Name: 蛋白质抗原对羊的免疫和抗原特异性单域抗体的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: 了解羊驼单域抗体制备方法，通过免疫接种、血液采集和噬菌体展示技术，从单个动物同时获得针对多达五种不同蛋白的抗体。该技术为治疗性抗体和诊断试剂开发提供高效平台。

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本工作由美国国立卫生研究院（P30GM103486）资助。

所有羊驼实验操作均依照肯塔基大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的协议（2017-2627 和 2018-2925）进行。
1. 抗原特异性羊驼抗体的制备
<ol>
	<li>羊驼的饲养管理与一般注意事项
	<ol>
		<li>获得适当的机构和/或监管批准。</li>
		<li>获取年龄小于10岁的成年羊驼，体况评分至少为3.0（评分范围1-5）12由于它们是群居动物，应至少饲养两只，最好饲养三只在一起。 
		注意： 建议使用雄性，因为通常情况下，雄性性情更稳定，更易于操作。</li>
		<li>通过兽医检查评估动物健康状况，包括审查饮食、饲养、疫苗接种和寄生虫防控方案13确保动物根据专业兽医建议，接种与其所在地区地理环境相适应的最新疫苗。根据动物来源群体的历史记录及具体当地条件，与兽医协商制定体外和体内寄生虫防控方案。13.</li>
		<li>至少适应一周，包括佩戴头笼训练和适应束缚。</li>
		<li>采集4 mL血液样本以获取血清，用作免疫前对照（见步骤1.4）。将血清分装为每份0.5 mL，冻存于-20 °C。 
		注意： 此时可额外采集血液用于全血细胞（CBC）分析，以监测动物的初始健康状况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗原制备
	<ol>
		<li>将纯化的蛋白质抗原溶于磷酸盐缓冲液（PBS）或HEPES缓冲液（HBS）中，并浓缩至浓度≥1 mg/mL。完成整个实验流程（包括免疫、筛选及克隆验证）大约需要3 mg蛋白质。 
		注意： 骆驼科抗体对蛋白质抗原具有高特异性和选择性，但通常不适用于无固定结构的蛋白质或通常无固定结构的肽类抗原。</li>
		<li>确定抗原纯度，以纯度 &#62;90% 目标纯度。采用 SDS-PAGE 等分析方法。 
		注意： 其他蛋白质的严重污染可能导致筛选过程中出现问题，使得单域抗体结合到污染物而非目标蛋白上。</li>
		<li>准备含有总量为100 µg抗原的冷冻分装样品。2 mg/mL浓度的溶液取50 µL最为理想；1 mg/mL浓度的溶液取100 µL为适用于免疫接种的最稀蛋白溶液。若抗原不能经受冻融过程，但已知在溶液中长期稳定，则可保存于4 °C。 
		注意： 为确保抗原能够耐受冻融循环，取20 µL抗原分装至薄壁PCR管中，于液氮中速冻。解冻后进行高速离心，通过比较冻融前后紫外/可见光吸收值或进行SDS-PAGE凝胶电泳，验证抗原的定量回收率。若条件允许，还应检测抗原在冻融后是否保留生物学活性。若冻融循环测试成功，则将剩余抗原以100 µL分装，速冻后于-80 °C保存。若冻融过程中出现问题，可重复该方案并加入最高至20%的甘油。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫接种
	<ol>
		<li>将最多五种抗原各200 µg与佐剂混合，终体积为300至1,000 µL。佐剂应占终体积的≥50%，以水作为稀释液。 
		注意： 若需使用缓冲液，可采用 HEPES、MOPS 或甘氨酸。pH 值在 5 至 6 之间通常比严格中性更有利于实验。避免使用磷酸盐或柠檬酸盐等多价离子，因其可能引发凝集。</li>
		<li>用电推剪沿羊驼颈部基部从一侧肩部到另一侧肩部修剪成新月形，以暴露靠近下颌淋巴结的区域。</li>
		<li>用22 G针头握住羊驼颈部，沿颈部基部靠近下颌淋巴结处缓慢皮下注射抗原。每间隔约5 cm进行一次注射，共注射五次，每次约200 µL（或更少）。 
		注意： 在注射过程中，应由第二名工作人员固定动物。对羊驼进行注射和采血时需格外小心，因为它们不仅会从后方，还会从侧面踢人。在操作过程中，将动物以群体形式近距离安置为最佳选择。由于羊驼是群居动物，在群体中会更加镇定，因此操作时所需的约束力度也相对较小。</li>
		<li>注射后观察动物约 20 分钟，注意有无过敏反应迹象（参见步骤 1.6）。每周监测注射部位是否出现局部炎症，使用推荐的佐剂时不应出现此类反应。确保注射部位的血液渗出不过量。</li>
		<li>每周进行一次加强免疫注射，连续五次，每次使用混合抗原各100 µg。根据季节情况，可能需要每周剪除注射部位的毛发。在秋季和冬季，动物的毛发生长较快。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采血
	<ol>
		<li>用酒精棉片对采集部位进行清洁和消毒。</li>
		<li>轻轻固定动物，使其颈部保持竖直和伸直。 
		注意：&#160;动物可通过手动方式进行保定，视频中已对此进行演示。如有条件，在采血和注射过程中使用羊驼保定槽可更便于操作。使用羊驼保定槽时，将佩戴牵绳的羊驼引入槽内，并用颈部栏杆和带快速释放装置的绑带进行固定。羊驼保定槽有多种型号可从商业供应商处获得。</li>
		<li>以椎骨横突的腹侧突起作为解剖标志，在腹侧突起内侧稍加压力以阻断静脉。 
		注意： 成年羊驼没有明显的颈静脉沟。颈静脉由横突的腹侧突起保护。这种皮肤较厚（例如，厚达1厘米） &#34;防滑板&#34; 在男性中，由于颈部中1/3区域的脂肪分布和颈部肌肉组织较发达，使得颈静脉本身难以被观察或触诊。因此，采用椎体解剖标志是定位颈静脉最有帮助的参考依据。</li>
		<li>以45°角将针头插入颈部中心投影点稍内侧约一指宽处。调整针头位置直至血液流出。 
		注意： 颈静脉与颈动脉彼此相邻。静脉血的颜色可能呈鲜红色，但仍比动脉血暗。采血后，应于穿刺部位施加压力0.5-1分钟（若穿刺颈动脉，则需更长时间），直至确认止血。</li>
		<li>采集4-10 mL血液用于分析。通常使用1.5英寸、20 G针头，配合适当规格的注射器或采血管。使用含K₂EDTA或K₃EDTA抗凝剂的紫色盖采血管2用于纯化淋巴细胞时采集全血的EDTA抗凝管。采集血清制备用血液时，使用金黄色头盖的血清分离管（BD）。</li>
		<li>采集50–100 mL血液用于生产。另使用一根12英寸输液延长管，配19–20 G翅状针 &#34;蝴蝶&#34; 输液装置 
		注意： 扩展套件配置可使助手填充多个采血管，从而使静脉穿刺操作者能够专注于稳定采血针。输液套件的加入可适应动物可能的移动（3-5分钟操作），并为操作人员提供舒适的操作距离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫监测
	<ol>
		<li>3至4天后rd 和 5th 注射后，对每只动物进行少量试采血以获取血清用于检测。将血清分装为0.5 mL等份，冻存备用。同时采集额外血样以监测动物健康状况，具体方法如上所述。</li>
		<li>通过ELISA检测试验性采血获得的血清，确认抗原特异性抗体的存在，采血时间点为免疫前、第三周和第五周。最佳终末采血时机应选择在抗体滴度仍在上升的阶段。</li>
		<li>使用表面处理的96孔板制备抗原亲和板。将0.1 µg抗原溶于100 mM碳酸钠缓冲液（pH 9.0）中，每孔加入100 µL溶液，4 °C孵育过夜。每种抗原设置十个稀释度，每个稀释度设复孔。另设空白对照孔，仅包被碳酸钠缓冲液。</li>
		<li>过夜孵育后，将酶标板倒置以弃去孔内液体，随后用 0.1 mL 含 0.1% Tween 20 的 PBS（PBS-T）洗涤三次。</li>
		<li>用 PBS-T 缓冲液配制的 BSA（5 mg/mL）溶液 0.1 mL 封闭各孔，在室温下孵育 1 小时。</li>
		<li>用移液管将 PBS-T 洗涤液加入孔中，然后通过倒置酶标板去除洗涤液，重复此操作三次。</li>
		<li>在PBS-T缓冲液中，将免疫前血清和免疫后血清各取0.3 mL进行2倍系列稀释，起始稀释度为1/100，直至1/102,400。</li>
		<li>向各孔中加入100 µL每种稀释液，在室温下孵育2小时。</li>
		<li>吸去每孔中的血清，用 0.2 mL PBS-T 洗涤三次。</li>
		<li>每孔加入0.1 mL以1:20,000稀释的HRP标记的山羊抗羊驼IgG抗体，孵育1小时。 
		注意： 所测量的免疫反应包括传统抗体以及仅含重链的抗体，后者在循环中的比例大致相等3,14.</li>
		<li>移除抗体溶液，每孔加入 0.2 mL PBS-T 洗涤液，洗涤三次。</li>
		<li>向孔中加入100 µL显色过氧化物酶底物，在室温下孵育，直至两个最高浓度点的颜色强度达到饱和，通常需要5–10分钟。</li>
		<li>每孔加入100 µL 0.1 M硫酸以终止反应。</li>
		<li>使用酶标仪在450 nm处测定每个孔的吸光度。</li>
		<li>以吸光度对浓度作图。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>羊驼监测与潜在并发症
	<ol>
		<li>在整个操作过程中确保对羊驼进行适当的监测。 
		注意： 预计这些操作不会引起显著的不良影响。饲养和/或研究人员应在喂食和饮水期间每天监测动物的健康状况。任何出现无法缓解的实验诱导或自然发生的病理性症状的动物，均应转交兽医服务部门进行评估，并根据需要给予适当的治疗，必要时实施人道安乐死。 
		与静脉采血相关的潜在不良后果包括出血、瘀伤和血肿。采血后应监测动物20分钟，观察是否有出血迹象。应对手术部位施加额外压力。如果出血不止，应联系兽医。 
		与注射和出血相关的其他潜在不良后果包括肉芽肿形成和炎症。肉芽肿形成并不常见，在肯塔基大学尚未观察到此类情况。注射部位可能出现炎症（发红或肿胀），应引起兽医注意。采血量可能较大，属于重要出血事件，因此应在采血后对动物进行监测，确保其状态稳定且行为活跃。 
		过敏反应和发热反应是最有可能发生的两种严重不良后果，但极为罕见。如果发生，过敏反应通常会在抗原注射后不久出现，表现为直肠温度升高、虚弱、呕吐、呼吸困难和/或腹泻。每次注射后可监测直肠温度，以检测体温是否升高。一旦发现上述症状，应立即通知兽医进行会诊。此外，应准备应急预案 &#34;急救包&#34; 应备有与兽医协商后准备的药物（如肾上腺素、皮质类固醇和抗组胺药），以治疗疑似发生不良反应的动物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 单域抗体文库构建中淋巴细胞的纯化
<ol>
	<li>在最后一次注射后三到五天收集 50 mL 血液（见步骤 1.4）。 
	注意： 快速处理血液并分离 RNA 对于获得合适的文库大小至关重要15,3，这对于筛选的成功非常关键。</li>
	<li>将收集的 15 mL 血液用 5 mL PBS 稀释。</li>
	<li>使用淋巴细胞分离管，按照制造商建议通过密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞（PBLs）。 
	注意： 制造商说明指出最多可使用 25 mL 血液，但这可能会使系统饱和，从而无法获得纯净的淋巴细胞制备物。</li>
	<li>向 PBL 中加入 5 mL 预冷至 4 °C 的 PBS。</li>
	<li>在 4 °C 下以 800 x g 离心 20 分钟。</li>
	<li>加入 5 mL 预冷至 4 °C 的 PBS 重悬 PBL，于 4 °C 下以 800 x g 离心 20 分钟，重复洗涤两次。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用基于离心柱的系统提取总 RNA。在适当的缓冲液中通过涡旋振荡使细胞裂解，并使用生物聚合物破碎系统进行处理。根据细胞投入量使用适当数量的迷你柱或大容量柱。</li>
	<li>使用逆转录酶合成 cDNA，将 10 µg RNA 与 0.1 µg Oligo(dT)12-18 引物混合进行反应。</li>
	<li>采用已建立的方法构建噬菌体文库4。该过程包括使用限制性内切酶将片段克隆至噬菌体展示载体 pMES4 中，随后表达插入片段与丝状噬菌体基因 III 的融合蛋白，以产生噬菌体溶液。</li>
</ol>
3. 单域抗体筛选
<ol>
	<li>使用表面处理的96孔板制备抗原亲和板。将0.25 µg抗原溶于100 mM碳酸钠缓冲液（pH 9.0）中，每孔加入100 µL该溶液，于4 °C孵育过夜。每种抗原包被两个孔，并设置仅包被碳酸盐缓冲液的空白对照孔。 
	注意：若需进行多轮筛选，可提前制备并储存于4 °C，最多保存一周。本方法采用直接吸附法，无需对抗原进行标记；而其他方法可能使用生物素化或其他标记策略。</li>
	<li>将板在4 °C孵育过夜后，倒置以去除孔内液体，并用0.1 mL PBS-T洗涤三次。</li>
	<li>每孔加入0.1 mL含20 mg/mL BSA的PBS溶液，室温孵育2小时以封闭孔板。</li>
	<li>用PBS-T洗涤三次，再用PBS洗涤三次。抗原也可通过共价标记后用于捕获系统，例如链霉亲和素/生物素系统。</li>
	<li>将噬菌体溶液（100 µL）与100 µL含40 mg/mL BSA的PBS溶液混合，在室温下于振荡平台上预孵育30分钟。</li>
	<li>将预处理后的噬菌体溶液加入已包被抗原的孔中，室温轻柔振荡孵育2小时。使用多个孔以确保每种抗原结合总量达到1011个噬菌体。</li>
	<li>倒置去除未结合的噬菌体，随后用200 µL PBS-T洗涤五次，再用PBS洗涤五次。</li>
	<li>每孔加入0.1 mL含0.25 mg/mL胰蛋白酶的PBS溶液，在700 rpm振荡平台上室温孵育30分钟，以洗脱结合的噬菌体。</li>
	<li>将洗脱液转移至含有5 µL 4 mg/mL盐酸4-苯磺酰氟（AEBSF）溶液的离心管中，以终止胰蛋白酶活性。</li>
	<li>将TG1噬菌体展示感受态细胞在37 °C振荡培养至OD600 = 0.5。</li>
	<li>将50 µL洗脱后的噬菌体加入3 mL TG1细胞中。</li>
	<li>37 °C静置孵育30分钟。</li>
	<li>加入7 mL LB培养基，补充100 µg/mL氨苄青霉素和2%葡萄糖。</li>
	<li>37 °C振荡培养过夜。 
	注意：若希望获得多样性最高的单域抗体，可在一轮淘选后即进行克隆测序、功能检测并投入使用；若希望获得亲和力最高的单域抗体，则应进行两轮淘选。</li>
	<li>将过夜培养的菌液涂布于添加100 µg/mL氨苄青霉素和2%葡萄糖的LB琼脂平板上。需测试多个连续稀释度，起始可涂布1/10,000和1/100,000稀释液各100 µL。</li>
	<li>37 °C孵育过夜。</li>
	<li>挑取单菌落，接种至无菌96孔板的各孔中，每孔含100 µL 2XYT培养基，并添加100 µg/mL氨苄青霉素、2%葡萄糖和10%（v/v）甘油。</li>
	<li>37 °C静置孵育过夜。</li>
	<li>次日于37 °C、170 rpm振荡培养60分钟。</li>
	<li>取2 µL培养液转移至PCR管中。剩余菌液可保留在96孔板中，短期（1–2天）储存于4 °C，或冻存于-80 °C以备后续使用。</li>
	<li>使用适用于所用载体的引物进行PCR扩增。对于pMES4载体，阳性克隆的PCR筛选使用位于多克隆位点两侧的引物：CCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTAC 和 GGTGGTGTGAGGAGACGGTGACCTG。根据所用DNA聚合酶选择合适的循环条件，退火温度设为57 °C，共进行30个循环。</li>
	<li>通过1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。阳性克隆应显示约500 bp的单域抗体基因插入片段。确保阳性克隆占总样本的20–50%。 
	注意：该方法可在大多数研究实验室中实现克隆筛选与分析。此外，也可采用高通量测序技术，获得大规模数据集，从而进行统计学与比较分析16。</li>
	<li>将96孔板中确认阳性的克隆接种至新鲜试管中，每管含7 mL LB培养基和100 µg/mL氨苄青霉素。</li>
	<li>37 °C振荡培养过夜。</li>
	<li>对培养物进行质粒小提，获得质粒DNA。</li>
	<li>使用标准测序引物pEX-Rev（CAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGC）对阳性克隆进行测序。</li>
	<li>对获得的单域抗体序列进行生物信息学分析，确认无终止密码子或阅读框移位。</li>
	<li>根据序列相似性和多样性对结果进行分类。在两轮筛选后反复出现的序列极可能是高亲和力结合序列。</li>
	<li>使用源自BL21的大肠杆菌（E. coli）表达菌株进行单域抗体表达。通过加入IPTG诱导表达，并于22 °C过夜培养。</li>
	<li>采用固定化金属离子亲和层析（IMAC）纯化单域抗体。</li>
	<li>使用直接相互作用实验（如pull-down、天然凝胶电泳或ELISA）验证单域抗体与抗原的结合能力。</li>
	<li>根据具体实验需求，验证单域抗体在特定应用中的性能表现。</li>
</ol>

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<li>Harmsen, M. M., De Haard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties%2C+production%2C+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77 (1), 13-22 (2007).</li>
<li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 289-296 (2018).</li>
</ol>

Whiteheart 博士和 Hersh 博士就职于肯塔基大学，在分子医学中心运营一个核心实验室，该实验室以收费服务的形式在羊驼中生产单域抗体。

如前所述，单域抗体具有高亲和力和特异性，加之其易于表达和稳定性好，使其成为生物医学研究中理想的试剂，可作为关键的生物化学试剂、诊断工具或治疗剂18。在商业应用中，需考虑一些与知识产权相关的问题。此外，单域抗体可被改造以包含特定的标记物或标签，这些标记物或标签可用作细胞检测或诊断中的报告分子。实现这些应用的关键在于能够针对目标抗原产生特异性的单域抗体。本文介绍了一种利用羊驼制备单域抗体的方法，该方法可对多种蛋白质抗原产生强烈的免疫应答。文中还描述了动物操作和法规合规方面的注意事项，这些因素对于该环节的成功至关重要。
还有其他策略可用于产生单域抗体，这些策略无需免疫动物，而是利用半合成文库，并结合不同的系统来筛选并迭代优化亲和力19,20。然而，使用来自免疫动物的文库的优势在于能够可靠地分离出高度富集、多样性丰富且具有高亲和力的单域抗体。此外，不仅可观察到显著的序列变异，而且所分离的大多数特异性单域抗体在CDR3区尤其存在独特的插入和缺失。
此外，单域抗体可通过一个简单的流程进行制备，该流程仅需注射少量抗原，且操作完成后动物可返回畜群。需要注意的是，这些动物仍可自由用于纤维生产，但由于在单域抗体制备过程中使用了试验性抗原及未经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的佐剂，因此必须排除其进入肉类食品链（人类食物链）的可能。当操作完成后，应对动物进行为期一周的监测，并接受最终的兽医检查，随后可将其送返原养殖场，或休养六个月后再进行下一轮单域抗体的生产。

羊驼及其他骆驼科动物已成为生物医学研究中抗体生产的一种常用来源1,2,3。骆驼科动物具有独特的免疫系统，能够产生常规抗体以及仅含重链的抗体，后者可进一步生成分子量更小的单域抗体，同时保持高特异性和高亲和力。因此，骆驼科抗体是一种用途广泛的试剂，适用于多种研究目的。本文介绍了一种免疫羊驼并针对多种蛋白抗原产生单域抗体的方法。这些抗体可通过一种相对简单的方法在骆驼科动物体内制备，仅需通过少量注射目标蛋白（抗原）进行免疫，并采集血液样本4。随后，通过构建文库、M13噬菌体展示技术5以及针对重组抗原的淘选过程6，分离并获得具有理想特性的单域抗体。由于该方法充分利用了噬菌体展示技术的优势，每只动物可同时用于五种或更多抗原的制备，从而减少了实验动物的使用数量及相关成本。
典型的哺乳动物抗体或免疫球蛋白是大型分子，由两种链（两条重链和两条轻链）通过二硫键连接而成。这些抗体相对较大，人类、小鼠、山羊和兔子中较常见的IgG类抗体分子量约为~140-190 kDa。由于其多亚基结构、高分子量以及二硫键的存在，免疫球蛋白在大量生产时往往具有较大挑战性，导致其成本较高。20世纪90年代发现，骆驼科动物（包括骆驼、羊驼和小羊驼）除了产生典型的哺乳动物型免疫球蛋白外，还能产生一种结构更简单的新型免疫球蛋白，仅由重链组成7。这些独特的骆驼科抗体具有与典型抗体相同的高亲和力特异性结合外来物质的能力，但仅由一条蛋白链构成8。此外，骆驼科抗体可在实验中被截短为更小的单位——VHH片段，也称为单域抗体9。由于其分子尺寸小，单域抗体在多种生物医学研究应用中具有重要价值，目前可通过多种学术和商业渠道获得1,10。但Western印迹（Western blotting）是一个例外，因为单域抗体通常靶向依赖构象的表位，而这些表位在Western blot所用的变性条件下通常会丧失。
由于单域抗体由一条单一的多肽链构成，因此可筛选出特异性的单域抗体，并作为重组蛋白在细菌中大量、便捷地生产。单域抗体还可通过基因工程改造，使其包含特定的标记物或标签，这些标记物或标签可作为疾病诊断中的&#34;报告基团&#34;11。这种易于操作的特性，加上其应用上的灵活性，使单域抗体成为高校及其他机构研究人员的重要资源。
作为美国国立卫生研究院资助的核心项目的一部分，现有方法已被改进，用于从羊驼中制备单结构域抗体3,4。相较于其他体型更大的骆驼科动物，羊驼在操作便利性和可获取性方面具有显著优势。羊驼被广泛用于毛纤维和肉类生产，因此可从本地羊驼养殖户处就近获得，这些养殖户可通过其网站或各州育种者协会查询到。目前有两种羊驼品种可供选择：苏利羊驼（Suri）和瓦卡亚羊驼（Huacaya）。其中瓦卡亚羊驼更为常见，本实验方案即采用该品种；但本方案同样适用于其他品种，也可更广泛地应用于其他骆驼科动物。

<table><tbody><tr><td>GERBU FAMA 佐剂</td><td>Biotechnik, Heidelberg, Germany&amp;nbsp;</td><td>3003,6001</td><td></td></tr><tr><td>血清采集管</td><td>Becton Dickinson</td><td>367983</td><td></td></tr><tr><td>血液采集管</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer 血液采集套装</td><td>Becton Dickinson</td><td>368652</td><td></td></tr><tr><td>Maxisorp 免疫板</td><td>Nunc</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>HRP 标记的山羊抗羊驼 IgG 抗体&amp;nbsp;</td><td>Bethyl Labs</td><td>A160-100P</td><td></td></tr><tr><td>TMB 显色过氧化物酶底物试剂&amp;nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-76-03</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Spectramax</td><td>M5</td><td>任何具备紫外/可见光检测功能的读板仪均可使用</td></tr><tr><td>Uni-SepMAXI+ 淋巴细胞分离管</td><td>Novamed</td><td>U-17</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder 离心柱</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Superscript IV 逆转录酶&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>AEBSF 溶液</td><td>Biosynth</td><td>A-5440</td><td></td></tr><tr><td>TG1 噬菌体展示感受态细胞</td><td>Lucigen</td><td>60502</td><td></td></tr></tbody></table>

免疫骆驼科动物（lama pacos）以蛋白抗原并制备抗原特异性单结构域抗体

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

本文描述并演示了一种用于羊驼免疫以及利用分子生物学方法制备抗原特异性单域抗体的技术。骆驼科动物（如羊驼和美洲驼）因其能够产生一种新型的仅含重链的抗体，已成为生物医学研究中的宝贵资源，这种抗体可用于制备单域抗体。由于免疫系统具有高度灵活性，因此可以针对多种不同的蛋白质抗原，甚至同一抗原的不同构象，制备出高度特异性的单域抗体。这些特性使单域抗体成为生物医学研究中不可或缺的工具。本文报道了一种从羊驼中制备单域抗体的方法，详细描述了免疫接种、采血及B细胞分离的实验方案。利用分离得到的B细胞构建免疫文库，并通过淘选（panning）方法筛选特异性单域抗体。通过淘选获得的候选单域抗体需经下拉实验（pull-down）、ELISA或凝胶迁移实验（gel-shift assay）进行验证。所获得的单域抗体可直接使用，也可作为工程化试剂的一部分。单域抗体及其基于单域抗体的试剂可用于结构生物学、生物化学、细胞生物学、体内研究以及治疗学等多种应用。单域抗体可在原核表达系统中以重组蛋白形式大量生产，经纯化后可直接使用，也可进一步改造，加入特定的标记物或标签，用于细胞研究或诊断中的报告系统。

本方案用于针对多种蛋白抗原产生单域抗体。每只羊驼使用五种抗原进行免疫。免疫监测结果显示，大多数抗原在三周时即开始出现强烈的免疫反应（图1）。在注射多种抗原的情况下，动物免疫约六周后采血并构建文库，可达到最佳平衡。针对每种抗原均进行两轮淘选，并对分离的菌落进行筛选（图2）。对阳性菌落测序后，鉴定出针对不同抗原的多样化单域抗体序列。例如，针对参考抗原麦芽糖结合蛋白（Maltose Binding Protein, MBP）分离出三个独特的克隆（图3A）。与通常观察到的情况一致，这些单域抗体具有显著的序列多样性以及长度高度可变的CDR3区（图3）。这些特征在单域抗体与抗原的相互作用中尤为重要，这一点已在参考的单域抗体/CX3CL1复合物结构中得到证实17（图3B）。
大多数全长单域抗体序列可在每升培养液中表达并纯化获得1-10 mg的产量（图4A）。由于CDR3区长度存在差异，不同的单域抗体在分子量上表现出轻微差异。确认其直接结合能力及特定应用中的性能表现至关重要。例如，在针对抗原B进行两轮筛选后，鉴定出一组单域抗体（图2）。其中发现多个相同的序列，随后对该单域抗体进行表达与纯化。通过抗原亲和树脂直接下拉实验进行检测，结果显示其具有显著的剂量依赖性结合能力（图4B）。重要的是，该单域抗体对对照树脂无任何结合信号。这些数据表明该抗体具有直接的结合相互作用，且适用于基于下拉实验和ELISA形式的亲和捕获应用。
<img alt="ELISA 结果图表，吸光度 vs. 血清稀释度，抗原 A/B，免疫前/免疫后，数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：两种不同抗原的代表性免疫监测结果，显示同一动物对不同抗原产生显著的特异性免疫应答。 许多抗原在开始免疫后三周内即表现出强烈的免疫反应，大多数抗原在六周后达到最大反应强度。六周的时间也有利于抗体亲和力的成熟，因此建议在此时间点进行生产性采血和B细胞分离。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DNA电泳结果，PCR凝胶显示克隆分析，100-500bp条带用于基因验证。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图2：基于PCR的阳性克隆验证。 引物跨越pMES4载体的多克隆位点（MCS），阳性纳米抗体克隆产生约500 bp的扩增片段（用*标记）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质结构分析；序列比对，三维蛋白质图示，CDR1-3区域，生物信息学。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：抗原特异性序列揭示羊驼单域抗体的多样性。（A）选取的针对MBP分离出的单域抗体序列与参考单域抗体4XT1的比对结果，下方高亮显示了框架区及互补决定区（Kabat命名法）。（B）羊驼单域抗体4XT1与CX3CL1结合的结构（PDB 4XT1），强调可变CDR环在特异性抗原结合中的关键作用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示蛋白质条带的SDS-PAGE电泳结果；采用抗原浓度梯度分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：单域抗体的纯化与验证。（A）IMAC纯化的单域抗体的SDS-PAGE结果，比较了多种不同的单域抗体。不同的分子量主要归因于CDR3环长度的差异。同时观察到表达水平存在差异，少数单域抗体的纯化蛋白产量较低。（B）利用抗原亲和沉淀法验证直接结合能力。在抗原偶联树脂上观察到明显的剂量依赖性单域抗体结合，而在对照树脂上则无结合。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文描述了一种从羊驼中生产单域抗体的方法，包括免疫、采血、B细胞分离和筛选。

免疫骆驼科动物（Lama pacos）以蛋白抗原并制备抗原特异性单结构域抗体

本文献中，介绍了一种用于羊驼免疫的方法，以及利用分子生物学技术制备抗原特异性单域抗体的方法……

本文所述方法已被美国国立卫生研究院（NIH）COBRE项目资助的肯塔基大学蛋白质核心设施采用，以帮助研究人员在羊驼中生产单域抗体。单域抗体是回答生物医学研究中关键问题的重要工具。我们所展示技术的主要优势在于，可在单只羊驼体内针对多达五种不同的蛋白质产生单域抗体。该技术的影响延伸至人类健康与疾病治疗领域，因为这些单域抗体可用作治疗剂、疫苗以及诊断工具。对于大多数已建立的生物医学研究者而言，最大的障碍在于如何处理大型动物，例如羊驼。对羊驼的操作、抗原注射以及血液采集进行可视化演示，对于在这些骆驼科动物中成功生产单域抗体至关重要。演示该操作过程的有大学兽医杰夫·斯迈利医生、兽医技术员凯西·博兹女士以及实验动物技术员艾琳·琼斯女士。血液处理操作将由研究助理马丁·赵医生演示。本片拍摄中的真实主角是我们来自肯塔基州的两只羊驼：蓝眼睛、大男孩，或被亲切地称为“大猩猩”的个体，以及弗雷迪。首先，使用鼻圈和牵引绳固定动物。然后，使用电推剪沿颈部基部从一侧肩部到另一侧肩部修剪羊驼的毛发，修剪成新月形。小心地抓住羊驼的头部和颈部，使用22号针头在颈部基部、靠近弓形淋巴结处皮下缓慢注射抗原。进行五次注射，每次约 200 微升，注射点之间相距约五厘米。注射后，观察动物约 20 分钟，注意有无过敏反应迹象。每周检查注射部位，观察是否存在局部炎症。采血时，剪短羊驼的毛发，并用酒精棉片对采血部位进行消毒。轻柔地固定羊驼，确保其颈部保持直立和伸直状态。以椎骨横突的腹侧突起作为解剖标志，在腹侧突起内侧稍加按压，阻断静脉血流。接下来，将针头以45度角插入，位置略偏向投影内侧，朝向颈部中心。调整针头直至血液流出。首先，用5毫升PBS稀释15毫升采集的血液。然后，用移液器将血液加入淋巴细胞分离管中，通过密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞（PBLs）。轻轻移除上层血浆层，并将其保存在另一支离心管中。接着，轻轻吸取PBL层，转移至一支无菌的50毫升离心管中。向PBLs中加入45毫升预冷的PBS，以800 × g离心20分钟，温度为4°C。用移液器吸去上清液，保留含有淋巴细胞的沉淀。用5毫升预冷的PBS再将沉淀洗涤两次，以准备进行PBLs的RNA提取。通过本方案，针对一系列蛋白质抗原成功生成了单域抗体。免疫监测结果显示，大多数抗原在免疫后三周开始表现出强烈的免疫反应，最佳采血时间为六周。对阳性克隆进行测序，鉴定出针对不同抗原的多种单域抗体序列。例如，分离出三个针对参考抗原麦芽糖结合蛋白的独特克隆。通常，这些单域抗体包含显著的序列多样性以及长度高度可变的抗原结合环。这些特性在单域抗体与抗原的相互作用中尤为重要。该方法可使每只动物产生针对多达五种抗原的单域抗体。每只动物仅需进行一次采血及文库构建。利用基于噬菌体展示的筛选技术，鉴定出抗原特异性的单链抗体。进行抗原注射和采血时，重要的是将羊驼成群安置，这有助于使其保持更安静的状态。操作过程中可使用鼻缰和牵引绳，并将它们彼此靠近地固定。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

蛋白质抗原对羊的免疫和抗原特异性单域抗体的制备

某些小鼠品系能够抵抗以髓鞘碱性蛋白诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。本文介绍了一种简单的免疫接种方案，可逆转这些小鼠品系的无反应状态，并在多种典型的EAE抗性小鼠品系中诱导出麻痹性疾病。...

通过过继转移与抗原攻击克服实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）抵抗性小鼠品系的无应答状态

预防性和治疗性疫苗常因疫苗向淋巴结引流较弱，导致免疫细胞参与不足，难以激发强烈的免疫反应。通过将疫苗直接注射至淋巴结，即所谓的淋巴内注射，可显著提高疫苗的有效性，并减少疫苗使用剂量。...

小鼠淋巴内免疫治疗与疫苗接种

本文介绍了一种基于杂交瘤技术制备单克隆抗体的优化方案。通过免疫偶联物对小鼠进行免疫，随后利用聚乙二醇（PEG）和电脉冲将脾细胞与永生化骨髓瘤细胞进行融合。通过HAT选择培养基及抗原特异性的ELISA筛选，获得能够产生抗体的杂交瘤细胞。...

利用杂交瘤技术制备小鼠单克隆抗体

本文提供了一种针对天然产物的单克隆抗体的制备与评价的详细实验方案，可用于多种免疫分析。该流程包括免疫接种、细胞融合、用于阳性克隆筛选的间接竞争ELISA以及单克隆杂交瘤细胞的制备。同时提供了利用MALDI-TOF-MS和ELISA分析对抗体进行表征的技术参数。...

天然产物单克隆抗体的制备

本文描述了抗原性脂质体纳米颗粒的制备方法及其在体外和体内刺激B细胞活化的应用。in vitro 和 in vivo...

用于产生疾病特异性抗体的抗原性脂质体

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优化的干扰素-γ ELISpot 法检测豚鼠疫苗接种后T细胞免疫应答

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用于评估疫苗研发中功能性抗体的调理-黏附试验 炭疽杆菌 及其他包封病原体

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在新西兰白兔（Oryctolagus cuniculus）母体免疫研究中的鼻内免疫与乳汁采集

在pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO细胞中表达的重组抗体蛋白以及利用传统杂交瘤技术产生的单克隆抗体均可识别并结合猪氨肽酶N（APN）蛋白。...

靶向猪肠道黏膜上皮氨肽酶N的单克隆抗体的制备

本文介绍一种替代方案，通过使用免疫原性表位髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）35-55 悬浮于含灭活的副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp.

Mycobacterium paratuberculosis 在实验性自身免疫性脑脊髓炎中增强自身抗原免疫原性的佐剂活性

了解羊驼单域抗体制备方法，通过免疫接种、血液采集和噬菌体展示技术，从单个动物同时获得针对多达五种不同蛋白的抗体。该技术为治疗性抗体和诊断试剂开发提供高效平台。

免疫骆驼科动物（Lama pacos）以蛋白抗原并制备抗原特异性单结构域抗体

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