Name: 利用隔离的完美大鼠小肠进行肠道激素分泌的机制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 了解利用离体灌注大鼠小肠技术研究肠道激素分泌与营养吸收的分子机制。该方法在保持肠道原位的同时实现精细生理学观察，为代谢疾病研究提供重要平台。

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本工作获得了诺和诺德基础代谢研究中心（诺和诺德基金会，丹麦）向 Jens Juul Holst 教授提供的无限制资助，诺和诺德基金会另一项用于啮齿类动物灌注研究的专项资助（项目编号 NNF15OC0016574），欧洲研究理事会向 Holst 教授提供的资助（项目编号 695069）以及欧盟第七框架研究、技术发展与示范计划（项目编号 266408），此外还获得了 Lundbeck 基金会向 Rune E. Kuhre 提供的博士后资助（项目编号 R264-2017-3492）。我们感谢 Jenna E. Hunt 和 Carolyn F. Deacon 对文稿的仔细校对。

所有研究均获得丹麦动物实验监察局（2013-15-2934-00833）和当地伦理委员会的许可，并遵循丹麦动物实验立法（1987年）和美国国立卫生研究院（出版号85-23）的指导方针进行。
1. 实验动物
<ol>
	<li>取雄性Wistar大鼠（250 g），每笼饲养2只，自由摄食标准饲料和饮水，维持12小时光照/12小时黑暗循环。&#160;本实验动物设施使用未经处理的水和Altrromin啮齿类动物饲料（1319 FORTI，Brogaarden，Lynge，丹麦）。&#160; 
	注意：动物至少应适应环境一周。</li>
</ol>
2. 术前准备
<ol>
	<li>配制灌流缓冲液：Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液，添加 0.1% BSA（V 型组分）、5% 右旋糖酐 T-70、3.5 mmol/L 葡萄糖、&#160;以及 5 mmol/L 丙酮酸、延胡索酸和谷氨酸（如需要）；pH 值调至 7.4。</li>
	<li>通过适当孔径的滤器过滤，制备足量的灌流缓冲液，并逐滴加入 5 M HCl 将 pH 值调节至约 7.5。</li>
	<li>如需要，于实验当天将 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）直接加入缓冲液中，使其终浓度为 10 µM。 
	注意： IBMX 是一种磷酸二酯酶抑制剂，可提高细胞内 cAMP 浓度（[cAMP]i），从而恢复肠道对分泌刺激产生激素分泌反应的敏感性和反应性。</li>
	<li>配制待测溶液。将血管刺激物配制成所需终浓度 20 倍浓度的储备液，溶于已过滤并调节 pH 的灌流缓冲液中。将管腔刺激物以等渗盐水配制成终浓度溶液。</li>
	<li>对于难溶化合物，先溶于 100% 二甲基亚砜（DMSO）中，再用灌流缓冲液或等渗盐水稀释。对于血管刺激物，终浓度 DMSO 应保持在 1% 或以下，因为更高浓度可能损伤肠道组织，并导致非特异性肠道激素分泌。测量 pH 值，必要时调节至约 7.5。</li>
</ol>
3. 操作与灌注
注意：灌注装置的示意图见图1。
<ol>
	<li>使用可维持30-40分钟手术麻醉和镇痛的麻醉方案（Hypnorm/咪达唑仑，0.3 ml/100 g体重，每毫升含：Hypnorm：0.08 mg 芬太尼，2.5 mg 氟哌啶醇，0.45 mg 对羟基苯甲酸甲酯，&#160; 0.05 mg 对羟基苯甲酸丙酯，咪达唑仑：1.25 mg，Matrix Pharmaceuticals，Hellerup，丹麦）对大鼠进行麻醉。&#160;</li>
	<li>检查反射是否消失（如脚趾夹捏反射），将大鼠置于加热的手术台上，并切开皮肤以暴露肠管。</li>
	<li>尽可能移开小肠以暴露结肠末端。结扎供应结肠的血管，并从结肠末端开始逐步切除结肠，向小肠方向推进。
	<ol>
		<li>若仅需灌注小肠的某一部分（如上半部分），在结扎供血血管后切除不需要的肠段。为尽量减少组织损伤，应用等渗盐水保持肠管湿润，并使用棉签去除结缔组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将一根塑料导管（长度：约15 cm，外径：约0.4 cm）插入肠腔（近端部分），并用缝线妥善固定。用室温等渗盐水小心冲洗，以清空肠腔内的食糜。</li>
	<li>使用连接至注射泵的10 mL注射器，以0.25 mL/min的流速向肠腔灌注等渗盐水。</li>
	<li>移开肠管，使肠系膜上动脉暴露，清除周围脂肪和结缔组织以充分显露动脉。</li>
	<li>使用精细尖头镊子在肠系膜上动脉下方穿两根缝线；其中一根用于在动脉切断后提起动脉以控制出血，另一根用于固定将插入动脉的导管。操作时注意避免穿破动脉。</li>
	<li>在门静脉下方穿两根缝线，用于固定将插入静脉以收集灌注流出液的金属导管。</li>
	<li>在肠系膜上动脉上切开小口前，确保将要插入动脉的导管已充满灌注缓冲液，以防止空气栓塞形成。</li>
	<li>使用手术剪在肠系膜上动脉上剪开一个小口，并立即插入塑料导管。</li>
	<li>导管固定后，立即启动滚压泵（流速 = 7.5 mL/min），开始肠道灌注。</li>
	<li>确认肠道血管在数秒内变苍白，门静脉亦变苍白。</li>
	<li>在灌注建立良好后，立即在门静脉上切开小口，插入金属导管并用缝线固定。 
	注意： 导管放置可能较困难，但通过小心牵拉最靠近近端的缝线将静脉提起有助于操作。</li>
	<li>当导管就位且灌注输出满意后，通过膈肌穿孔处死大鼠，注意避免拉出导管。</li>
	<li>收集1分钟的灌注流出液并测量体积。在压力记录程序中点击 执行实验，开始灌注压力的数据采集/记录。</li>
	<li>用湿润的纱布覆盖肠道，防止实验过程中干燥。</li>
	<li>确保肠管远端未被堵塞，以便腔内流出液顺利排出；否则肠管将发生肿胀、水肿，灌注压力升高，灌注输出量下降。</li>
	<li>实验开始前让装置稳定约30分钟。 
	注意： 灌注最初15分钟内肠道激素的分泌输出极不稳定，因此需要此平衡阶段以获得稳定的基线水平。</li>
</ol>
4. 实验
<ol>
	<li>灌注约30分钟后，使用组分收集器采集第一个基线样本，开始实验。按照所需的时间间隔（例如每分钟）采集样本（通常每次收集6.5–7.5 mL），并在数分钟内将样本置于冰上。</li>
	<li>定期检查气泡捕集器，若已排空，则重新注入灌注缓冲液。
	<ol>
		<li>在灌流液进入器官前，通过三通旋塞阀收集缓冲液，并从插入门静脉的导管（灌流液经器官灌注后）收集流出液，以确认器官具有代谢活性。在实验开始和结束时分别采集样品，以评估整个实验过程中器官的活性。</li>
		<li>使用自动化血气分析仪快速测定样本，因为大多数塑料注射器并非完全密闭，可能导致与大气空气发生气体交换。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在采集10-15分钟基线数据后，使用第一种测试物质进行刺激。通过三通阀，利用注射泵以0.350 mL/min的流速进行动脉内刺激。</li>
	<li>通过初始团注（前5分钟内2.5 mL/min）进行管腔刺激，以置换管腔内已有的等渗盐水，随后以较低流速（0.5 mL/min）给予测试溶液。</li>
	<li>为确保在管腔刺激期结束后迅速排空肠腔内的测试物质，以与上述相同的流速用等渗盐水冲洗肠腔。</li>
	<li>在给予下一种测试物质之前，收集15-30分钟的基础样本。根据实验方案，每次实验通常可包含2-3个测试刺激。如果实验方案要求在给予某种促分泌剂的同时激活或抑制特定分子位点，则必须在给予促分泌剂前10-15分钟预先使用激活剂或抑制剂进行刺激，以确保在促分泌剂输注开始时该分子位点已处于被抑制状态。</li>
	<li>在方案结束时，给予（5-10 分钟）适当的阳性对照以检测组织样本的反应性，并在刺激期后收集 10-15 分钟的基线样本。 
	注意： 可使用多种测试物质作为阳性对照，例如能够升高[cAMP]的刺激物i （例如，forskolin 或 IBMX），[Ca2+]i （例如，胃泌素释放肽或神经降压素C），去极化试剂（例如, 30–50 mM KCl）或更具生理相关性的刺激物，如大量营养素：葡萄糖、蛋白胨、氨基酸等。然而，阳性对照的选择取决于实验结果。例如，葡萄糖是一种较弱的胆囊收缩素（CCK）分泌刺激剂，而蛙皮素（bombesin）则不能有效刺激葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（GIP）的分泌。30.</li>
	<li>实验结束后，切除灌流过的肠道，称重并测量其长度。将其置于多聚甲醛中，于4 °C保存，以备后续进行组织化学分析评估组织完整性或损伤情况，例如通过H&amp;#38;E 染色</li>
</ol>
5. 生物化学检测
<ol>
	<li>使用实验室自建或商用的放射免疫分析法（RIA）或酶联免疫吸附测定法（ELISA）定量静脉流出液中分泌肽的浓度。对于研究肠道吸收的实验，定量目标分子，例如, 葡萄糖或氨基酸，在静脉流出液中。 
	注意： 灌流液通常是大多数分析的良好基础缓冲液，包括依赖酶促反应的检测（如采用葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖含量）。</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>以不同方式呈现数据，例如绘制显示实际分泌输出量（流量 × 浓度）的时间-浓度曲线图，以及柱状图展示基线期和反应期（通常为10-15个时间点）的总分泌输出量。</li>
	<li>将相应激素的实际测定浓度绘制成浓度单位（pmol/L）； 
	注意：建议将数据表示为分泌输出量（fmol/min），因为在本模型中，与体内研究不同，所获得的数值即为实际的分泌输出量（由于持续收集灌注流出液）。</li>
	<li>根据需进行统计分析的组数，选择双尾配对t检验（两组）或用于重复测量的单因素方差分析（超过两组），随后采用适当的多重比较事后检验。</li>
</ol>

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本文作者声明不存在与本文章相关的潜在利益冲突。

离体灌注大鼠小肠是一种强大的研究工具，可深入研究肠道激素分泌的动力学及其分子机制。使用该模型成功获取数据最关键的步骤是手术操作。对肠道的任何操作不可避免地会对肠组织造成一定程度的损伤，因此应将操作降至绝对最小程度。更为重要的是操作速度，尤其是肠系膜动脉插管的时间。我们的经验是，在血管上切开小孔后几分钟内，必须成功完成导管插入并启动灌注。导管的放置是整个手术中最具挑战性的部分，由于肠系膜动脉管径细小以及门静脉管壁较薄，该步骤较为复杂，需要一定练习才能掌握。然而，静脉导管的插入速度不像肠系膜动脉插管那样紧迫，因为此时肠道已开始灌注并维持存活状态。下一步关键环节是开展实验。若手术成功，灌注的肠道通常可保持良好状态并具有反应性，持续时间可达3小时，灌注压力和流出量在整个实验过程中通常保持稳定。此阶段实验成功最重要的因素是避免气泡进入系统，因为气泡会导致空气栓塞，从而立即降低甚至完全阻断灌注流出量。由于灌注缓冲液含有BSA，并通过气体平衡以确保向灌注肠道提供充足的氧气，因此很难完全避免气泡的形成。然而，气泡应被系统中的气泡捕获装置截留，但该装置会随时间逐渐排空（气泡越多，排空越快），因此必须密切观察气泡捕获装置，并在需要时及时补充灌注缓冲液。同时...

肠道是人体最大的内分泌器官，可产生超过15种不同的肽类激素，这些激素调控营养物质的吸收与分布、肠道生长，并调节食欲1。因此，肠道激素参与多种基本生理过程，了解这些激素的分泌模式及其分泌调控的分子机制，对于深入理解基本生理功能以及探讨肠道激素作用的转化医学意义至关重要。然而，如何研究肠道激素分泌背后的分子感知机制？通常，激素分泌可在完整生物体（人类或实验动物）、离体肠道组织、分泌肠道激素的原代细胞培养或永生化细胞系中进行研究2,3,4,5,6。我们首选的模型是离体灌流大鼠小肠，这是一种具有生理相关性的模型，能够以最佳的时间分辨率详细研究肠道激素的分泌（分泌速率可精确至秒级），且研究结果很可能适用于体内情况7。本文将提供该实验操作的详细方案，但首先我们将讨论其他研究肠道激素分泌的方法，并比较这些模型与离体灌流大鼠小肠模型相比的优势与局限性。
如果希望确定某种特定化合物是否调控某些肠道激素的分泌，最终目标应是开展人体研究。因此，若某种化合物在啮齿类动物（体内实验或灌流实验）或激素分泌细胞（细胞系或原代细胞）中显示出对一种或多种肠道激素分泌的显著影响，这种效应只有在人体中得到证实后，才对医学和人类生理学具有相关意义。然而，人体研究的类型存在明显限制，因此对实验动物进行的体内研究通常是此类研究的次优选择。小鼠和大鼠是最常用的实验动物，可能因其体型适中、成本较低，且可对疑似参与特定研究问题的基因进行遗传改造（例如敲除某种特定转运体或受体）。总体而言，体内模型的优势在于其生理系统的完整性，但也存在若干局限性。其中最重要的是啮齿类动物（尤其是小鼠）体型较小，这是一大限制因素，因为大多数肠道激素定量检测至少需要20 µL血浆（通常需要更多），这意味着必须采集至少100 µL血液才能进行重复定量检测。因此，仅能获得极少数样本，通常仅包括基础水平样本和一至两个刺激后样本（一只20 g小鼠的总血容量约为1.4 mL）。因此，可能遗漏潜在的分泌反应（例如快速出现或延迟发生的反应）。
在灌流模型中，该问题得以解决，因为可以获得较大的样品体积（流速：7.5 mL/min），并且可根据需要调整采集间隔，以确保不会遗漏快速且持续时间短暂的反应（我们每分钟收集一次样品）。7另一个问题是 啮齿类动物体内研究的一个问题是，大多数肠道激素的消除或代谢速度甚至比人类更快8,9,10，这可能会使后续的生化分析变得复杂。例如，我们发现GLP-1在小鼠体内的代谢速度甚至比在人类中更快（在人类中T1/2 1-2 分钟11）更重要的是，小鼠体内GLP-1的降解不仅涉及二肽基肽酶-4（DPP4）介导的N端切割（DPP4是人类GLP-1的主要降解酶），还包括中性内肽酶24.11的进一步切割12因此，目前市面上用于定量GLP-1的商业检测试剂盒，无论是基于GLP-1完整亚型（7-36amide）还是DPP-4切割后的亚型（9-39amide），都会严重低估小鼠体内GLP-1的分泌水平，从而导致误导性的结果12在离体灌注的大鼠小肠中，由于避免了血浆介导的降解，并且防止了肝脏、肾脏和肺脏对激素的摄取与降解（因为灌流液在离开肠道后即被收集），分泌激素的大部分代谢过程被消除或显著减少。
当然，通过使用转基因动物可以获得重要的科学见解，例如, 钠-葡萄糖转运蛋白1基因敲除小鼠13，但要对参与分泌过程的分子感受器进行详细评估，通常需要考虑多个分子位点，包括分子转运蛋白、离子通道、多种G蛋白偶联受体以及细胞内蛋白。例如，在解析介导葡萄糖刺激下GLP-1分泌的分子感受器时，我们针对了九个不同的分子位点7在体内无法进行类似的研究，因为所使用的某些化合物具有非特异性或有害甚至致死效应。例如，在使用灌流肠道模型时，可通过2,4-二硝基苯酚阻断ATP的生成，从而评估细胞内葡萄糖代谢在GLP-1和神经降压素分泌中的作用7,14 以及电压门控钙通道在胆汁酸刺激GLP-1、NT和PYY分泌中的作用3事实上，高毒性的钠通道阻滞剂河豚毒素可成功应用于灌流研究中。最后，在灌流模型中，研究者可直接确定某种化合物在肠道的特定部位是否刺激某种激素的分泌，因为研究者可自由选择并制备目标灌流区域；同时，还可探究刺激物是否通过激活肠道腔侧或血管侧的分子感受器来引起分泌反应。3,15,16.
肠道激素分泌的分泌机制也可通过使用肠道组织片段（包括人类组织）、原代肠细胞培养物（通常来自小鼠）、永生化的激素分泌细胞系（来自小鼠或人类）、安装在尤辛室（Ussing chamber）中的肠道组织或类器官（两者大多来自小鼠）进行研究2,3,4,5,6,17,18。与肠道灌流相比，对人类肠道组织片段、原代细胞培养和细胞系的研究在技术上更容易实施，且生成数据的速度更快、成本更低，但当然，肠道组织片段的研究需要获取新鲜的人类肠道样本。然而，在这些模型中，肠道细胞正常的极性结构本质上已丧失，这意味着这些模型无法用于评估分子感受器的正常激活，也无法研究吸收过程。此外，此类研究通常采用静态孵育（长达数小时），这与生理状态严重不符，且与细胞正常的分泌动态毫无关联，因为分泌产物未被清除，可能通过反馈机制影响激素的进一步分泌。相比之下，在灌流的肠道中，分泌和吸收的分子会像在体内一样被黏膜微循环高效清除，从而维持跨黏膜梯度，使吸收和分泌能够以正常速率进行。此外，细胞培养物可能已从其原始的肠内分泌细胞表型发生去分化，意味着它们在肽类含量和分子感受器表达方面不再代表原始细胞，尽管它们仍可能分泌相关激素。例如，GLP-1分泌细胞系即属于这种情况19。
因此，我们认为原代细胞培养或细胞系研究最适合用于筛选目的，以及开展那些无法进行的实验类型 体内 或在离体灌注肠道中进行研究。例如，原代细胞培养和细胞系培养的一个显著优势在于能够研究细胞内第二信使（如 Ca2+cAMP、NAD(P)H等信号分子可进行实时监测，并可研究激素分泌细胞的电活动20,21,22此外，还可进行siRNA敲低实验，这在缺乏特异性抑制剂时尤为有用20,21,22,23,24将小鼠肠道组织置于尤斯室中，最近被用于研究胆汁酸刺激GLP-1分泌的分子机制；此外，小鼠肠道类器官及人肠道组织片段也被用于研究肠道激素分泌的分子细节。17,25而前者因具有极性而受益2 所有这些模型均涉及静态孵育。然而，对人类肠道组织的研究得益于使用人类而非啮齿类动物的组织，这一点非常重要，因为不同物种在组织中7TM受体和分子转运体的表达上存在差异，可能导致物种间分子感知通路的不同。事实上，该领域的大多数数据均来自对猪、小鼠或大鼠的研究，而这些发现是否可外推至人类仍不明确。然而，令人欣慰的是，介导葡萄糖刺激GLP-1分泌的分子感知机制在小鼠、大鼠和人类之间似乎相似。&#160;男性&#160;小鼠和人类L细胞的转录组学与肽组学分析&#160; 揭示了这两个物种之间在全球范围内存在显著的相似性7,18,26,27.
然而，离体灌注大鼠小肠模型也存在一些需要考虑的局限性。最重要的是，无法确定某种分泌反应是由测试物质直接激活靶向的激素分泌细胞所引起，还是通过间接机制介导的。例如，KCl 可立即增加灌注小肠中 GLP-1 的分泌7，但目前尚不清楚这种效应是 L 细胞直接去极化的结果，还是邻近 L 细胞的神经元去极化，或同时释放的旁分泌刺激物/抑制物作用所致。因此，在利用灌注小肠模型研究分泌背后的分子机制时，所得数据必须始终结合其他更具特异性的模型所获得的数据进行综合分析，以增强因果关系的推断能力。例如，葡萄糖刺激的 GLP-1 分泌在 GLP-1 分泌型细胞系 GLUTag28,29&#160;以及原代小鼠 L 细胞中依赖于葡萄糖转运蛋白（SGLT1 和 GLUT2）的活性。在离体灌注大鼠小肠中阻断这些转运蛋白同样会减弱分泌反应20，这表明葡萄糖刺激的 GLP-1 分泌很可能是通过葡萄糖对 L 细胞的直接作用介导的。离体灌注小肠的另一个重要局限性在于，由于某些脂质具有疏水性，难以对其进行研究。尽管可以检测脂质消化的终产物（如脂肪酸、二酰基甘油、溶血磷脂酰甘油等），并且该组织可能具备在细胞内重新酯化脂质并将其包装成乳糜微粒的能力，但由于离体肠道中无法维持淋巴流动，乳糜微粒从细胞中转运出来并被绒毛乳糜管吸收的过程被中断。因此，脂质吸收很可能在吸收产物于细胞内开始积累时即被阻断。体外细胞系统在脂质研究方面更不适用，因其缺乏极性结构。显然，这一局限性仅适用于通过乳糜管吸收和运输的脂质，而经由肠血管吸收的脂质则可能被正常处理。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;灌流缓冲液用化学品&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Merck</td><td>1.12018.0500</td><td></td></tr><tr><td>二水氯化钙（CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; × 2 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Merck</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>右旋糖酐70</td><td>Pharmacosmos</td><td>40014</td><td></td></tr><tr><td>反丁烯二酸二钠盐（C&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9642</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖（C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;）</td><td>Merck</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>七水硫酸镁（MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Merck</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Merck</td><td>104873</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠盐（C&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;NaO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Merck</td><td>106619</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Merck</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>一水合L-谷氨酸钠（C&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;NNaO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; × H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Merck</td><td>106445</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;灌流设备&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>通用灌流系统</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td>732316</td><td></td></tr><tr><td>BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>四通道滚柱泵</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td>730100</td><td></td></tr><tr><td>Windkessel</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td>732068</td><td></td></tr><tr><td>恒温循环器，浴槽容积3L，230V/50Hz</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td>730125</td><td></td></tr><tr><td>三脚架加热手术台，型号873</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td>733776</td><td></td></tr><tr><td>带篮式导管，外径=2.0 mm，内径=1.0 mm</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td>733313</td><td></td></tr></tbody></table>

利用离体灌注大鼠小肠研究肠道激素分泌的机制

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

肠道是人体最大的内分泌器官，可产生超过15种不同的肽类激素，这些激素调控食欲和摄食行为、消化过程、营养物质的吸收与分布，以及餐后血糖波动。理解调控肠道激素分泌的分子机制，对于阐明并转化肠道激素生理学具有重要意义。传统上，肠道激素分泌的机制研究通常采用体内实验（在实验动物或人体中进行）或利用分泌肠道激素的原代黏膜细胞培养物或细胞系。本文介绍一种离体灌流大鼠小肠模型，作为研究肠道激素分泌的替代方法。该模型的优点在于其依赖完整的肠道组织，因此能够重现体内研究中大多数与激素分泌相关的生理重要参数，包括黏膜极性、旁分泌相互作用以及灌流/刺激暴露的路径。此外，与体内实验不同，离体灌流大鼠小肠模型可实现近乎完全的实验控制，并能直接评估激素分泌情况。与体外研究相比，该模型可同时研究分泌的强度和动态变化，从而回答一些关键问题，例如：哪些刺激可引发不同肠道激素的分泌？分泌是由肠道的腔侧还是血管侧所触发？并可深入分析介导分泌反应的分子感受器。此外，该制备模型也是研究肠道吸收的有力工具，可用于详细探究肠道吸收的动力学过程及相关转运蛋白的作用机制。

确定某一特定刺激是否引起目标肠道激素分泌的能力依赖于稳定的基线分泌水平。此外，若未观察到对刺激的反应，则必须观察到阳性对照产生显著的分泌反应，以排除测试刺激无反应的情况并非源于组织整体无反应性。图2A 和 2B 展示了高质量数据的示例；图中显示了离体灌流大鼠小肠在1分钟间隔下的GLP-1分泌情况（均值 ± 标准误）。在基础状态下，分泌保持稳定；无论是在给予测试刺激（胰岛素）之前还是之后，且对阳性对照（铃蟾肽 (BBS)）可观察到显著的分泌反应。此外，还以柱状图形式展示了基础状态（分别在给予胰岛素或BBS前的基线期）的平均GLP-1分泌水平，以及胰岛素和BBS刺激期间的平均分泌水平（均值 ± 标准误）。采用单因素重复测量方差分析对分泌数据进行统计学显著性检验。基于这些综合数据可以得出结论：经动脉内给予胰岛素不会刺激离体灌流大鼠小肠的GLP-1分泌。
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本文介绍了一种用于研究肠道激素分泌和肠吸收分子机制的强大且具有生理相关性的模型——离体灌注大鼠小肠。

肠道是人体最大的内分泌器官，可产生超过15种不同的肽类激素，这些激素调节食欲和摄食、消化……

我们在此开发的方法在研究工作中被证明极为有用，可用于探究肠道激素分泌的分子机制，以及营养物质的吸收过程和二者之间的耦联关系。这种高度生理性的技术主要优势在于，可在保持肠道原位的同时，进行通常仅能在体外模型中开展的详细研究。首先将大鼠置于加热的手术台上，确认其对脚趾夹捏无反应，然后进行皮肤和腹膜切除，以暴露腹腔。将小肠移至一侧，以暴露结肠的终末区域，并结扎供应结肠的血管。从结肠终末区域开始，逐渐向小肠方向提取结肠，用等渗盐水湿润组织，并根据需要使用棉签去除结缔组织。当全部结肠被移除后，将一段15厘米长的塑料管插入小肠近端的肠腔内，并用缝线固定导管。然后使用10毫升注射器和注射泵，以每分钟25毫升的流速，用室温等渗盐水小心冲洗小肠。当组织内的食糜完全排空后，调整组织位置，使肠系膜上动脉暴露可及，并去除结缔组织和脂肪组织以暴露该动脉。使用尖头镊子在肠系膜动脉下方放置两根缝线，在门静脉下方放置两根缝线。将连接在滚压泵上的塑料22号导管用灌注缓冲液充满，然后用手术剪在肠系膜动脉上剪开一个小孔，立即将导管插入切口。在动脉剪开后两分钟内插入导管，否则肠道很可能发生缺血性损伤。缝合固定导管后，立即启动蠕动泵，以 7.5 毫升/分钟的流速开始灌注。当肠道和门静脉的血管变苍白时，在门静脉上剪开一个小孔。插入金属导管，并用另一根缝线固定金属导管。插入导管至门静脉时需小心，因为该静脉管壁较薄。然而，由于此时肝脏已开始灌注，快速插入并非关键。收集一分钟灌注流出液后，测量其体积，并在压力记录程序中点击“执行实验”以启动灌注压力数据采集记录。然后用湿润的实验纸巾覆盖肠道，防止其干燥，并确认肠管远端无堵塞，腔内单倍体可顺利排出。为测定氧气和二氧化碳的分压，在灌注开始约三分钟后，于灌注液进入器官前，通过三通旋塞阀收集灌注缓冲液，并从插入门静脉的导管中采集样本。将样本置于冰上，并在采集后尽快使用自动血气分析仪进行测定。使用馏分收集器获取最初的基线样本。在收集10至15分钟的基线后，使用注射泵通过三通旋塞以每分钟35毫升的流速注入第一种动脉内测试刺激物。通过初始刺激进行管腔刺激：在刺激开始的前5分钟内，以每分钟2.5毫升的流速注入刺激用boas溶液，随后以每分钟5毫升的流速给予测试溶液。管腔刺激阶段结束后，立即以每分钟2.5毫升的流速用等渗盐水冲洗管腔5分钟。随后，在给予下一种测试物质之前，以每分钟5毫升的流速收集15至30分钟的基础样本。实验结束时，施加一种合适的阳性对照物，检测组织制备物的反应性，持续5至10分钟，并在阳性对照刺激期结束后，额外收集10至15分钟的基础样本。此处展示的是高质量数据的示例，显示了从离体灌注的大鼠小肠中以每分钟间隔收集的胰高血糖素样肽-1（GLP-1）分泌情况。在基础状态下，GLP-1分泌保持稳定，而在给予测试刺激物和阳性对照前后，均观察到明显的分泌反应。这些来自离体灌注大鼠小肠的GLP-1分泌数据质量较差，在基础状态下的分泌不稳定，并在整个实验过程中持续上升，其变化趋势似乎与测试物质的给予或阳性对照无关。因此，无法得出结论判断在血管灌注果糖刺激结束时观察到的GLP-1分泌增加是否为果糖介导的反应。在进行该操作时，需注意妥善固定导管，并彻底清洁灌注设备，因为灌注缓冲液为细菌生长提供了良好的培养基。完成该操作后，可进一步开展其他方法，如对分泌激素的细胞系或原代肠道细胞培养进行体外研究，以直接检测细胞内环磷酸腺苷（cAMP）或细胞内钙离子的生成。因此，我们已将该方法应用于阐明营养物质吸收过程及激素分泌机制的多个研究中，并证明其极为有效。请务必注意，在操作过程中使用分子位点的阻断剂或激活剂可能存在极高危险性，因此必须采取预防措施，例如穿戴实验服、手套和护目镜，并在通风橱中进行实验。

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医学

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利用离体灌注大鼠小肠研究肠道激素分泌的机制

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