利用离体灌注大鼠小肠研究肠道激素分泌的机制

我们在此开发的方法在研究工作中被证明极为有用，可用于探究肠道激素分泌的分子机制，以及营养物质的吸收过程和二者之间的耦联关系。这种高度生理性的技术主要优势在于，可在保持肠道原位的同时，进行通常仅能在体外模型中开展的详细研究。首先将大鼠置于加热的手术台上，确认其对脚趾夹捏无反应，然后进行皮肤和腹膜切除，以暴露腹腔。

将小肠移至一侧，以暴露结肠的终末区域，并结扎供应结肠的血管。从结肠终末区域开始，逐渐向小肠方向提取结肠，用等渗盐水湿润组织，并根据需要使用棉签去除结缔组织。

当全部结肠被移除后，将一段15厘米长的塑料管插入小肠近端的肠腔内，并用缝线固定导管。然后使用10毫升注射器和注射泵，以每分钟25毫升的流速，用室温等渗盐水小心冲洗小肠。当组织内的食糜完全排空后，调整组织位置，使肠系膜上动脉暴露可及，并去除结缔组织和脂肪组织以暴露该动脉。

使用尖头镊子在肠系膜动脉下方放置两根缝线，在门静脉下方放置两根缝线。将连接在滚压泵上的塑料22号导管用灌注缓冲液充满，然后用手术剪在肠系膜动脉上剪开一个小孔，立即将导管插入切口。在动脉剪开后两分钟内插入导管，否则肠道很可能发生缺血性损伤。

缝合固定导管后，立即启动蠕动泵，以 7.5 毫升/分钟的流速开始灌注。当肠道和门静脉的血管变苍白时，在门静脉上剪开一个小孔。插入金属导管，并用另一根缝线固定金属导管。

插入导管至门静脉时需小心，因为该静脉管壁较薄。然而，由于此时肝脏已开始灌注，快速插入并非关键。收集一分钟灌注流出液后，测量其体积，并在压力记录程序中点击“执行实验”以启动灌注压力数据采集记录。

然后用湿润的实验纸巾覆盖肠道，防止其干燥，并确认肠管远端无堵塞，腔内单倍体可顺利排出。为测定氧气和二氧化碳的分压，在灌注开始约三分钟后，于灌注液进入器官前，通过三通旋塞阀收集灌注缓冲液，并从插入门静脉的导管中采集样本。将样本置于冰上，并在采集后尽快使用自动血气分析仪进行测定。

使用馏分收集器获取最初的基线样本。在收集10至15分钟的基线后，使用注射泵通过三通旋塞以每分钟35毫升的流速注入第一种动脉内测试刺激物。通过初始刺激进行管腔刺激：在刺激开始的前5分钟内，以每分钟2.5毫升的流速注入刺激用boas溶液，随后以每分钟5毫升的流速给予测试溶液。

管腔刺激阶段结束后，立即以每分钟2.5毫升的流速用等渗盐水冲洗管腔5分钟。随后，在给予下一种测试物质之前，以每分钟5毫升的流速收集15至30分钟的基础样本。实验结束时，施加一种合适的阳性对照物，检测组织制备物的反应性，持续5至10分钟，并在阳性对照刺激期结束后，额外收集10至15分钟的基础样本。

此处展示的是高质量数据的示例，显示了从离体灌注的大鼠小肠中以每分钟间隔收集的胰高血糖素样肽-1（GLP-1）分泌情况。在基础状态下，GLP-1分泌保持稳定，而在给予测试刺激物和阳性对照前后，均观察到明显的分泌反应。这些来自离体灌注大鼠小肠的GLP-1分泌数据质量较差，在基础状态下的分泌不稳定，并在整个实验过程中持续上升，其变化趋势似乎与测试物质的给予或阳性对照无关。

因此，无法得出结论判断在血管灌注果糖刺激结束时观察到的GLP-1分泌增加是否为果糖介导的反应。在进行该操作时，需注意妥善固定导管，并彻底清洁灌注设备，因为灌注缓冲液为细菌生长提供了良好的培养基。完成该操作后，可进一步开展其他方法，如对分泌激素的细胞系或原代肠道细胞培养进行体外研究，以直接检测细胞内环磷酸腺苷（cAMP）或细胞内钙离子的生成。

因此，我们已将该方法应用于阐明营养物质吸收过程及激素分泌机制的多个研究中，并证明其极为有效。请务必注意，在操作过程中使用分子位点的阻断剂或激活剂可能存在极高危险性，因此必须采取预防措施，例如穿戴实验服、手套和护目镜，并在通风橱中进行实验。