在活细胞中可视化与追踪内源性 mRNA 黑腹果蝇 卵室

该方法有助于解答RNA生物学领域中关于极化RNA定位机制与功能的关键问题。此技术的主要优势在于，能够在活体组织中实时观察内源性RNA的转运过程。该技术的应用前景涵盖RNA相关疾病的治疗，因为它有望揭示新的治疗靶点。

尽管该方法可为果蝇卵室中的RNA过程提供研究视角，也可应用于其他体系，如斑马鱼或培养细胞。通常，初学者会因分子信标探针的设计与递送相关技术难点而遇到困难。进行分子信标显微注射时，应选择40倍油镜物镜，并将带有解剖后卵室的盖玻片固定于显微镜载物台上。

选择一个处于中晚期发育阶段且方向适合显微注射的卵室。然后设置显微注射仪，调整至适当的注射压力和补偿压力。使用显微操作仪的操纵杆，将装有1微升分子信标溶液的注射针轻轻插入油滴中。

将针尖移至视野边缘并调至清晰。执行清洁功能，以去除针尖中的空气，确保针头有液体流出，并将针头移回原位。聚焦于待显微注射的卵室，然后将针头重新调至卵室边缘附近清晰可见的位置。

精细调节物镜的z轴位置，使滤泡细胞与滋养细胞之间的分隔膜处于焦点位置。将针头插入滋养细胞，持续两到五秒以注入分子信标。为确保显微注射的成功率具有可重复性，在使用显微操作器将针尖调至清晰对焦的同时，需仔细对准将要注射的滤泡细胞与滋养细胞之间的分隔膜。

当所有分子信标注射完毕后，轻柔地拔出针头，并将其缩回至初始位置。更换物镜至所需放大倍数以进行图像采集。然后在新物镜下对准卵室焦平面，并开始图像采集。

对于分子信标的斑点检测，在 Image J 中打开图像。使用转换为 ICY 工具将图像转回 ICY 格式。比例尺将自动叠加到图像堆栈上。根据需要通过检查器窗口编辑比例尺。

然后，在图层选项卡下的比例尺中，禁用眼睛图标，以从原始图像栈中移除比例尺。选择检测与追踪、检测、斑点检测器，并确认输入参数和预处理参数分别选择的是当前序列输入检测和通道零。在检测器中，选择在暗背景下检测亮斑；仅当图像栈中的z层切片数量不足以进行分析时，才强制使用2D波长进行3D分析。

为每个刻度选择量程和灵敏度，对于较大的斑点增加更多刻度，并确认序列中的目标区域已设置为目标区域。在过滤设置中，确认未启用任何过滤条件，并在输出选项下选择适当的文件格式。如果斑点检测结果将用于追踪分析，请选择导出至泳池（swimming pool）。

对于共定位分析，需对另一通道重复进行点状信号检测。为追踪分子信标点状信号，请选择检测与追踪、追踪、点状信号追踪，并使用与点状信号检测相同的参数运行点状信号检测器。单击“估计参数”，在参数估计弹出窗口中选择所需的目标运动模式。

然后点击运行追踪。要可视化轨迹，请选择检测与追踪、追踪以及轨迹管理器。对于彩色轨迹处理器，选择启用并为轨迹选择一种颜色。

从添加轨迹处理器中选择轨迹处理器时间片段。在检查裁剪器窗口中，输入要在当前时间点前后显示的检测数量。将轨迹信息保存为 XML 轨迹文件，并使用相机图标获取结果的截图。

为了沿 z 方向投影图像堆栈，使用搜索栏查找插件，并从下拉菜单中选择最大投影。在检查器窗口中，选择序列选项卡、画布和旋转，以将图像调整至所需的方向，并获取旋转后图像的截图。然后选择感兴趣区域、二维感兴趣区域，选择感兴趣区域的形状，并在图像上选定用于裁剪的感兴趣区域。

安装时间戳叠加插件，并按照弹出窗口中的说明添加时间戳，以确定时间戳的放置位置和格式。如需更改或添加时间间隔，请在序列属性窗口中点击“编辑”。在检查器窗口的图层选项卡中，激活眼睛图标以重新添加比例尺。

然后获取带有时间戳结果的截图，并将图像以 TIFF 和 AVI 格式保存。采用本方法（如所示），可在卵子发生的不同阶段（尤其是中卵子发生期及之后）通过分子信标可视化内源性 mRNA 的运输与定位模式。当将不同的 oskar 特异性分子信标分别注射到相同发育阶段的卵室时，它们均呈现出相同的定位模式。

注入滋养细胞胞质的分子信标会自由扩散至相邻的滋养细胞以及卵母细胞中。因此，这些分子信标能够在显微注射位点以外的其他位置与靶标结合，并产生荧光信号。在中等发育阶段的oskar GFP转基因卵室中，对采集数据的分析显示，经基因工程改造的GFP标记的oskar mRNA所产生的荧光信号与分子信标检测到的荧光信号之间存在广泛的共定位。

此外，还可以对5D图像序列进行进一步分析，以确定oskar mRNA在卵母细胞和滋养细胞胞质中长距离运输的轨迹。该技术的建立为RNA生物学领域的研究人员探索黑腹果蝇（Drosophila）卵室中内源性母源mRNA的运输与定位提供了有力工具。