一种用于活体可视化及活体分析生物材料相关反应的斑马鱼胚胎模型 金黄色葡萄球菌 感染

该方法有助于解答有关生物材料如何影响感染易感性、如何影响此类感染的进展过程，以及在体内环境中生物材料如何影响免疫细胞行为等关键科学问题。该技术的主要优势在于提供了一种新颖的动物模型，可实现对生物材料相关感染的活体可视化及活体分析。本方法的直观演示至关重要，因为生物材料微球的注射是一项极为精细的操作过程。

为制备仅含细菌的悬液，首先将4至5个在添加了10微克/毫升氯霉素的胰蛋白胨大豆琼脂平板上培养的荧光标记金黄色葡萄球菌mCherry菌落，转移至10毫升添加了氯霉素的胰蛋白胨大豆液体培养基中，在37°C条件下振荡培养至对数生长中期。当菌液在620纳米处的光密度值达到0.4至0.8时，通过离心收集细菌，并用1毫升无菌PBS洗涤细胞两次，每次洗涤使用1毫升PBS。第二次洗涤后，将菌体沉淀重悬于1.1毫升聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液中，涡旋混匀细菌悬液，然后再次测定光密度值。

然后根据实验要求，用PVP调整细菌悬液的浓度，制备仅含细菌的悬液。为制备细菌微球悬液，将市售的聚苯乙烯微球（PS-10）离心，弃去上清，再将微球沉淀重悬于仅含细菌的悬液中。用相当于该悬液体积1/2的PVP稀释细菌微球悬液，使悬液中细菌浓度达到适宜水平，约为仅含细菌悬液浓度的2/3。

通过涡旋振荡混匀悬浮液。为检测仅含细菌及含细菌微球的悬浮液浓度，取每种悬浮液各100微升，分别加入96孔板的独立孔中。在后续孔中，用无菌PBS将各悬浮液的10微升等分试样依次进行系列稀释（每步稀释使用新的枪头），每步稀释加入90微升无菌PBS。

将未稀释和稀释的细菌悬液各取10微升，重复点样于琼脂平板上，在37摄氏度下过夜培养。次日早晨计数菌落，以计算制备好的纯细菌悬液和含细菌微球悬液中的细菌数量。收集斑马鱼胚胎后，弃去不透明的无活力胚胎，并将约60个胚胎置于盛有新鲜E3培养基的100毫升培养皿中，在28摄氏度下培养。

麻醉后，将表达绿色荧光蛋白（GFP）的胚胎分离出来用于荧光显微镜观察。将其转移至含有E3培养基的100毫升培养皿中。为制备注射模具，向一个100毫升培养皿中加入1%至1.5%的液态琼脂糖。

使用塑料模具模板在琼脂糖中制作凹槽。待琼脂糖凝固后，移除模具，并用添加了0.02%三卡因的E3培养基覆盖琼脂糖。受精后第三天，在带有目镜标尺的光学显微镜下，用镊子折断拉制的玻璃微毛细管针尖端，以获得外径约为20微米的针尖。

调整针尖开口大小对于微球注射具有实际意义。需要根据不同尺寸的微球调整开口直径。然后使用Microloader移液器吸头将约20微升的细菌微球或仅含细菌的悬浮液装入针头，并将针头安装到连接显微注射仪的显微操作器上。

现在将选定的胚胎转移至带凹槽的琼脂糖平板中。等待五分钟，使胚胎麻醉后，将胚胎沿凹槽按同一方向排列，以便进行注射。将显微注射仪设置为适当的注射参数，在体视显微镜下，以45至60度的角度将注射针插入第一个胚胎的肌肉组织中。

根据需要轻柔地前后移动针头，以调整其在组织内的位置，并使用显微注射仪脚踏板注入已加载的悬浮液。当将细菌微球悬浮液注射到斑马鱼胚胎组织中时，应以稳定的手法轻柔插入针头。成功插入后，应在注射前为材料留出一定的空间。

所有胚胎注射完成后，在体视荧光显微镜下对胚胎进行注射成功与否的评估，并将胚胎置于48孔板的独立孔中，使用不含三卡因的E3培养基进行培养，每日更换培养基。为通过菌落形成单位定量监测感染进展，可在注射后不久随机选取5至6个存活的感染胚胎，转移至独立的2毫升微量离心管中，用无菌PBS轻轻洗涤胚胎。弃去洗涤液后，向每根离心管中加入100 µL无菌PBS，随后加入2至3颗无菌的直径为2毫米的氧化锆珠。

然后将胚胎置于匀浆器中，以3,500 rpm转速匀浆30秒，并按所示方法培养匀浆液。将含有E3培养基并添加0.02%三卡因的100毫米培养皿放置在体视荧光显微镜载物台上，并向培养皿中加入500微升2%甲基纤维素。为通过荧光显微镜监测感染进程，需配备适当的明场和荧光滤光片，将麻醉后的感染胚胎在培养皿中的甲基纤维素小滴内水平排列整齐。

使用明场滤镜在160倍放大倍数下将受损的注射组织调至焦点。将Z轴层扫深度设置为10微米，步长设置为5微米，以获取连续三幅图像。随后在相同的优化条件下，以160倍放大倍数对各个胚胎进行成像。

使用 ImageJ 中的 ObjectJ 插件分析图像。在胚胎中注射金黄色葡萄球菌可引发剂量依赖性感染，注射高剂量细菌后第1天和第2天可观察到具有活性的感染进展。如图所示，可在存在或不存在微球的情况下注射相似数量的细菌。

通常，所有含有超过20个菌落形成单位的金黄色葡萄球菌mCherry的胚胎在显微镜评分下均显示荧光阳性，尽管在低剂量感染的胚胎中，微球的存在似乎对感染进展无显著影响。在高剂量感染的胚胎中，显微镜评分未显示有或无微球的感染胚胎频率之间存在差异，但定量培养结果显示，在注射后两天，金黄色葡萄球菌联合微球组胚胎中回收的菌落形成单位数量高于仅金黄色葡萄球菌组。生物材料的存在会影响免疫细胞反应以及对感染的初始易感性。

例如，在注射后五小时，仅注射金黄色葡萄球菌（Staph aureus）所引发的巨噬细胞浸润程度显著高于同时注射金黄色葡萄球菌和微球的组别；而在注射后一天，含有微球的胚胎中金黄色葡萄球菌感染水平显著高于不含微球的胚胎。需要注意的是，应始终根据生物材料的大小调整针尖开口尺寸，并调整仅含细菌悬液与细菌-微球悬液中细菌浓度的比例。这种斑马鱼胚胎模型可实现对感染进展及由感染引发的免疫细胞反应在有或无生物材料存在条件下的活体可视化和活体分析。

该技术为抗菌生物材料的开发以及安全医疗器械治疗策略提供了一种全新的整体动物模型。