Name: 可视化和跟踪活果蝇黑色素细胞卵室的内源性 mRNA (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 了解利用分子信标和转盘共聚焦显微镜实时追踪黑腹果蝇卵室内源性mRNA运输的方法。该技术可揭示RNA定位机制，为RNA相关疾病治疗提供新靶点。

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我们感谢萨尔瓦多·A·E·马拉斯（新泽西州立罗格斯大学公共卫生研究所中心）在分子信标合成、标记与纯化方面的贡献，以及丹尼尔·圣约翰斯顿（剑桥大学戈登研究所）提供oskar-MS2/MCP-GFP转基因果蝇品系。本研究工作得到了美国国家科学基金会职业奖1149738以及纽约市立大学专业人员委员会资助项目对DPB的资助支持。

1. 用于活细胞成像的分子信标设计
<ol>
	<li>使用 mfold 服务器中的“RNA form”（http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form）对目标RNA序列进行折叠，以预测mRNA靶标的二级结构。
	<ol>
		<li>以FASTA格式粘贴或上传目标序列，选择5%或10%的次优性（分别对应折叠自由能位于最小自由能[MFE]值5%或10%范围内的结构），并相应调整计算折叠结构的最大数量（例如，10%次优性时设置更大数值）。 
		注意：在设计分子信标（MBs）时包含次优二级结构，有助于识别靶标mRNA中可能比仅基于最小自由能（MFE）结构预测结果更灵活或更刚性的区域，从而提升适用于活细胞成像的MBs的整体设计质量。</li>
		<li>对于长度为800个核苷酸（nt）的mRNA靶标，选择“即时任务”；对于长度在801至8,000 nt之间的mRNA，选择“批量任务”。将“ss-count”文件保存为纯文本文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将步骤1.1中获得的“ss-count”文件作为输入，结合所需参数使用 PinMol 程序（https://bratulab.wordpress.com/software/），为mRNA靶标设计多个分子信标（MBs）（参见 PinMol 程序使用教程24：https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/）。
	<ol>
		<li>通过BLAST分析确定所选MBs的特异性：使用“blastn”工具，并选择适当的数据库（例如，针对 oskar mRNA特异性的MBs，应使用“refseq-rna”数据库及 Drosophila melanogaster 生物体）。</li>
		<li>确定mRNA靶标是否存在组织特异性表达（例如，对于 oskar mRNA，可查询Flybase&#62; 高通量表达数据&#62; FlyAtlas解剖微阵列或modENCODE解剖RNA-Seq；http://flybase.org/reports/FBgn0003015），并与任何阳性BLAST结果进行比对。剔除与其他也在目标组织/细胞中表达的mRNA具有&#62;50%交叉同源性的探针。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据可用于活细胞成像的显微镜设备，选择合适的荧光染料与淬灭剂组合（例如Cy5/BHQ2）25。</li>
</ol>
2. 亚甲蓝的合成、纯化与表征
<ol>
	<li>采用实验室自制方法进行合成与纯化，具体步骤如前所述7，或由商业供应商提供的服务，合成并纯化1至5 MB（见上述说明），采用以下标记方案：[5’（荧光染料）-（C3或C6连接臂）-（2’-O-甲基MB序列)-(淬灭剂)3’]。使用反相高效液相色谱法（HPLC）纯化分子信标（MBs），可自行完成或委托商业供应商提供服务。 
	注意： 用于自动探针合成的亚磷酰胺必须具有2’-O甲基核糖核苷酸修饰。也可使用交替的锁核酸（LNA）和2’-O-甲基化修饰以增强较短分子信标（MB）与其靶标mRNA杂交体的稳定性26.</li>
	<li>合成与靶向RNA区域序列匹配的DNA寡核苷酸，使其与分子信标（MBs）的探针区域互补，用于 体外 表征（见步骤 2.3 至 2.5；见上述注释）。通过在 DNA 目标序列的两端各添加四个位于目标 mRNA 序列中的额外核苷酸，以最大化分子信标（MB）与 DNA 寡核苷酸目标模拟物的杂交。 
	注意：可使用体外合成的RNA靶标替代互补DNA寡核苷酸，以更严格地表征分子信标（MB）对靶序列的检测效率。8.</li>
	<li>单独对分子信标（MB）进行热变性，测定其熔解温度（Tm），并确认MB在生理温度下呈现预期的发夹结构。我们观察到的Tm值介于60至90 °C之间。</li>
	<li>在DNA寡核苷酸靶标存在下对分子信标（MB）进行热变性，并如前所述测定MB与DNA靶标杂交体的熔解温度（Tm）7MB:DNA 杂交体的 Tm 值应介于 55 至 60 °C 之间。</li>
	<li>在体外进行相应的DNA寡核苷酸靶标的杂交反应，并按照先前所述方法测定分子信标（MB）与DNA杂交形成的效率，温度条件为生理温度。7理想的DNA靶标模拟物应具有快速的杂交动力学，然而，某些分子信标（MBs）虽然与DNA靶标的杂交效率较低，但在体外和/或体内与靶标mRNA的杂交性能可能更优。</li>
</ol>
3. 卵室的解剖与显微注射前的制备
<ol>
	<li>将新孵化且已交配的雌蝇用新鲜的酵母糊喂养2-3天。</li>
	<li>在CO2麻醉垫上麻醉果蝇，使用精细镊子（Dumont #5）将1-2只雌蝇转移至盖玻片上的一滴700号卤代烷油中。</li>
	<li>使用一对镊子，在体视显微镜下将果蝇背侧朝上摆放。于腹部后端做一小切口，轻轻挤压使一对卵巢排入油滴中。</li>
	<li>将卵巢移至新盖玻片上的油滴中。用一把镊子轻轻夹住一个卵巢，同时用另一把镊子夹除卵管中最年轻的发育阶段。oskar mRNA在卵子发生中期（阶段&#62;7）及之后被主动定位，而较年轻的卵室（阶段&#60;7）更难注射且存活时间较短。缓慢向下拖动盖玻片，使单个卵管或卵室分离并垂直排列。通过移除卵管链中不需要的发育阶段，进一步分离单个卵室。 
	注意：确保分离后的单个卵室不会在油中漂浮，并牢固附着于盖玻片上。这对显微注射的成功和图像采集均至关重要。</li>
</ol>
4. 将微球注射至卵室的护卵细胞中
<ol>
	<li>配制分子信标（MB）溶液，使用一种分子信标（例如 osk2216Cy5），或两种针对不同 mRNA 且标记有光谱可区分荧光团的分子信标混合物（例如 osk2216Cy5 和 drongo1111Cy3）。每种分子信标的浓度为 200–300 ng/µL，溶于杂交缓冲液（HybBuffer，含 50 mM Tris-HCl – pH 7.5，1.5 mM MgCl₂）中。2 以及100 mM NaCl）。对于在HybBuffer中每种浓度为200 ng/µL、标记相同荧光染料并靶向同一mRNA的四种MB混合探针（例如osk82、osk1236、osk2216），在用于显微注射加样前，应立即离心收集MB溶液。</li>
	<li>选择物镜。建议使用40倍油镜来寻找合适的卵室并进行显微注射。</li>
	<li>将带有解剖后卵室的盖玻片固定于显微镜载物台上。调整物镜至对焦位置，找到一个处于中期至晚期发育阶段且方向适合显微注射的卵室（即, A-P轴垂直于针尖，以便于向靠近卵母细胞的助细胞内进行注射。</li>
	<li>加载一根针头（商用或自制）27）加入约 1 µL 的 MB 溶液（见 步骤 4.1）并将其连接至显微注射仪。用于显微注射的 D. melanogaster 卵泡，调整针头方向（参见 材料表以一定角度 &#60;45° 调整为显微镜载物台角度（例如 30°），以避免刺穿多个滋养细胞。</li>
	<li>设置注射器的注射压力为500–1,000 hPa，补偿压力为100–250 hPa（参见 材料表).</li>
	<li>缓慢移动载物台，使视野中出现一个不含卵室的油滴区域。</li>
	<li>使用显微操作仪操纵杆，轻轻将针头插入油滴中，并将针尖移至视野边缘对焦。</li>
	<li>执行“清洁”功能，以排出针尖的空气，并确保针头有液体流出。</li>
	<li>将针头移回原位，聚焦于待显微注射的卵室，然后重新聚焦针头并将其置于卵室边缘附近。</li>
	<li>精细调节物镜的Z轴位置，使滤泡细胞与滋养细胞之间的分隔膜处于焦点位置。</li>
	<li>将针头插入滋养细胞并注射2-5秒。</li>
	<li>轻轻取出针头，并将其缩回至初始位置。</li>
	<li>将物镜切换至所需的成像放大倍数（60-63倍或100倍），聚焦于卵室，然后开始采集图像。</li>
</ol>
5. 使用旋转盘共聚焦显微镜系统获取数据
注意：有关我们的具体设置，请参见材料表。
<ol>
	<li>设置采集方案以记录8-16位的XYZCt图像堆栈（XYZ = 体积，C = 通道，t = 时间）。</li>
	<li>为所需通道选择激光线（例如，Cy5使用641 nm激光，GFP使用491 nm激光），并按顺序采集各通道：首先采集每个通道的荧光信号，然后改变Z轴位置，以便进行准确的共定位分析。</li>
	<li>选择Z轴步进（例如0.3 µm）以及Z轴上下限（例如 -2 µm至2 µm）。</li>
	<li>输入采集时间与采样频率（例如每15-30秒一次，持续最长1小时）。</li>
	<li>启动采集。</li>
</ol>
6. 数据处理、分析以获取追踪与共定位信息，以及视频文件的制备
<ol>
	<li>图像处理
	<ol>
		<li>下载、解压并打开 Icy，一个用于生物图像信息学的开放社区平台（http://icy.bioimageanalysis.org/）</li>
		<li>打开在步骤5中获取的XYZCt图像序列：图像/序列 &#62;文件&#62;开放。</li>
		<li>将图像栈转换为 ImageJ：ImageJ&#62; 工具&#62; 转换为 IJ，开启分离模式。</li>
		<li>创建一个子堆栈（选择特定的Z步长和时间点范围以进行进一步分析）：ImageJ&#62;图像&#62;堆叠&#62;工具&#62;设置 Substack…；选择所需的通道、Z 步长和时间点。</li>
		<li>将子堆栈另存为 TIFF 文件：ImageJ&#62;文件&#62;另存为&#62;Tiff…；在后续步骤中使用此文件。</li>
		<li>拆分通道：ImageJ&#62;图像&#62;颜色&#62;拆分通道</li>
		<li>使用背景图像栈减去背景：ImageJ&#62;过程&#62;图像计算器…，或使用滚动球选项：ImageJ&#62;过程&#62;减去背景…，选择滚动球半径。在点击“接受”前，预览所选半径下的图像效果。 
		注意：背景信号主要源于荧光团淬灭不充分。信号与背景比值（S:B）常被用作衡量分子信标（MB）“亮度”的指标，该比值通过以下方式测定 体外 MB与DNA靶标寡核苷酸的杂交实验。例如，MB osk1236和osk2216的S:B值分别约为81和120。</li>
		<li>调整每个通道的亮度和对比度：ImageJ&#62;图像&#62;调节&#62;亮度/对比度，选择应用。</li>
		<li>将每个通道另存为单独的 TIFF 文件：ImageJ&#62;文件&#62;另存为&#62;Tiff....</li>
		<li>合并两个通道：ImageJ&#62;图像&#62;颜色&#62;合并通道…；选择通道。将新堆栈另存为新的 TIFF 文件（见 步骤 6.1.8）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>斑点检测与追踪
	<ol>
		<li>转换回 Icy：ImageJ&#62;工具&#62;转换为 Icy。</li>
		<li>如果已安装比例尺插件，则在转换为 Icy 时会自动在图像堆栈上叠加比例尺［使用插件搜索&#62;设置&#62;在线插件]。如有需要，可通过检查器窗口（屏幕右侧）编辑比例尺&#62;图层标签&#62;名称&#62;比例尺</li>
		<li>在“图层”选项卡中取消选择/停用比例尺的“眼睛”图标&#62;移除原始图像序列中标尺的名称。可在最终图像序列中重新激活。</li>
		<li>使用图像窗口菜单栏中的“相机”图标，选择“拍摄当前视图的截图”，然后通过“文件”保存新处理的图像序列。&#62;保存为&#62;Tiff….</li>
		<li>确定斑点敏感性；若斑点敏感性参数已确定，则进入步骤 6.2.7。</li>
		<li>检测斑点：选择包含待分析图像或图像序列的窗口，检测&amp;#38;Tracking&#62;检测&#62;斑点检测器，并填写设置参数：
		<ol>
			<li>对于输入，选择“currentSequenceInputDetection”（默认）。</li>
			<li>预处理时，在检查器窗口中核对通道编号后，选择“Channel 0”（默认）或所需通道&#62;序列标签页</li>
			<li>对于检测器，选择“在暗背景下检测亮斑”；仅当图像堆栈中的Z层面数量不足以进行分析时，才使用“强制对3D图像使用2D小波”。为每个尺度选择“尺度（Scale）”和“灵敏度（Sensitivity）”（对于较大的斑点可添加更多尺度）。尺度和灵敏度（数值越大，检测越灵敏，Icy建议最大值为140）为需通过试错法确定的变量，后续必须通过视觉检查确认并最终确定。</li>
			<li>对于感兴趣区域，使用“ROIfromSequence”（默认）。</li>
			<li>对于过滤，请使用“NoFiltering”（默认），或选择“SizeFiltering”以定义“可接受对象的范围（以像素为单位）”。</li>
			<li>输出：选择 XLS 或 XML 输出格式（当使用 2007 版 MS Excel 或更早版本且存在以下情况时，请选择 XML 格式） &#62;65,000 个斑点）。如果使用斑点检测结果进行追踪分析，请同时选择“导出至 SwimmingPool”。</li>
			<li>使用不同的尺度/灵敏度值重复检测斑点，直至检测到全部或大部分斑点。记录所有最终参数。</li>
			<li>进行共定位分析时，对另一通道重复进行斑点检测。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为追踪斑点，请选择检测&amp;#38;Tracking&#62;追踪&#62;斑点追踪&#62;运行“斑点检测器”，使用步骤6.2.6中的参数，或使用“在此处选择检测结果”下拉菜单选择一个已有数据集（为此，请保持步骤6.2.5中打开的斑点检测器窗口处于开启状态）。点击“估计参数”按钮，并在弹出的参数估计窗口中选择所需的目标运动模式（例如“兼具扩散性和定向性”）。点击“运行追踪”按钮。</li>
		<li>对多通道图像序列中的其他通道重复进行斑点检测与追踪，操作步骤参照6.2.6和6.2.7，起始图像序列为6.2.7步骤生成的结果。</li>
		<li>为了可视化轨迹，选择检测&amp;#38;Tracking&#62;追踪&#62;轨迹管理器——在完成一次追踪运行后，此窗口将自动打开。对于“颜色轨迹处理器”，选择“启用”，并选择轨迹颜色的显示方式。可通过“添加轨迹处理器…”下拉菜单访问相关的轨迹处理器（例如，选择“轨迹处理器时间剪辑”，启用“轨迹剪辑器”窗口，并选择在当前时间点前后显示的检测数量）。</li>
		<li>将轨迹信息保存为 XML 轨迹文件：检测&amp;#38;Tracking&#62;追踪&#62;追踪管理器&#62;文件&#62;另存为…</li>
		<li>使用图像窗口菜单栏中的“相机”图标，选择“拍摄当前视图的屏幕截图”，以保存结果。在检查器窗口中，通过激活或停用相应的眼睛图标，可选择是否显示已检测到的斑点和/或轨迹，进而截取包含这些内容的屏幕截图。&#62;图层标签&#62;名称&#62;覆盖层包装器</li>
		<li>安装时间戳叠加插件：插件&#62;设置&#62;在线插件&#62;时间戳叠加&#62;安装。</li>
		<li>添加时间戳：插件&#62;时间戳叠加（新建）。按照屏幕右下角弹出窗口中的说明，设置和格式化时间戳。时间间隔可在检查器窗口中添加或修改。&#62;序列标签页&#62;序列特性&#62;编辑。</li>
		<li>通过再次截屏保存结果。将图像保存为 1) Tiff 格式，以及 2) AVI 格式；对于 AVI 格式，需先转换为 RGB 渲染（图像/序列）&#62;成像&#62;RGB图像</li>
		<li>旋转图像至所需方向：检查器窗口&#62;序列标签页&#62;画布&#62;旋转。</li>
		<li>通过“截取当前视图的屏幕截图”保存旋转后的图像。确保取消选中比例尺的“眼睛”图标，因为该图标会随图像一同旋转。</li>
		<li>选择并裁剪感兴趣区域：选取感兴趣区域&#62;二维感兴趣区域&#62;选择感兴趣区域（ROI）形状，然后在图像上创建/绘制 ROI；图像/序列&#62;平面（XY）&#62;快速裁剪</li>
	</ol>
	</li>
	<li>共定位分析
	<ol>
		<li>准备共定位实验方案；Icy 网站上提供了多个示例（http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/List）（参见 补充材料).</li>
		<li>共定位分析加载方案：工具&#62;脚本编写&#62;实验方案&#62;加载并调整相互关联模块中的参数（例如，在“小波斑点检测”模块中，使用步骤 6.2.6 中确定的参数）。</li>
		<li>以像素为单位测量颗粒的大小，确定共定位距离，并将其作为“最大距离”输入到“Colocalizer”模块中。 
		注意： 颗粒的像素大小取决于检测系统。为测量尺寸，需放大单个颗粒，手动计数信号宽度所跨越的像素数，并对至少三个颗粒的测量结果取平均值。设定共定位的最大距离应为颗粒的像素尺寸（该值代表两个相互接触的颗粒半径之和的最大值）。</li>
		<li>如需要，可为共定位分析选择一个或多个感兴趣区域：Region Of Interest&#62;二维感兴趣区域&#62;选择感兴趣区域（ROI）形状&#62;在图像上绘制感兴趣区域。</li>
		<li>作物感兴趣区域（ROI）：图像/序列&#62;平面（XY）&#62;快速裁剪</li>
		<li>执行共定位：协议编辑器窗口&#62;选定方案标签页&#62;运行。Protocols 编辑器窗口中的最后一个模块将包含基于点状信号检测的整体共定位百分比，而每个时间点的详细信息可在检查器窗口中查看。&#62; 输出标签页</li>
		<li>通过执行步骤 6.2.7（追踪斑点）来追踪共定位和单个粒子。</li>
		<li>按照步骤6.2.16所述进行保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).</li>
<li>Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+for+live-cell+RNA+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes for live-cell RNA detection.</a> Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).</li>
<li>Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+techniques+for+visualizing+RNA+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Current techniques for visualizing RNA in cells.</a> F1000Research. 5, (2016).</li>
<li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+observation+of+transcription+initiation+and+elongation+on+an+endogenous+yeast+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li>
<li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li>
<li>Garcia, J. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS2+coat+proteins+bound+to+yeast+mRNAs+block+5%27+to+3%27+degradation+and+trap+mRNA+decay+products%3A+implications+for+the+localization+of+mRNAs+by+MS2-MCP+system%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system.</a> RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).</li>
<li>Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacons%3A+Fluorescent+probes+for+detection+of+endogenous+mRNAs+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).</li>
<li>Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+distribution+and+transport+of+mRNAs+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).</li>
<li>Tyagi, S., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacons%3A+probes+that+fluoresce+upon+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization.</a> Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon-based+approach+for+live-cell+imaging+of+RNA+transcripts+with+minimal+target+engineering+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1550(2017).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+microRNAs+by+combining+molecular+beacon+probes+with+T7+exonuclease-assisted+cyclic+amplification+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).</li>
<li>Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+quantification+of+specific+microRNA+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Research. 40 (2), e13(2012).</li>
<li>Ko, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+color-tunable+molecular+beacon+to+sense+miRNA-9+expression+during+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis.</a> Scientific Reports. 4, 4626(2014).</li>
<li>Vet, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+four+pathogenic+retroviruses+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).</li>
<li>Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacons+for+protein-DNA+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular beacons for protein-DNA interaction studies.</a> Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).</li>
<li>Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Functional+Roles+of+Molecular+Beacon+as+a+MicroRNA+Detector+and+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).</li>
<li>Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Beacon+Nano-Sensors+for+Probing+Living+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells.</a> Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).</li>
<li>Ban, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+Purification+of+Ventricular+Cardiomyocytes+from+Differentiating+Embryonic+Stem+Cells+through+Molecular+Beacons+Targeting+IRX-4%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).</li>
<li>Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacon-based+real-time+PCR+detection+of+primary+isolates+of+Salmonella+Typhimurium+and+Salmonella+Enteritidis+in+environmental+and+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples.</a> BMC Microbiology. 9, 97(2009).</li>
<li>McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+Oogenesis%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).</li>
<li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="https://www.cell.com/current-biology/abstract/S0960-9822(08)01196-2">Drosophila oogenesis.</a> Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li>
<li>Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+oskar+RNA+regulates+oskar+translation+and+requires+Oskar+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein.</a> Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).</li>
<li>Mhlanga, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+colocalisation+of+oskar+mRNA+and+trans-acting+proteins+revealed+by+quantitative+imaging+of+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte.</a> PLoS One. 4 (7), e6241(2009).</li>
<li>Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2018/04/03/294447.abstract">PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiencies+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+contact-mediated+quenching+in+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), e122(2002).</li>
<li>Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiny+molecular+beacons+for+in+vivo+mRNA+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).</li>
<li>Dean, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+%28pulling%29+of+needles+for+gene+delivery+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor%22%5BJournal%5D)">Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection.</a> Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).</li>
<li>Alami, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+of+TDP-43+mRNA+granules+is+impaired+by+ALS-causing+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations.</a> Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).</li>
<li>Jackson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+Hairpin+DNA-Functionalized+Gold+Nanoparticles+for+Imaging+mRNA+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells.</a> Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).</li>
<li>Zimyanin, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+oskar+mRNA+transport+reveals+the+mechanism+of+posterior+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization.</a> Cell. 134 (5), 843-853 (2008).</li>
<li>Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiny+molecular+beacons%3A+LNA%2F2%27-O-methyl+RNA+chimeric+probes+for+imaging+dynamic+mRNA+processes+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells.</a> ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).</li>
<li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cytosolic+delivery+of+molecular+beacon+conjugates+and+flow+cytometric+analysis+of+target+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), e69(2008).</li>
<li>Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-linked+molecular+beacons+for+efficient+delivery+and+rapid+mRNA+detection+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 32 (6), e58(2004).</li>
<li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), e105(2007).</li>
<li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).</li>
<li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+software+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological imaging software tools.</a> Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).</li>
<li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li>
<li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+germ+granules+are+structured+and+contain+homotypic+mRNA+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commununications%22%5BJournal%5D)">Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters.</a> Nature Commununications. 6, 7962(2015).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

在活体果蝇（Drosophila）卵室中对内源性 mRNA 的运输进行实时可视化，依赖于特定、高效且耐核酸酶的分子信标（MBs），而如今这些分子信标可通过 PinMol 软件轻松设计。分子信标是一种特异性探针，可靶向检测目标 mRNA 中的独特序列（优先选择无二级结构的区域），从而实现对转录本的高分辨率检测。将该技术/方案应用于其他组织或细胞类型时，唯一的限制在于分子信标向目标样本的递送效率。尽管其他方法需要对组织进行遗传改造，使其表达适配体以及与荧光蛋白融合的 RNA 结合蛋白，以实现对单个目标 mRNA 的可视化（例如 MS2/MCP 系统），但最多仅能实现两种转录本的多重检测。相比之下，分子信标技术是唯一能够在活细胞中检测内源性 mRNA 的方法，也是目前唯一允许同时可视化两种以上 mRNA 物种的技术。
MBs 可以用多种荧光基团进行标记，并且在由修饰核苷酸（如 2'-O甲基核糖核苷酸或锁核酸26,31这...

利用基于荧光的活细胞成像技术，细胞生物学研究得以在空间和时间分辨率上可视化动态事件。目前，体内 mRNA 的可视化主要通过基于RNA适配体-蛋白质相互作用、RNA适配体诱导有机染料荧光以及核酸探针退火的技术实现1,2,3。这些方法均具有高特异性、高灵敏度以及高信噪比。然而，以RNA适配体为核心的方法需要进行广泛的遗传操作，即构建转基因序列以表达含有特定人工结构元件的RNA，这些结构元件是与蛋白质或有机染料结合所必需的。例如，MS2/MCP系统需要共表达两个转基因：一个编码包含多个串联重复序列的RNA结构，该重复序列为噬菌体MS2衣壳蛋白（MCP）的结合位点；另一个则编码与MCP融合的荧光蛋白4,5。在RNA上引入此类二级结构元件，同时结合体积较大的荧光标记蛋白，引发了人们对天然RNA生物学过程可能受到干扰的担忧6。为解决这一问题并提供额外独特优势的技术是基于核酸的方法——分子信标（molecular beacons, MBs）。MBs能够实现内源性mRNA的多重检测、单核苷酸变异的区分以及与靶标mRNA快速的杂交动力学7,8。MBs是一类寡核苷酸探针，在未与靶标结合时保持淬灭的发夹结构，一旦与靶标杂交即发生荧光激活的构象变化（图1C）9。多个研究团队已成功应用MBs检测非编码RNA（如microRNA和lncRNA）10,11,12,13、RNA逆转录病毒14以及动态的DNA-蛋白质相互作用15。MBs已被成功用于多种生物体和组织中的成像，包括斑马鱼胚胎16、神经元13、肿瘤组织17、分化中的心肌细胞18以及Salmonella19。
本文描述了在活细胞中对内源性mRNA进行设计、递送和检测的方法 D. melanogaster 卵泡室与显微镜装置相结合，该装置速度足够快，可捕捉活性分子运输的动态范围。 D. melanogaster 卵室作为多细胞模型系统，已被广泛应用于各类发育生物学研究，从早期生殖系干细胞分裂和母源基因表达，到体节性体轴模式的形成20,21卵室易于分离，体积较大且呈半透明状，能够耐受数小时的处理 离体 分析，使它们非常适合成像实验。大量研究集中在母源转录本在被主动翻译之前定位于特定亚细胞区域的不对称分布现象。特别是 oskar mRNA 在卵母细胞后极的定位及其后续翻译必须以高度调控的方式进行，以避免出现致死性的双尾胚胎表型22. oskar mRNA 在15个生殖细胞（称为滋养细胞）中转录，并通过细胞质桥（称为环状管）主动运输到卵母细胞中，卵母细胞是发育为成熟卵子并最终受精的生殖细胞。图1A）。关于蛋白质因子动态招募及其进出交换的大量信息已可获得 oskar mRNP 及其在细胞内的长距离运输使 oskar 研究mRNA生命周期众多过程的首选候选对象。MBs在揭示mRNA定位过程的细节以及解析调控mRNA运输的蛋白质因子的功能与调控机制方面发挥了关键作用。 果蝇 卵子发生。特别是通过将微珠（MBs）显微注射到滋养细胞中并进行活细胞成像实验，可实现对内源性mRNA的追踪8,23.
本文提供的路线图展示了完整的操作流程，从使用分子信标（MBs）进行活细胞成像实验、获取成像数据，到对数据进行分析以在天然细胞环境中追踪内源性mRNA。研究人员可根据各自实验室所使用的其他组织或细胞类型，对该流程中的步骤进行修改和进一步优化。

<table><tbody><tr><td>荧光分光光度计</td><td>Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon</td><td>n/a</td><td>光子计数型荧光分光光度计</td></tr><tr><td>石英比色皿</td><td>Fireflysci (原 Precision Cells Inc.)</td><td>701MFL</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td>细镊子对于分离单个卵室至关重要</td></tr><tr><td>卤碳油 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 No.1 22 mm × 40 mm</td><td>VWR</td><td>48393-048</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 果蝇麻醉垫</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 7.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>转盘共聚焦显微镜</td><td>配备 Yokogawa CSU 10 转盘的 Leica DMI-4000B 倒置显微镜 Leica Microsystems Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD 相机</td><td>Hamamatsu</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>PatchMan NP 2 显微操作器</td><td>Eppendorf Inc.</td><td>920000037</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 微注射仪</td><td>Eppendorf Inc.</td><td>920010504</td><td></td></tr><tr><td>注射针：Femtotips II</td><td>Eppendorf Inc.</td><td>930000043</td><td></td></tr><tr><td>上样吸头：20 &amp;mu;L Microloader</td><td>Eppendorf Inc.</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>显微盖玻片 No. 1 或 1.5，22 mm × 40 mm</td><td>VWR</td><td>48393-026; 48393-172</td><td></td></tr><tr><td>干酵母</td><td>任意杂货店</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>计算机，&gt; 20 GB RAM</td><td></td><td></td><td>尽管大多数计算机均可进行数据处理，但更高配置的设备可显著提升处理速度</td></tr></tbody></table>

在活细胞中可视化与追踪内源性 mrna 黑腹果蝇 卵室

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

基于荧光的成像技术结合光学显微镜的发展，彻底改变了细胞生物学家开展活细胞成像研究的方式。自从早期研究将特定位置的mRNA定位与基因表达调控联系起来后，RNA检测方法已得到极大扩展。如今，通过能够检测mRNA的技术手段，结合足够快速以捕捉分子动态行为范围的显微镜系统，可以实现对mRNA动态过程的可视化观察。分子信标技术是一种基于杂交的方法，可直接在活细胞中检测内源性转录本。分子信标呈发夹结构，为内部淬灭型单核苷酸识别核酸探针，仅在与特异性靶序列杂交时才会发出荧光。当该技术与先进的荧光显微镜和高分辨率成像系统相结合时，可实现对细胞内mRNA运动的空间和时间追踪。尽管该技术是目前唯一能够检测内源性转录本的方法，但由于在为活细胞成像设计此类探针方面存在困难，细胞生物学家尚未广泛采用这一技术。一种名为 PinMol 的新软件应用程序，可实现更高效且快速地设计最适合在活细胞内有效杂交至mRNA靶区域的探针。此外，高分辨率实时图像采集以及当前开源的图像分析软件，可提供更精确的数据输出，从而更深入地评估mRNA生命周期中所涉及的动态过程的复杂性。
本文介绍了一种针对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）卵室设计并递送分子信标的全面实验方案。通过转盘共聚焦显微镜，可直接且高度特异性地检测和可视化内源性母源mRNA。利用Icy软件中的目标检测与追踪功能对成像数据进行处理和分析，从而获得有关mRNA动态运动的详细信息，这些mRNA被运输并定位于卵母细胞内的特定区域。

使用 PinMol，可以针对一个 mRNA 靶标设计多个 MBs（分子信标）图1B- C）。合成与纯化后，通过体外分析对所选分子信标（MBs）进行表征与比较。
<img alt="卵母细胞中的基因表达；RNA结构图，分子分析结果，PinMol数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58545/58545fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：活细胞成像内源性mRNA的技术与组织示意图。（A）用于显微注射的中期Drosophila卵室示意图。显微注射针（绿色）注入针对oskar mRNA的分子信标混合物。...

本文介绍了一种利用分子信标、转盘共聚焦显微镜和开源分析软件，在活体黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）卵室中对内源性mRNA运输进行可视化、检测、分析与追踪的实验方案。

在活细胞中可视化与追踪内源性 mRNA 黑腹果蝇 卵室

基于荧光的成像技术，结合光学显微镜的发展，彻底改变了细胞生物学家进行活细胞研究的方式……

该方法有助于解答RNA生物学领域中关于极化RNA定位机制与功能的关键问题。此技术的主要优势在于，能够在活体组织中实时观察内源性RNA的转运过程。该技术的应用前景涵盖RNA相关疾病的治疗，因为它有望揭示新的治疗靶点。尽管该方法可为果蝇卵室中的RNA过程提供研究视角，也可应用于其他体系，如斑马鱼或培养细胞。通常，初学者会因分子信标探针的设计与递送相关技术难点而遇到困难。进行分子信标显微注射时，应选择40倍油镜物镜，并将带有解剖后卵室的盖玻片固定于显微镜载物台上。选择一个处于中晚期发育阶段且方向适合显微注射的卵室。然后设置显微注射仪，调整至适当的注射压力和补偿压力。使用显微操作仪的操纵杆，将装有1微升分子信标溶液的注射针轻轻插入油滴中。将针尖移至视野边缘并调至清晰。执行清洁功能，以去除针尖中的空气，确保针头有液体流出，并将针头移回原位。聚焦于待显微注射的卵室，然后将针头重新调至卵室边缘附近清晰可见的位置。精细调节物镜的z轴位置，使滤泡细胞与滋养细胞之间的分隔膜处于焦点位置。将针头插入滋养细胞，持续两到五秒以注入分子信标。为确保显微注射的成功率具有可重复性，在使用显微操作器将针尖调至清晰对焦的同时，需仔细对准将要注射的滤泡细胞与滋养细胞之间的分隔膜。当所有分子信标注射完毕后，轻柔地拔出针头，并将其缩回至初始位置。更换物镜至所需放大倍数以进行图像采集。然后在新物镜下对准卵室焦平面，并开始图像采集。对于分子信标的斑点检测，在 Image J 中打开图像。使用转换为 ICY 工具将图像转回 ICY 格式。比例尺将自动叠加到图像堆栈上。根据需要通过检查器窗口编辑比例尺。然后，在图层选项卡下的比例尺中，禁用眼睛图标，以从原始图像栈中移除比例尺。选择检测与追踪、检测、斑点检测器，并确认输入参数和预处理参数分别选择的是当前序列输入检测和通道零。在检测器中，选择在暗背景下检测亮斑；仅当图像栈中的z层切片数量不足以进行分析时，才强制使用2D波长进行3D分析。为每个刻度选择量程和灵敏度，对于较大的斑点增加更多刻度，并确认序列中的目标区域已设置为目标区域。在过滤设置中，确认未启用任何过滤条件，并在输出选项下选择适当的文件格式。如果斑点检测结果将用于追踪分析，请选择导出至泳池（swimming pool）。对于共定位分析，需对另一通道重复进行点状信号检测。为追踪分子信标点状信号，请选择检测与追踪、追踪、点状信号追踪，并使用与点状信号检测相同的参数运行点状信号检测器。单击“估计参数”，在参数估计弹出窗口中选择所需的目标运动模式。然后点击运行追踪。要可视化轨迹，请选择检测与追踪、追踪以及轨迹管理器。对于彩色轨迹处理器，选择启用并为轨迹选择一种颜色。从添加轨迹处理器中选择轨迹处理器时间片段。在检查裁剪器窗口中，输入要在当前时间点前后显示的检测数量。将轨迹信息保存为 XML 轨迹文件，并使用相机图标获取结果的截图。为了沿 z 方向投影图像堆栈，使用搜索栏查找插件，并从下拉菜单中选择最大投影。在检查器窗口中，选择序列选项卡、画布和旋转，以将图像调整至所需的方向，并获取旋转后图像的截图。然后选择感兴趣区域、二维感兴趣区域，选择感兴趣区域的形状，并在图像上选定用于裁剪的感兴趣区域。安装时间戳叠加插件，并按照弹出窗口中的说明添加时间戳，以确定时间戳的放置位置和格式。如需更改或添加时间间隔，请在序列属性窗口中点击“编辑”。在检查器窗口的图层选项卡中，激活眼睛图标以重新添加比例尺。然后获取带有时间戳结果的截图，并将图像以 TIFF 和 AVI 格式保存。采用本方法（如所示），可在卵子发生的不同阶段（尤其是中卵子发生期及之后）通过分子信标可视化内源性 mRNA 的运输与定位模式。当将不同的 oskar 特异性分子信标分别注射到相同发育阶段的卵室时，它们均呈现出相同的定位模式。注入滋养细胞胞质的分子信标会自由扩散至相邻的滋养细胞以及卵母细胞中。因此，这些分子信标能够在显微注射位点以外的其他位置与靶标结合，并产生荧光信号。在中等发育阶段的oskar GFP转基因卵室中，对采集数据的分析显示，经基因工程改造的GFP标记的oskar mRNA所产生的荧光信号与分子信标检测到的荧光信号之间存在广泛的共定位。此外，还可以对5D图像序列进行进一步分析，以确定oskar mRNA在卵母细胞和滋养细胞胞质中长距离运输的轨迹。该技术的建立为RNA生物学领域的研究人员探索黑腹果蝇（Drosophila）卵室中内源性母源mRNA的运输与定位提供了有力工具。

visualizing-tracking-endogenous-mrnas-live-drosophila-melanogaster

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

可视化和跟踪活果蝇黑色素细胞卵室的内源性 mRNA

活体成像 黑腹果蝇 胚胎血细胞迁移

准备个体 果蝇 用于活体成像的卵室

由于体积较大且结构相对简单，果蝇（Drosophila）的护卵细胞非常适合用于活细胞成像研究。本视频介绍了一种将外源性化合物通过显微注射导入细胞的方法，其中展示的实验方案以荧光寡核苷酸探针——即分子信标（molecular beacons,...

Drosophila 护理细胞的显微注射：一种细胞内递送方法

本文描述了一种对单个Drosophila卵母细胞中GFP标记的蛋白质或自发荧光结构进行活体成像的实验方案。...

活体成像GFP标记蛋白 果蝇 卵母细胞

本方案中所述的直立成像方法可实现对发育中黑腹果蝇（Drosophila...

直立成像 果蝇 卵室

光片荧光显微镜是发育生物学中最有价值的工具。在比较研究中，一个主要问题是环境变异。我们的实验方案描述了一种可同时对多个样本进行活体成像的实验框架，从而主动解决了这一问题。...

基于样品腔的光片荧光显微镜中对多个昆虫胚胎进行同步活体成像

在 果蝇卵母细胞核在卵子发生过程中会发生微管依赖性迁移。本文介绍了一种通过卵室活体成像来追踪该迁移过程的实验方案...

Drosophila 卵母细胞中的核迁移

在早期 果蝇 胚胎中许多细胞器具有运动性。原则上，可对它们进行活体成像 通过 特异性荧光探针，但卵壳阻碍了其对胚胎的直接应用。本方案描述了如何将此类探针引入胚胎 通过 显微注射，然后分析细胞器的大规模运动 通过...

可视化细胞骨架依赖性脂质囊泡在 Drosophila 胚胎中的运输

本方案描述了定制的基于抗体的荧光标记及其向早期Drosophila胚胎中的显微注射，以实现对低丰度蛋白或翻译后修饰的活体成像，这些目标分子使用传统的GFP/mCherry标签方法难以检测。...

在活体中可视化低丰度蛋白质及翻译后修饰 黑腹果蝇 胚胎 通过 荧光抗体注射

本文提供了一种详细的实验方案，用于对Drosophila卵巢微环境中生殖系干细胞（GSCs）的不对称分裂进行活体成像。我们使用了一种转基因品系，该品系普遍表达一种绿色荧光蛋白（GFP）与谱斑体蛋白Par-1的融合蛋白。...

延长活体成像果蝇雌性Drosophila melanogaster生殖系干细胞微环境

了解利用分子信标和转盘共聚焦显微镜实时追踪黑腹果蝇卵室内源性mRNA运输的方法。该技术可揭示RNA定位机制，为RNA相关疾病治疗提供新靶点。

在活细胞中可视化与追踪内源性 mRNA 黑腹果蝇卵室

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