>
<li>Tarang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+retinoblastoma+%28rb%291-inducible+dominant-negative+%28DN%29+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model.</a> Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).</li>
<li>Kominami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+selective+role+of+cathepsins+B+and+D+in+the+lysosomal+degradation+of+endogenous+and+exogenous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins.</a> FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).</li>
<li>Cortellino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+ciliogenesis%2C+embryonic+lethality+and+severe+impairment+of+the+sonic+hedgehog+pathway+caused+by+inactivation+of+the+mouse+complex+A+intraflagellar+transport+gene+Ift122%2FWdr10%2C+partially+overlapping+with+the+DNA+repair+gene+Med1%2FMbd4%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4.</a> Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).</li>
<li>Ferreira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryonic+lethality+of+H+ferritin+gene+deletion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).</li>
<li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+deficient+for+rb+are+nonviable+and+show+defects+in+neurogenesis+and+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis.</a> Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).</li>
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<li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15190215">The first knockout mouse model of retinoblastoma.</a> Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletions+of+retinoblastoma+1+%28Rb1%29+and+its+repressing+target+S+phase+kinase-associated+protein+2+%28Skp2%29+are+synthetic+lethal+in+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).</li>
<li>Yamasaki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+E2F-1+reduces+tumorigenesis+and+extends+the+lifespan+of+Rb1%28%2B%2F-%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice.</a> Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).</li>
<li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+a+dominant+negative+retinoblastoma+protein+%28RB%29+inhibiting+satellite+myoblast+differentiation+implies+an+indirect+interaction+between+MyoD+and+RB%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了克服传统转基因策略相关的局限性，我们尝试构建一种小鼠模型，可在特定时空条件下通过过表达目的蛋白（POI）的显性负性（DN）突变体，从而条件性失活内源性POI。针对消除内源性POI功能的问题，已有多种方案被提出15,16,17。我们改进了先前的一种遗传策略1，将依赖多西环素（Dox）的转录系统与一种简便的策略相结合，后者利用溶酶体蛋白酶CB的融合蛋白，生成一种突变肽段，其表达可影响内源性POI的表达2。最重要的是，该技术无需预先了解与POI相关的信号通路。目前这种针对DN蛋白抑制的策略表明，CBRb融合基因上的溶酶体定位信号可将整个RB相互作用复合物导向溶酶体2,3。一旦进入溶酶体，这些蛋白即启动蛋白水解加工过程，进而被降解<sup cla...

大多数旨在实现基因和蛋白质敲除的方法依赖于永久性过程，通常会导致目的基因、RNA序列或目的蛋白（POI）的完全消除或截短。本方法的总体目标是构建一种重组蛋白，以消除内源性野生型蛋白的功能。我们重新审视并改进了一种替代策略1,2，该策略可通过显性负性抑制（DN抑制）实现对目的蛋白（POI）的暂时性敲除。该方法适用于多聚体和单体肽，但尤其适用于以多聚体形式发挥功能的蛋白质。
该方法包括将溶酶体蛋白酶CB与多聚体目的蛋白（POI）的一个亚基融合，形成CB融合复合物。所形成的CB融合复合物能够与内源性蛋白相互作用并对其进行蛋白水解消化，或引导整个CB-POI复合物靶向溶酶体进而被降解3。此外，将CB融合复合物与四环素调控的转录激活系统（TetO）的可诱导特性相结合，可实现转基因可逆、可控的诱导表达2。尽管在许多情况下该方法具有实用性，但在体内完全删除基因或蛋白质可能导致生物体死亡4,5,6。同样，使用Cre/Lox系统进行某些基因或蛋白质的组织特异性条件性敲除可能并不理想，因为这最终将导致关键基因组元件的永久性缺失7。因此，针对特定基因或POI，上述两种方法均可能无法为后续研究提供有效的模型，尤其是在出生后晚期及成年小鼠中开展基因或蛋白质功能研究时。
为了规避这些方法相关的问题，并为所提出方法的有效性提供原理性验证，我们选择通过生成视网膜母细胞瘤1（Retinoblastoma 1, RB1）蛋白的条件性显性负性（DN）版本，来测试本文所述方法。已有多种策略被提出8,9,10以消除内源性RB1的功能；然而，这些策略均面临上述类似的局限性：RB1的永久性种系缺失会导致胚胎致死，且与其肿瘤抑制功能一致，RB1的永久性条件性缺失会引发多种肿瘤11。尽管天然存在的RB1显性负性形式似乎并不存在，但相较于目前可用的策略，更优的替代方案应能够实现对内源性RB1功能的时间可控性失活，并提供一种最终可恢复其功能的替代机制。此类构建体的基础早在二十多年前已有描述1。然而，由于技术限制，早期方法缺乏对转基因激活、响应及组织特异性的调控机制。本研究首次将强力霉素（doxycycline, Dox）依赖性转录系统与溶酶体蛋白酶CB和Rb1蛋白的工程化转基因构建体相结合。由此建立的CBRb小鼠模型实现了通过Dox进行时间可控的RB1调控2。采用这种基于蛋白质组学的方法研究基因功能的优势在于，该方法可适用于任何目标基因，且对基因功能的先验知识要求极低。
所提出的显性负性（DN）转基因策略相较于传统方法具有诸多优势。首先，DN蛋白的抑制作用仅导致蛋白活性的部分消除，从而保留了一定的内源性表达水平。当完全消除蛋白活性会导致胚胎致死时，这种结果尤为理想，因为传统方法在研究基因功能时往往受限于无法在活体小鼠中进行深入探究。其次，TetO系统的存在使得转基因仅在抗生素存在时才被激活，从而实现对转基因活性的高效且可逆的调控。因此，通过停止抗生素给药，转基因系统即可被关闭，RB1的正常表达随之恢复。第三，转基因表达的特异性可根据所选启动子的不同而变化。尽管我们为验证原理选择了广泛表达的ROSA-CAG启动子，但若将该转基因置于组织特异性启动子的调控之下，则有望限制非预期的转基因表达，进而促进该转基因技术在治疗应用中的相关研究。

<table><tbody><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基，DMEM</td><td>GIBCO-BRL</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基伊格尔，MEME&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>M8042</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>F2442&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine&amp;nbsp;</td><td>DharmaFECT</td><td>T-2010-03</td><td></td></tr><tr><td>Sal I</td><td>Roche</td><td>11745622</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>Roche</td><td>13090730</td><td></td></tr><tr><td>CaspaTag&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>APT523</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>星形孢菌素</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>CyQuant NF 细胞增殖检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C35007</td><td></td></tr><tr><td>视网膜母细胞瘤 1 抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab6075</td><td></td></tr><tr><td>c-Myc 抗体</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>M5546</td><td></td></tr><tr><td>b-actin</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher scientific</td><td>MA5-14520</td><td></td></tr><tr><td>鬼笔环肽</td><td>Thermofisher scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>荧光微孔板读板仪</td><td>FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>落射荧光显微镜&amp;nbsp;</td><td>NikonEclipse80i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) 小鼠品系可从杰克逊实验室获取，编号为 JAX#032011。&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

可诱导且可逆的显性负效应（dn）蛋白抑制

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

显性负性（DN）蛋白抑制是一种调控蛋白功能的强有力方法，相较于其他基于基因组的策略具有多项优势。例如，尽管嵌合体和Cre-LoxP靶向策略已被广泛应用，但这些策略本身存在固有局限性（如启动子渗漏表达、Cre表达嵌合性等），显著限制了其应用范围。此外，许多内源性基因的完全敲除会导致胚胎致死，从而无法研究这些基因在出生后生命阶段中的功能。为应对这些挑战，我们对早期的基因工程方案进行了重要改进，将Rb1基因的短片段（转基因形式）与溶酶体蛋白酶前体组织蛋白酶B（CB）相结合，构建了一种Rb1基因的显性负性小鼠模型（CBRb）。由于含有溶酶体蛋白酶，整个CB-RB1融合蛋白及其相互作用复合物均被导向蛋白酶体介导的降解途径。此外，转基因结构中包含四环素诱导元件（rtTA），可实现对RB1蛋白的可诱导且可逆的调控。CBRb小鼠模型中存在广泛表达的ROSA-CAG启动子，使其成为一种有效的工具，可用于在几乎所有表达RB1的细胞类型中实现Rb1基因的瞬时且可逆的失活，为研究人员深入理解RB1的功能提供了重要资源。

通常，设计显性负性（DN）突变需要关于目标蛋白（POI）结构与功能的大量信息。相比之下，本文所介绍的DN策略在目标蛋白的结构与功能信息有限时尤为有用。如果目标蛋白为多聚体蛋白，则将其中一个亚基与溶酶体蛋白酶融合，可通过内源性亚基的蛋白水解以及多聚体向溶酶体的亚细胞定位转移，从而显性抑制组装完成的多聚体蛋白，并可能同时抑制其他配体。为验证克隆成功并检测Dox调控的转基因激活效果，将含有TetO-DN-CB-myc6-Rb1构建体的纯化pTet-Splice质粒转染至稳定表达rtTA蛋白但不表达Rb113的小鼠NIH3T3细胞中。在无Dox条件下，表达rtTA的细胞未显示RB1表达；而在加入Dox后，RB1表达显著增强（图2A）。接下来，为测试该系统的可逆性，我们将纯化的pTet-Splice/TetO-DN-CB-myc6-Rb1质粒与pCMV-Tet3G载体共转染至内源性表达Rb1</em...

本文介绍了一种显性负性可诱导系统的构建方案，该系统可通过可逆地过表达目标蛋白的显性负性突变体，从而实现对任意蛋白的条件性失活。

可诱导且可逆的显性负效应（DN）蛋白抑制

显性负性（DN）蛋白抑制是一种调控蛋白功能的有力方法，相较于其他基于基因组的技术，具有多项优势……

该方法有助于回答多个领域中的关键科学问题，这些领域需要通过可逆地过表达目标基因的显性负性版本，实现对该基因的条件性和瞬时失活。该技术的主要优势在于，它仅部分抑制蛋白活性，从而保留一定水平的内源性表达。尽管本文描述的是对在多聚复合体中发挥作用的RB蛋白进行条件性失活，但该方法同样适用于单体蛋白。我们的实验室技术员兼手稿共同作者 Umesh Pyakurel 将演示相关操作步骤。首先，按照供应商的说明，在 37°C、5%CO2 条件下，使用含有 10% 胎牛血清的推荐细胞培养基培养 NIH3T3 细胞。为使用 pTet-Splice 和 pCMV-Tet3G 载体共转染细胞，首先在 15 毫升离心管中每孔加入 2 至 4 微升脂质转染试剂和 1 毫升不完全 DMEM 培养基，混匀后于室温孵育 5 分钟。每孔加入两到三微克血浆 DNA 至该转染试剂的 DMEM 混合液中。混匀后于室温孵育 20 分钟。将含有 DNA 和转染试剂的 DMEM 混合液一毫升加入含 NIH3T3 细胞的六孔板的每孔中。在37摄氏度、5% CO2条件下孵育3至4小时后，每孔加入1毫升完全培养基。随后，每孔加入2微升多西环素储备液，并将培养板标记为加多西环素组。将细胞置于37摄氏度、5% CO2条件下继续孵育。为了评估 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 构建体在促进非程序性细胞增殖中的功能，将 HEI-OC1 细胞培养于含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基中，并置于允许性条件下。进行细胞增殖研究时，使用细胞计数仪对 HEI-OC1 细胞进行计数。将 10,000 个 HEI-OC1 细胞接种至 96 孔板中，每孔体积为 200 微升。在33摄氏度、5% CO2条件下过夜培养细胞。为诱导转基因表达，向转染的HEI-OC1细胞中的一部分加入终浓度为1微克/毫升的多西环素。另一部分标记为无多西环素组，同时设未转染的HEI-OC1细胞作为对照，均在33摄氏度、10% CO2条件下继续培养。为了评估细胞增殖，在转染后48小时，移除细胞培养基，并向微孔板的每个孔中加入100微升细胞增殖检测试剂盒中的1×染料结合溶液。按照生产商的说明书，在37摄氏度下孵育1小时。使用荧光微孔板读板仪测量每个样品的荧光强度。为了进一步通过免疫细胞化学评估细胞增殖，将HEI-OC1细胞接种于置于12孔板各孔中载玻片上，培养基为DMEM。在33摄氏度条件下孵育细胞过夜。次日，向其中两个孔的细胞共转染pTet-Splice和pCMV-Tet3G质粒，随后对其中一个孔的细胞进行与NIH3T3细胞相同的多西环素处理。使用一个未转染的孔作为对照。为进行Ki-67标记处理细胞，用含4%多聚甲醛的PBS在室温下固定10分钟。随后，用预冷的PBS于冰上洗涤三次，每次五分钟。在 PBS 中加入 0.25% 非离子型去垢剂，孵育 10 分钟。用 PBS 洗涤三次，每次五分钟。用 10% 血清封闭细胞。在室温下于湿化室中孵育一小时。加入500微升Ki-67一抗，4摄氏度孵育过夜。用PBS再次洗涤细胞三次，每次五分钟。加入1毫升二抗，室温避光孵育细胞1小时。移除二抗溶液后，在避光条件下用PBS再次洗涤细胞，每次5分钟，共洗三次。为用鬼笔环肽标记HEI-OC1细胞，将细胞在1:200稀释的鬼笔环肽溶液中室温孵育30分钟。为了标记细胞核，将细胞在室温下与每毫升5微克的DAPI孵育10分钟。在转基因小鼠出生后，使用针对CBRb1融合区域的特异性引物组对仔鼠进行基因型鉴定，具体方法见原文。将成年TetO-DN-CB-myc6-Rb1小鼠与ROSA-CAG-rtTA和四环素诱导系小鼠交配以获得实验用DN-CBRb小鼠，并按照原文所述方法对其后代进行基因型鉴定。NIH3T3 细胞不表达内源性 RB1 蛋白，因此此处观察到的强 RB1 表达是由于在存在多西环素（Dox）时转基因被诱导表达，而在无多西环素时则无表达，这证实了 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 混合 RB1 构建体的有效激活。相比之下，HEK293 细胞具有内源性 RB1 表达。添加多西环素后导致 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 激活并引起 RB1 下调。在培养基中去除多西环素21小时后，RB1的表达恢复。与未用多西环素处理的转染细胞以及未转染细胞相比，共转染相同载体的HEI-OC1细胞在多西环素处理后显示出细胞数量适度但显著的增加。荧光原位杂交证实了TetO-DN-CB-myc6-RB1转基因在小鼠基因组中的插入。与对照组相比，经多西环素处理3天的转基因小鼠耳蜗中RB1总蛋白表达量最初有所增加。然而，在经多西环素处理7天和10天的组别中，RB1表达量显著降低。无论分析何种组织，经多西环素处理的转基因小鼠均表现出RB1蛋白的显著减少，而对照组则无此变化，从而证实了TetO-DN-CB-myc6-RB1构建体的有效性。在进行该操作时，重要的是要验证转基因中各个编码元件彼此之间的读码框是否正确。如果本报告中所述的组织蛋白酶B（Cathepsin B）和视网膜母细胞瘤基因（retinoblastoma）的编码区偶然以错误的读码框连接，则无法产生预期的融合蛋白。因此，在将转基因注入单细胞小鼠胚胎之前，必须进行DNA序列验证。通过此操作，可用特定启动子替换普遍存在的 CAG 启动子，从而以细胞特异性方式研究基因功能。

inducible-and-reversible-dominant-negative-dn-protein-inhibition

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

诱导和可逆显性阴性 (dn) 蛋白抑制

一种快速、简便的方法，可生成具有可诱导且可逆的cDNA过表达或shRNA介导的目标基因敲低的人源细胞系。该方法使研究人员能够可靠且高度可重复地操控那些难以通过瞬时转染方法或传统敲低/敲除策略进行改造的细胞系。...

建立可稳定表达四环素诱导型（Tet-on）shRNA或cDNA的人源细胞系

本文所述方法用于在特定步骤诱导凋亡信号级联反应，以解析抗凋亡细菌效应蛋白的活性。该方法也可用于诱导表达促凋亡或毒性蛋白，或用于研究对其他信号通路的干扰作用。...

应用可诱导表达系统研究细菌毒力因子对细胞内信号通路的干扰

我们在此描述一种利用位点特异性、可逆的系统 体内 蛋白阻断导致复制叉停滞和崩溃...

在 E. coli 中利用荧光阻遏蛋白-操纵子系统诱导位点特异性复制阻滞

本方案旨在介绍如何在癌细胞系中建立功能性Tet-ON系统，并进一步应用该系统，特别是用于研究肿瘤细胞来源的蛋白质在单核细胞/巨噬细胞向肿瘤微环境募集过程中的作用。...

在癌细胞系中条件性敲低基因表达以研究单核细胞/巨噬细胞向肿瘤微环境的募集

本方案概述了构建一种模型系统所需的步骤，该系统可利用增强型lac阻遏蛋白和/或tet激活蛋白系统，在活体动物或细胞中条件性地调控目的内源基因的转录。...

体内应用REMOTE-控制系统调控内源性基因表达

靶向DNA表观基因组编辑是一种强大的治疗策略。本方案描述了用于人诱导性多能干细胞（hiPSC）来源神经元表观基因组编辑的、携带CRISPR-dCas9-DNMT3A转基因的一体化慢病毒载体的制备、纯化与浓缩过程。...

用于高效递送表观基因组编辑工具至人诱导性多能干细胞衍生疾病模型的慢病毒载体平台

本文介绍了一种基于小分子 Shield-1...

一种利用条件性 Cas9 稳定化评估基因功能的新工具包

利用圆二色光谱法描述了ATP依赖性染色质重塑因子与DNA配体之间的相互作用。通过产生的峰分析基因启动子上发生的诱导构象变化，可用于理解转录调控的机制。...

利用圆二色光谱研究DNA-蛋白质相互作用

在此，我们提出一种用于 体外...

体外筛选靶向表观遗传沉默的工程化转录抑制因子

本研究描述了一种利用T7系统在单个质粒上共表达多个基因的方法 大肠杆菌 使用 pMGX...

可诱导的T7 RNA聚合酶介导的多基因表达系统，pMGX

学习利用可诱导显性阴性系统对蛋白质进行条件性失活的方法，适用于多聚体和单体蛋白研究。该技术通过可逆过表达显性阴性突变体实现部分活性敲除，保留内源性残余表达，为神经科学和细胞生物学领域的蛋白质功能分析提供可靠工具。

可诱导且可逆的显性负效应（DN）蛋白抑制

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