Name: 成人小鼠成纤维细胞对红细胞生成子细胞的直接线重编程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: 学习通过转录因子驱动的直接谱系重编程技术，将小鼠尾尖成纤维细胞转化为红细胞生成子细胞的方法。该技术可简化细胞命运研究，为体外红细胞生产及输血医学研究提供新途径。

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我们感谢伊芙琳·王（Evelyn Wang）和格雷戈里·海德（Gregory Hyde）（美国马萨诸塞州剑桥市怀特黑德研究所）在克隆工作中的贡献，以及哈维·洛迪什（Harvey Lodish）（怀特黑德研究所）提供了用于构建逆转录病毒文库的多种质粒。我们感谢卡维塔·西瓦（Kavitha Siva）和索菲·辛布兰特（Sofie Singbrant）（隆德大学分子医学与基因治疗系）、戈兰·卡尔松（Göran Karlsson）和沙米特·索内吉（Shamit Soneji）（隆德大学分子血液学系）在iEP制备方法描述中的贡献。我们还要感谢并感谢胡利安·普莱西奥（Julian Pulecio）（巴塞罗那生物医学研究园再生医学中心）、维奥莱塔·雷昂-斯特拉达（Violeta Rayon-Estrada）（纽约洛克菲勒大学）、卡尔·沃克利（Carl Walkley）（墨尔本大学圣文森特医院医学系及圣文森特医学研究所）、安赫尔·拉亚（Ángel Raya）（巴塞罗那高等科研研究院）以及维贾伊·G·桑卡拉南（Vijay G. Sankaran）（麻省理工学院与哈佛大学布罗德研究所，剑桥市）在本研究早期工作中所做出的贡献。本研究得到了拉格纳·瑟德贝里基金会（资助J.F.）；瑞典研究理事会（资助J.F.）；奥勒·恩奎斯特建筑大师基金会（Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare，资助J.F.）；瑞典战略研究基金会（资助J.F.）；厄克·维伯格基金会（Åke Wiberg's Foundation，资助J.F.）；以及玛丽·居里整合资助（Marie Curie integration grant，资助J.F.）的支持。

1. 小鼠尾尖原代成纤维细胞培养物的建立与维持
<ol>
	<li>通过在培养皿表面覆盖0.1%明胶，并在37 °C下孵育约20分钟，制备明胶包被的培养皿（建议每条尾使用一个10 cm培养皿）。吸除培养皿中的明胶溶液，并使其干燥至少2小时。</li>
	<li>通过颈椎脱位法处死小鼠。用剪刀从尾根部剪下尾部。将尾部置于含2%胎牛血清（FBS）的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中，待用。 
	注意：为获得最佳结果，应使用约6至8周龄的小鼠尾部。虽然也可使用超过8周龄的小鼠尾部，但随着小鼠年龄增长，成纤维细胞的增殖能力及重编程效率会下降11。</li>
	<li>本方案后续所有步骤均需在无菌条件下于组织培养超净台中进行。配制0.02%胰蛋白酶-EDTA的DPBS稀释液，并向未包被的10 cm培养皿中加入5 mL。</li>
	<li>先用70%乙醇洗涤尾部，再用DPBS洗涤。将尾部平放在培养皿中，用镊子固定。沿尾部纵轴从根部至尖端做一切口。</li>
	<li>用一对镊子夹住尾部并垂直固定。用另一对镊子夹住切口旁尾根部的皮肤，将其向后剥离。在切口两侧均进行此操作，直至可通过向尾尖方向下拉将皮肤完全剥离。</li>
	<li>用镊子夹住去皮的尾部，置于含胰蛋白酶溶液的培养皿上方，将尾部切成约1 cm长的小段。将尾段放入胰蛋白酶溶液中，用剪刀进一步剪碎成更小的组织块。在37 °C下将尾段于胰蛋白酶溶液中孵育10分钟。 
	注意：组织块越小越好，以提供更高的表面积与体积比。</li>
	<li>加入2倍体积的成纤维细胞扩增（FEX）培养基（高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），含15% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸（NEAA）和100 U/mL青霉素/链霉素）以终止胰蛋白酶反应。</li>
	<li>将培养皿中全部内容物转移至50 mL离心管中，在4 °C下以350 × g离心5分钟。吸除上清液，用10 mL新鲜FEX培养基重悬尾部组织碎片。</li>
	<li>将含组织碎片的培养基转移至明胶包被的培养皿中，在37 °C、5% CO2和4% O2条件下孵育，每2天更换一次新鲜FEX培养基。 
	注意：5至7天后，尾部组织碎片将贴附于培养皿底部，可见成纤维细胞从组织块向外迁移。</li>
	<li>一旦观察到成纤维细胞集落，轻轻振荡培养皿以松动尾部组织碎片，吸除培养基及所有骨碎片，保留贴壁的成纤维细胞。加入新的FEX培养基，继续培养成纤维细胞至完全汇合。</li>
	<li>为确保成纤维细胞不被造血祖细胞污染，使用1×胰蛋白酶-EDTA消化5分钟使细胞脱离培养皿，收集细胞。利用磁性分离系统去除表达造血标志物（CD117、CD5、CD45R（B220）、CD11b、抗Gr-1（Ly-6G/C）、7-4和Ter-119）的细胞10。</li>
</ol>
2. 逆转录病毒的制备
<ol>
	<li>将逆转录病毒包装细胞以约 2.5 × 104 个细胞/cm2 的密度（10 cm 培养皿接种 2.0 × 106 个细胞）接种于经组织培养处理（真空-气体等离子体处理）的培养皿中，在含 10% 胎牛血清（FBS）、10 mM 丙酮酸钠和 100 U/mL 青霉素/链霉素的高糖 DMEM 培养基中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养过夜。</li>
	<li>次日上午，更换为不含添加剂的 DMEM 培养基，体积为过夜培养时的一半（10 cm 培养皿使用 5 mL）。下午检查细胞融合度是否达到 70–80%，随后开始转染。</li>
	<li>针对每个重编程因子 Gata1、Tal1、Lmo2 和 c-Myc，分别配制表达载体（pMX）与辅助载体（含 gag 和 pol 基因）的 2:1 混合物。对于一个 10 cm 培养皿的成纤维细胞，使用 6 µg 表达载体和 3 µg 辅助载体，最终体积为 100 µL 的 DMEM 培养基。</li>
	<li>针对每个重编程因子，在无菌聚苯乙烯管中准备 300 µL 室温（RT）DMEM 培养基，并小心加入 27 µL 商业转染试剂。 
	注意：转染试剂需提前恢复至室温，且必须直接加入培养基中，因其静电特性可能导致其粘附在管壁塑料表面。</li>
	<li>将质粒混合物加入含转染试剂的管中，短暂涡旋混匀，室温孵育 15 分钟。再次短暂涡旋后，将转染试剂-DNA 混合物逐滴加入逆转录病毒包装细胞中，确保混合物均匀分布于整个培养表面，随后于 37 °C 培养过夜。</li>
	<li>转染 24 小时后，更换为含 20% FBS 和 100 U/mL 青霉素/链霉素的 DMEM 培养基。转染 48 小时后，收集上清液，并通过 0.22 µm 孔径的注射器滤器过滤。 
	注意：病毒上清液可冻存于 -80 °C 备用，但使用新鲜制备的病毒上清液进行转导效率更高。</li>
</ol>
3. GTLM 转导与 iEP 收获
<ol>
	<li>将尾尖成纤维细胞以 1 × 104 个细胞/cm2 的密度接种于预先用 0.1% 明胶包被的培养皿中，加入 FEX 培养基，在 37 °C 下培养 24 小时。</li>
	<li>次日，按如下方法配制转导混合液：
	<ol>
		<li>每种重编程因子的病毒上清取 1 体积，加入逆转录病毒感染试剂至终浓度为 4 µg/mL（占 40%），再加入 6 体积的 FEX 培养基（占 60%）。</li>
		<li>对于一个 10 cm 培养皿的成纤维细胞，将每种病毒上清各 1 mL（共 4 种病毒，总计 4 mL），加入逆转录病毒感染试剂至终浓度为 4 µg/mL，再加入 6 mL FEX 培养基，最终得到 10 mL 转导混合液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸除成纤维细胞培养皿中的 FEX 培养基，更换为转导混合液。在低氧条件下（5% CO2 和 4% O2），37 °C 孵育 4 小时进行转导。</li>
	<li>吸除转导混合液，更换为新鲜的重编程培养基（无血清扩增培养基（SFEM）、100 U/mL 青霉素/链霉素、100 ng/mL 小鼠干细胞因子（mSCF）、10 ng/mL 小鼠白细胞介素-3（IL3）、2 U/mL 人重组促红细胞生成素（hrEPO）以及 100 nM 地塞米松）。</li>
	<li>在低氧条件下 37 °C 继续孵育 8 天，每 2 天更换一次新鲜重编程培养基。5 至 8 天后，成功重编程的细胞将形成从培养皿表面脱离的细胞簇。</li>
	<li>为收集用于分析的重编程细胞，可轻柔吹打直接从培养皿中收获细胞。为收获未转导的成纤维细胞作为对照，使用 1× 胰蛋白酶-EDTA 将细胞从培养皿上消化并收集。</li>
</ol>

<ol><li>Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+We+Really+Vastly+Outnumbered%3F+Revisiting+the+Ratio+of+Bacterial+to+Host+Cells+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans.</a> Cell. 164 (3), 337-340 (2016).</li>
<li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing%2C+tripotent+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).</li>
<li>Szabo, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21057492">Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors.</a> Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).</li>
<li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).</li>
<li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).</li>
<li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+fibroblasts+into+bipotential+hepatic+stem+cells+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).</li>
<li>Hendry, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+transcriptional+reprogramming+of+adult+cells+to+embryonic+nephron+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).</li>
<li>Vierbuchen, T., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+conversions%3A+unnatural+but+useful%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Direct lineage conversions: unnatural but useful.</a> Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).</li>
<li>Capellera-Garcia, S., Flygare, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+reprogramming%3A+a+useful+addition+to+the+blood+cell+research+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox.</a> Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).</li>
<li>Capellera-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+Minimal+Factors+Required+for+Erythropoiesis+through+Direct+Lineage+Conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion.</a> Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).</li>
<li>Mahmoudi, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+reprogramming%3A+a+two-way+street%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Aging and reprogramming: a two-way street.</a> Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).</li>
<li>Singbrant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+couples+erythropoiesis%2C+B-lymphopoiesis%2C+and+bone+homeostasis+within+the+bone+marrow+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment.</a> Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).</li>
<li>Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+visualization+and+conditional+mutations+in+the+erythroid+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage.</a> Blood. 104 (3), 659-666 (2004).</li>
<li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li>
<li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83(2016).</li>
<li>Pulecio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Conversion+of+Fibroblasts+to+Megakaryocyte+Progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors.</a> Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).</li>
<li>Kurita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+immortalized+human+erythroid+progenitor+cell+lines+able+to+produce+enucleated+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells.</a> PLoS One. 8 (3), 59890(2013).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

过表达四种因子的混合物， GATA1,&#160;TAL1,&#160;LMO2,&#160;和 c-MYC（GTLM）足以将小鼠和人类成纤维细胞直接重编程为诱导性表皮细胞（iEPs）10重编程的红系细胞在形态和功能上与 真正 在形态学、表型、基因表达和集落形成能力方面，红系祖细胞均表现出相应特征。该发现印证了利用直接重编程作为解析造血发育因子工具的合理性。为验证该方法的普适性，iEPs亦可通过GTLM诱导小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞生成，表明该技术适用于不同来源及跨物种的成纤维细胞。10在本报告中，我们利用红系谱系示踪小鼠的成纤维细胞诱导重编程，作为一种可视化其向红系细胞转化的工具。该小鼠模型的使用对本实验方案具有辅助作用，但并非关键。我们常规使用来自不同小鼠品系的多种成纤维细胞进行重编程，并通过细胞表面标志物...

红细胞（RBCs）在所有脊椎动物中均至关重要，占人体全部细胞的84%1从胚胎期到成年期，人类健康高度依赖于红细胞稳态的精确调控。在整个发育至成年过程中持续生成成熟红细胞的过程被称为红细胞生成。红细胞生成研究中的一个主要挑战是明确调控红细胞发育以及原始与定型红细胞生成之间转换的关键主控因子。对红系祖细胞进行直接谱系重编程，为深入理解红系发育提供了新的机遇。 体内.
直接谱系重编程（DLR），亦称为转分化，是指将一种细胞类型直接重编程为另一种细胞类型，从而绕过多能性及多潜能祖细胞阶段的过程。迄今为止，DLR 已被用于生成多种细胞类型，包括神经细胞2，造血的3,4,5肝的6 和肾病性7，祖细胞。对于发育生物学家而言，DLR 已成为研究谱系承诺和终末分化过程的重要工具8,9DLR 可以补充并部分替代 体内 用于研究发育过程中细胞命运决定因子机制的研究。本文所述的将细胞重编程为红系祖细胞的DLR方案，为红细胞生成发育研究领域提供了一种互补的方法。
我们先前已证明，过表达一种四因子混合物， GATA1, TAL1, LMO2 和 c-MYC（GTLM）足以将小鼠和人类成纤维细胞直接重编程为诱导性红系祖细胞（iEPs）10GTLM重编程的红系细胞在形态和功能上与 真正有效的 在形态学、表型和基因表达方面的原始红系祖细胞10因此，iEPs的增殖能力有限，并能成熟为有核红细胞，类似于在确定性红细胞生成开始前早期胚胎中短暂产生的红细胞。通过改变重编程条件（例如， 重编程因子中的点突变或其他因子的添加），可以理解这些变化如何影响红系发育与分化。例如，我们已证明添加 Klf1 或 Myb 加入GTLM鸡尾酒后，珠蛋白的表达模式从以胚胎型（原始型）为主转变为以成体型（定型）为主。该结果验证了使用DLR作为红细胞生成过程中发育因子研究工具的有效性。
在此，我们概述了从小鼠尾尖成纤维细胞（TTF）生成诱导性红系祖细胞（iEPs）的过程。在我们的代表性结果中，我们对红系谱系示踪小鼠的成纤维细胞进行了重编程Epor-Cre R26-eYFP），其可表达黄色荧光蛋白（eYFP） Rosa26 所有表达促红细胞生成素受体的细胞中均存在该基因座，从而可直观地观察红系谱系的定向分化。利用该方法，转导后第5天即可检测到黄色荧光蛋白阳性（EpoR+）细胞。因此，本方案提供了一种快速且可靠的红系祖细胞制备技术 体外.

<table><tbody><tr><td>不含丙酮酸钠的DMEM</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td>PhGP细胞培养基</td></tr><tr><td>含丙酮酸钠的DMEM</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td>尾尖成纤维细胞培养基</td></tr><tr><td>StemSpan无血清扩增培养基（SFEM）</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>9650</td><td>重编程培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清 HyClone</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30071.03HI</td><td>生长因子</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 HyClone（100倍浓度）</td><td>Ge Life Sciences</td><td>SV30010</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>非必需氨基酸（100倍浓度）</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td>SNL培养基中添加此成分</td></tr><tr><td>胰蛋白酶 HyClone（1倍浓度）</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30042.01</td><td>细胞解离试剂</td></tr><tr><td>小鼠干细胞因子（mSCF）</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>添加至重编程培养基</td></tr><tr><td>重组小鼠白细胞介素-3（Murine Il-3）</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td>添加至重编程培养基</td></tr><tr><td>人重组促红细胞生成素（hrEPO）</td><td>Peprotech</td><td>100-64</td><td>添加至重编程培养基</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma</td><td>50-02-2&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>添加至重编程培养基</td></tr><tr><td>猪皮来源明胶</td><td>Sigma</td><td>9000-70-8&amp;nbsp;</td><td>溶于dH₂O中，用于包被培养板。使用前确保无菌。</td></tr><tr><td>杀稻瘟菌素S盐酸盐</td><td>Sigma</td><td>3/9/3513</td><td>筛选抗生素，对原核和真核细胞均有作用</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Ge Life Sciences</td><td>SH30850.03</td><td>用于洗涤步骤</td></tr><tr><td>聚凝胺（Polybrene）</td><td>Merck</td><td>TR-1003-G</td><td>感染/转染&amp;nbsp;试剂</td></tr><tr><td>FuGENE HD 转染试剂</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>PhGP细胞系的转染试剂</td></tr><tr><td>Millex-GP 针筒式滤器，0.22 &amp;micro;m</td><td>Merck</td><td>SLGP033RS</td><td>用于过滤病毒上清液</td></tr><tr><td>BD Emerald 皮下注射针筒</td><td>Becton Dickinson</td><td>SKU: 307736</td><td>用于过滤病毒上清液</td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Falcon</td><td>10799541</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>珠宝商镊子 #5</td><td>Sklar</td><td>66-7642</td><td>用于处理小段尾组织</td></tr><tr><td>Sklarlite 睫状体剪刀</td><td>Sklar</td><td>23-1149</td><td>用于将尾部剪成小片段</td></tr><tr><td>小鼠谱系细胞耗竭试剂盒（Lineage Cell Depletion Kit, mouse）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>用于耗竭成纤维细胞培养中的造血细胞</td></tr><tr><td>CD117 MicroBeads，小鼠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-224</td><td>用于耗竭成纤维细胞培养中的造血细胞</td></tr><tr><td>PheonixGP细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3215</td><td>逆转录病毒包装细胞系</td></tr><tr><td>EcoPAC 载体（pCL-Eco）&amp;nbsp;</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-29540</td><td>含有gag和pol基因的逆转录病毒辅助载体</td></tr><tr><td>pMX-Gata1</td><td>实验室克隆</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMX-Tal1</td><td>实验室克隆</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMX-Lmo2</td><td>实验室克隆</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMX-cMyc</td><td>实验室克隆</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellSens Standard 1.6 软件&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>细胞离心涂片分析软件</td></tr></tbody></table>

成年小鼠成纤维细胞直接谱系重编程为红系祖细胞

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

红系细胞的命运决定与分化过程通过激活一组由特定谱系限制性转录网络所调控的细胞命运决定因子和成熟因子来实现。我们先前致力于确定通过直接谱系重编程将成纤维细胞转化为诱导性红系祖细胞/前体细胞（iEPs）时，指导红细胞发育所需的最小因子组合。我们已证明，过表达 Gata1, Tal1, Lmo2，以及 c-Myc (GTLM) 能够快速将小鼠和人类成纤维细胞直接转化为类似于内胚层前体细胞（iEPs）的细胞 真正有效的 在形态、表型和基因表达方面与红系细胞相似。我们预期诱导性红系前体细胞（iEPs）将成为研究红细胞生成及细胞命运调控的宝贵工具。本文中，我们描述了将小鼠尾尖成纤维细胞逐步转化为iEPs的过程。 通过 转录因子驱动的直接谱系重编程（DLR）。在此示例中，我们使用表达黄色荧光蛋白（YFP）的红系谱系示踪小鼠的成纤维细胞进行重编程，其中YFP在促红细胞生成素受体基因（EpoR）启动子的调控下表达，从而可在重编程过程中可视化红系细胞命运的诱导。按照本方案，成纤维细胞可在5至8天内被重编程为诱导性红系前体细胞（iEPs）。 
尽管该过程仍有改进空间，但我们证明了GTLM介导的重编程是一种快速且直接的方法，可获得具有以下特性的细胞： 真正 红系祖细胞和前体细胞

本文介绍了一种利用转录因子驱动的直接谱系重编程（DLR）技术，从成体成纤维细胞中可重复地生成诱导性红系祖细胞（iEPs）的实验方案。我们通过流式细胞术、集落形成实验以及基因表达分析对细胞重编程效果进行了评估。为了便于观察向红系细胞命运的转变过程，我们在具有红系谱系示踪系统的转基因小鼠（Epor-Cre R26-eYFP）来源的成纤维细胞上进行重编程。该小鼠模型中，所有在发育任何阶段表达促红细胞生成素受体（Epor，其中一个等位基因的内源性Epor位点插入了Cre）转录本的细胞，均会在Rosa26位点表达黄色荧光蛋白（eYFP）12,13（图1A）。在成功诱导生成红系祖细胞后，转导后第5天即可观察到YFP阳性（EpoR+）细胞。重编程第5天时，细胞变为圆形，从培养板表面脱离并开...

本文介绍了利用转录因子驱动的直接谱系重编程（DLR）技术，从小鼠成体成纤维细胞诱导生成诱导性红系祖细胞（iEPs）的实验方案。

红系细胞的承诺与分化通过激活由一组细胞特异性转录因子协调调控的谱系限制性转录网络而进行。

从成纤维细胞直接谱系重编程为红系祖细胞。这是我们实验室开发的一种新方法，旨在更深入地研究决定红系细胞命运的转录调控过程。利用直接谱系重编程来研究发育的主要优势在于，该技术非常简便直接。因此，与例如基因敲除小鼠中的功能缺失研究相比，我们可以更简便地操控该因子，在特定时间点过表达它，并快速获得足够的材料，用于研究其下游效应，如染色质修饰或基因表达变化。尽管该方法聚焦于将小鼠尾尖成纤维细胞重编程为红系祖细胞，但它也可应用于其他类型的成纤维细胞以及其他物种，包括人类。该技术的应用前景延伸至输血医学领域，因为它为体外生成红细胞开辟了新的途径。演示该操作的是我研究团队的 Alban Johansson。首先用0.1%明胶覆盖培养皿表面，在37°C下孵育约20分钟。吸除明胶溶液，让培养皿自然干燥。使用剪刀在已安乐死的小鼠尾部基部剪断以去除尾巴。将尾部置于含2% FBS的DPBS中，待用时取出。在无菌条件下于组织培养超净台中，配制含有0.02%胰蛋白酶EDTA的DPBS稀释液，并向未包被的10厘米培养皿中加入5毫升。在组织培养超净台中，将尾部置于15毫升离心管中，用足量70%乙醇浸没洗涤，随后用DPBS洗涤。将尾部平放在培养皿中，用镊子固定其位置。使用手术刀沿尾部纵轴从基部到尖端做一切口。用一对镊子夹住尾部并垂直固定，再用另一对镊子夹住尾基部切口旁的皮肤，将其向后剥离。在切口两侧均进行此操作，直至皮肤可通过向尾尖方向向下拉扯而完全脱去。用镊子夹住去皮的尾部，置于含有胰蛋白酶溶液的培养皿上方。使用解剖剪将尾部剪成小段，再用剪刀将这些组织块在胰蛋白酶溶液中进一步剪碎成更小的碎片，随后于37°C孵育10分钟。为了终止胰蛋白酶反应，加入两倍体积的FEX培养基（含补充物和抗生素的DMEM）。将培养皿中的全部内容收集至一个50毫升离心管中。在4摄氏度条件下，以350 ×g离心5分钟。吸弃上清液，将含有尾部片段的沉淀重悬于 10 毫升新鲜 FEX 培养基中。将此悬液转移至明胶包被的培养皿中。在 37 摄氏度、5% 二氧化碳和 4% 氧气条件下培养，每两天添加一次新鲜 FEX 培养基。在培养五到七天后观察，此时尾部组织碎片已贴附于培养皿底部，成纤维细胞正从碎片向外迁移。一旦可见成纤维细胞形成的细胞簇，轻轻摇晃培养皿以使尾部组织碎片脱落。用移液器吸除含有所有骨碎片的培养基，保留贴壁的成纤维细胞。加入10毫升新鲜FEX培养基，将成纤维细胞培养至融合。为确保成纤维细胞培养物中无造血祖细胞污染，使用胰蛋白酶EDTA按照文中所述方法将细胞从培养板上消化下来。加入培养基收集细胞，并加入连接有抗体的磁珠。使用磁性分离系统去除表达造血标志物的细胞。包含此步骤至关重要，因为它可清除培养物中可能存在的任何造血干细胞和祖细胞（HSPCs），从而避免在流式细胞术分析当天出现假阳性结果。将逆转录病毒包装细胞接种于经组织培养处理的培养皿中，密度约为每平方厘米25,000个细胞。将细胞在高糖DMEM培养基中，于37摄氏度及5%二氧化碳条件下孵育过夜。次日早晨，移除培养基，并加入前一晚用于培养细胞体积一半的无添加成分的DMEM培养基。下午检查细胞融合度，转染所需细胞融合度应为70%至80%。开始转染时，为每种重编程因子配制六微克表达载体PMX与三微克辅助载体（包含Gag、Pol和包膜基因）的2:1混合物。接着，为每种重编程因子，在无菌聚苯乙烯管中加入300微升室温DMEM培养基。然后，将27微升室温商品化转染试剂小心地直接加入培养基中，避免接触管壁。将质粒混合物加入含有转染试剂的离心管中。短暂涡旋振荡，并在室温下孵育15分钟。再次涡旋振荡转染试剂与DNA的混合物。将溶液逐滴加入逆转录病毒包装细胞中，使其均匀覆盖整个培养物，并在37摄氏度下孵育。转染后24小时，移除培养基，加入含20%胎牛血清和100单位/毫升青霉素-链霉素的DMEM培养基。转染后48小时，收集上清液，并通过孔径0.22微米的一次性针头滤器过滤。开始转导时，将尾尖成纤维细胞以每平方厘米10,000个细胞的密度接种于预先用0.1%明胶包被的培养皿中，使用FEX培养基。在37摄氏度下孵育24小时。执行此步骤时，重要的是要以相等比例加入四种逆转录病毒上清液，以确保四个转座基因在重编程过程中发挥均等作用。次日，通过将每种重编程因子对应的一份病毒上清液与每毫升含四微克逆转录病毒感染试剂的六份FEX培养基混合，制备转导混合液。随后，吸除成纤维细胞培养物中的FEX培养基，并加入转导混合液。在37摄氏度、5%二氧化碳和4%氧气的低氧条件下，孵育转导反应四小时。4小时后，吸除转导混合液，并加入新鲜的重编程培养基。在37°C低氧条件下培养8天，每2天更换一次新鲜重编程培养基。观察到细胞成功重编程后，可见细胞簇从培养板上脱落。为了从培养皿中收获重编程细胞以进行后续分析，需轻柔地吹打细胞使其悬浮，然后收集细胞。诱导性红系前体细胞（iEPs）成功重编程后，转导后第5天即可观察到YFP阳性细胞。这些细胞逐渐变圆，从培养板表面脱离，开始聚集成簇，并呈现出类似红系前体细胞的形态特征。通过联苯胺染色呈阳性，可明显观察到部分细胞发生血红蛋白化。少量细胞表达红系特异性表面标志物 TER-119。至第 8 天，可见较大的 YFP 阳性细胞簇。第8天的iEPs比第5天的iEPs具有更分化的红系表型。它们的体积显著更小，血红蛋白积累更多，并且TER-119的表达增加。通过qPCR对第8天收集的iEPs进行基因表达分析显示，这些细胞几乎完全关闭了成纤维细胞基因的表达，同时上调了多种红系基因的表达。对重编程细胞进行BFU-e集落形成实验后，第8天的iEPs形成两种类型的集落，分别为明显呈红色和无可见红色的集落。来自红色集落的细胞表现出成红血球样形态，而来自非红色集落的细胞则无此形态特征。大约每1,000个第5天的iEPs中有一个可形成红色集落，而第8天的iEPs中仅约每10,000个细胞中有一个形成红色集落。尾尖成纤维细胞（TTF）的重编程效率受传代次数的影响。传代九次的TTF产生iEP细胞簇的能力相较于传代三次的细胞显著下降。此外，不同的培养条件也会影响重编程的效率。在常氧条件下培养的转导TTFs重编程速度明显较慢，通常在10天后才观察到IEP集落，而非5至8天。完成该操作后，可采用集落形成实验、qPCR和FACS分析等方法，以确定细胞的分化状态。自建立以来，该技术为红细胞生成领域的研究人员理解小鼠和人类原始型与确定型红系细胞之间的转换机制提供了重要途径。

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发育生物学

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