Name: 字符串装配 grna 克隆 (stacr) 的可自定义协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学习STAgR方法用于CRISPR/Cas9多重gRNA载体克隆。本方案通过Gibson组装技术简化克隆流程，实现高效、可定制且低成本的基因编辑载体构建，适用于同时靶向多个基因的实验设计。

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作者感谢Stephan Beck教授和Jovica Ninkovic教授在开发STAgR方法过程中提供的意见、帮助与支持。感谢Tobias Klötzer、Anna Köferle和Valentin Baumann提出的有益建议。本工作得到德国研究基金会（DFG）（STR 1385/1-1）的资助。

1. STAgR 克隆策略的设计
<ol>
	<li>确定一个表达载体中将包含多少个gRNA表达盒及其排列顺序。确定每个gRNA应使用的启动子和gRNA骨架。利用任何在线工具设计gRNA例如， www.benchling.com</li>
</ol>
2. 带有突出端的STAgR克隆引物设计
注意：最后一条 gRNA 的有义原间隔序列和第一条 gRNA 的反义序列分别添加至用于扩增载体骨架的 PCR 引物中（图 1）。其余序列从片段中扩增获得，从而将有义和反义 gRNA 按照所需顺序连接。第一条片段使用一个正向引物（其末端突出包含第一条 gRNA 的 N20 序列）和一个反向引物（其末端突出包含第二条 gRNA 的 N20 序列的反向互补序列）进行扩增。后续所有片段均依此方式制备。
<ol>
	<li>将 N20 gRNA 序列作为末端突出序列添加至 STAgR DNA 串的正向扩增引物中（表 1）。将正义链 gRNA 序列添加至正向引物 &#34;scf-FP&#34;（用于常规支架）或 &#34;sam-FP&#34;（用于含 MS2 的支架）的 5' 端。FP 引物与相应 STAgR 串的支架/MS2 部分退火（图 1）。</li>
	<li>将 N20 gRNA 序列的反向互补序列添加至反向引物序列中。根据所使用的特定启动子和串选择 RP 引物（hU6-RP、mU6-RP、7sK-RP、H1-RP）。</li>
</ol>
3. STAgR 克隆片段的制备
<ol>
	<li>为进行Gibson组装以生成各自的克隆片段，进行PCR反应：加入10 µL高保真（HF）缓冲液、1 µL 10 mM dNTPs、0.25 µL 末端延伸引物（100 µM）、10 ng DNA模板（片段或载体）、0.5 µL HF聚合酶、1.5 µL二甲基亚砜（DMSO），并加入H2O，以终体积为50 µL。 
	注意：使用质粒 &#34;STAgR_Neo&#34; 作为骨架PCR的模板，将gRNA支架整合到最后一个gRNA中；如果选择SAM支架，则使用 &#34;STAgR_SAM&#34;以含有六个gRNA表达盒的STAgR质粒为例，需要进行六轮PCR，其中五轮以DNA片段为模板，一轮以载体骨架为模板。</li>
	<li>在PCR仪中孵育反应体系，程序设置如下：98 °C 预变性1次，1分30秒；38个循环：98 °C 变性10秒，59 °C（gRNA骨架）/68 °C（SAM环）退火10秒，72 °C 延伸30秒（用于插入片段）/1分30秒（用于载体）；72 °C 最终延伸1次，10分钟。</li>
	<li>从PCR反应中取出5.5 µL，加入上样染料，将扩增产物在1%琼脂糖凝胶上进行分析。加载合适的DNA分子量标记（100 bp DNA ladder/1 kb DNA ladder），并在适当的电泳缓冲液中运行凝胶例如，TLE缓冲液）中以120 V电泳30分钟。</li>
	<li>在凝胶电泳进行的同时，加入5 µL随限制性内切酶提供的缓冲液和0.5 µL Dpn加入I（10单位）至剩余的44.5 µL PCR反应体系中，37 °C孵育30分钟至1小时。</li>
	<li>使用磁珠进行DNA纯化。
	<ol>
		<li>每1 µL PCR产物中加入1.8 µL磁珠，用移液器吹打混匀。室温（RT）孵育2分钟。</li>
		<li>使用磁铁将磁珠与DNA片段从残留液体中分离。用70%乙醇洗涤磁珠两次，冲洗沉淀时勿完全重悬。</li>
		<li>用移液器吸除所有乙醇，让沉淀物自然风干。</li>
		<li>将沉淀溶解于15–20 µL H2用移液器反复吹打使珠子与液体分离，然后使用磁铁将珠子固定，将澄清的上清液转移至新管中。 
		注：也可使用基于层析柱的反应纯化试剂盒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用分光光度计测定DNA浓度，具体方法见其他文献29.</li>
</ol>
4. 吉布森组装反应与细菌转化
注意：以下步骤改编自 Gibson 等人30。
<ol>
	<li>制备自制的Gibson反应混合液，或使用市售的Gibson克隆试剂盒。
	<ol>
		<li>将3 mL pH 7.5的1 M Tris（三（羟甲基）氨基甲烷）-HCl、300 µL 1 M MgCl、60 µL 100 mM dGTP（脱氧鸟苷三磷酸）、60 µL 100 mM dATP（脱氧腺苷三磷酸）、60 µL 100 mM dTTP（脱氧胸苷三磷酸）、60 µL 100 mM dCTP（脱氧胞苷三磷酸）、300 µL 1 M DTT（二硫苏糖醇）、1.5 g PEG-8000（聚乙二醇）、300 µL 100 mM NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）混合，并加入H2O至总体积为6 mL，配制成5×等温反应缓冲液。 
		注意：分装后的缓冲液可在-20 °C保存至少12个月。</li>
		<li>对于Gibson组装主混合液，将320 µL 5×等温反应缓冲液与697 µL H2O混合，然后加入3 µL 10 U/µL T5核酸外切酶、20 µL 2 U/µL DNA聚合酶和160 µL 40 U/µL Taq DNA连接酶。 
		注意：该混合液可分装并在-20 °C保存至少12个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每反应使用7.5 µL组装主混合液，加入2.5 µL插入片段和载体。对于2x STAgR反应，使用1:1的载体与插入片段摩尔比，但总DNA量不超过0.2 pmol。当包含超过2个gRNA表达盒时，使用1:3的载体与插入片段摩尔比，但总DNA量不得超过0.5 pmol。 
	注意：所有扩增的gRNA表达盒应以等摩尔量使用。设置一个对照组，使用与实验组相同量的载体但不加插入片段，以检测未消化的模板载体（和/或自连）情况。</li>
	<li>将样品在50 °C孵育45至60分钟。随后将样品置于冰上或-20 °C保存，用于后续转化。 
	注意：本步骤可在此处暂停。</li>
	<li>将一半的反应混合物直接转化至化学感受态细菌中。
	<ol>
		<li>将化学感受态TOP10 E. coli细菌置于冰上解冻。</li>
		<li>向50 µL感受态细菌中加入5 µL Gibson混合液，轻轻弹击管底混匀。冰上孵育30分钟。</li>
		<li>进行热激处理：将离心管置于42 °C水浴或金属加热块中45秒。</li>
		<li>将离心管放回冰上。向细菌中加入250 µL SOC培养基，并在37 °C摇床培养箱中恢复培养30–45分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>恢复培养后，将转化后的细菌涂布于含氨苄青霉素（100 µg/mL）的1.5% LB（Luria-Bertani）琼脂平板上，37 °C过夜培养。</li>
</ol>
5. 通过细菌菌落PCR筛选STAgR克隆
<ol>
	<li>为每个构建体准备至少两组200 µL PCR反应管（每组3至24个），并进行相同的标记。</li>
	<li>向其中一组反应管中加入100 µL含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基。</li>
	<li>使用无菌移液器吸头刮取一个细菌菌落的生物材料，并将其涂抹在另一个空的100 µL PCR反应管底部。随后立即将该吸头转移至含有LB培养基的对应第二支反应管中。</li>
	<li>轻轻搅动吸头，确保部分细菌被转移至LB培养基中，随后在37 °C下孵育以备后续使用。</li>
	<li>配制PCR主混合液（每反应10 µL）。
	<ol>
		<li>对于10个反应，混合10 µL Taq 缓冲液、2 µL 10 mM dNTPs、0.5 µL 引物（100 µM）、0.5 µL Taq 聚合酶，并用H2O补足至100 µL总体积。</li>
		<li>使用以下引物：StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG，StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向未加LB培养基的已标记PCR反应管中各加入10 µL PCR主混合液。</li>
	<li>将反应体系置于热循环仪中，按以下条件进行扩增：94 °C预变性5 min（1个循环）；94 °C变性30 s、55 °C退火30 s、72 °C延伸2 min（共38个循环）；72 °C最终延伸10 min（1个循环）。 
	注意：延伸时间（72 °C步骤）应随gRNA表达盒数量的增加而延长。请参考表2计算插入片段的理论大小，并按照每1 kb DNA在72 °C下延伸1 min的标准设定时间。</li>
	<li>加入上样染料，将扩增产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。使用合适的DNA分子量标准（如1 kb DNA Ladder），并在适当的电泳缓冲液（例如，TLE缓冲液）中以120 V电压电泳30 min。</li>
	<li>通过累加所用启动子、gRNA骨架及N20序列数量的各自长度，结合表2计算扩增子的理论大小。根据菌落PCR结果，通过条带大小判断细菌克隆是否可能含有正确构建的载体。</li>
	<li>将前期制备的100 µL菌液接种至含100 µg/mL氨苄青霉素的2.5 mL LB培养基中，于37 °C培养12小时，制备过夜培养物。</li>
	<li>使用商业化质粒小提试剂盒及其说明书推荐的操作步骤提取质粒DNA31。</li>
	<li>采用以下引物对质粒进行Sanger测序：StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG)、StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) 和 StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG)。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种用于STAgR的详细实验方案，可快速、简便地构建不同大小的gRNA表达质粒。该方案可用于一步式构建含有2–8个gRNA表达盒（可选是否包含两个MS2 RNA适配体）的gRNA质粒，并将其克隆至gRNA表达载体STAgR_Neo中，同时可使用人U6、小鼠U6、人7sK和人H1启动子28,32,33。若需构建超过四个表达盒，建议至少使用两种不同的启动子/支架类型以提高效率。其他载体、启动子及其组合，以及超过8个gRNA表达盒的情况也可能实现，但尚未经过验证。尽管本方法在我们的经验中具有可靠性和可重复性，我们仍确定了关键步骤并提供了相应的故障排除策略，以防未达到预期结果。根据我们的经验，以下步骤对实验成功至关重要：首先，在Gibson组装步骤中，插入片段与载体骨架的摩尔比必须正确（推荐为3:1）。然而，我们发现对于某些gRNA组合，即使gRNA表达盒数量超过两个，采用插入片段与载体1:1的摩尔比反而更有利。其次，Gibson组装反应的时间应足够长（建议至少45分钟）。
STAgR 可以与大量修饰联用。靶向序列、gRNA 数量和支架、启动子以及载体骨架均可定制并自由组合。然而，每种组合可能具有略微不同的要求。根据我们的经验，如果需要中等或较多数目的 gRNA 表达盒（&#62;4），但未能立即获得，通常最快解决此问题的方法是改变载体中各个 gRNA 表达盒的顺序。类似地，在克隆多个 gRNA 表达盒时，组合使用不同的 gRNA 启动子和支架可提高效率（从而减少需要检测的菌落 PCR 数量）。我们发现，错误克隆通常是在吉布森组装（Gibson assembly）过程中由重复序列自发连接所致。尽管这可能会降低方法的效率，但同时也导致了含有功能性 gRNA 子集的载体被同时生成28。
已有多种不同方法被用于构建包含多个gRNA表达盒的多重gRNA载体21,22,23,24,25,26,27。部分方法采用同时或连续克隆gRNA对22,34，而其他方法则依赖于Golden Gate组装及多个连续克隆步骤25,35。Xie et al.采用了一种特殊策略，利用细胞内源性的tRNA加工系统，从单一前体转录本中切割出多个gRNA36。该方法的优势在于仅需一个启动子；缺点则是每种gRNA组合均需合成新的DNA片段。每种gRNA多重化方法均有其优缺点；STAgR方法则结合了操作简便、效率高、可容纳大量gRNA表达盒以及低成本的优势。
STAgR（以及其他多重化系统）有望在实现多个基因的高效（且同步）敲除方面发挥关键作用 体内，如在斑马鱼大脑中首次实现的那样28gRNA多重化载体的另一个未来应用前景在于调控完整的转录程序，而非单一基因的激活或抑制。这些方法有望实现对细胞和器官的转化程度远超当前技术水平。

串联组装gRNA克隆（STAgR）是一种能够在单次克隆步骤中高效地在一夜之内构建包含多个gRNA表达盒的表达载体的方法。STAgR实验方案无需特殊的专业技术或材料，并提供多种定制化选择。
细菌的CRISPR蛋白Cas9具有一种独特的能力：它能够识别并选择性结合仅存在于天然crRNA或人工设计的gRNA中所编码的DNA序列1。作为分子工具的应用，使得大量过去无法实现、不可行或仅限于特定细胞模型的研究方法成为可能。这些方法包括靶向基因突变2、基因组编辑3、表观基因组编辑4,5,6、转录激活以及基因沉默7,8。据我们所知，CRISPR具有普适性，已有大量报道显示其在多种靶位点、细胞类型和物种中成功应用。然而，许多CRISPR应用直接或间接依赖于多个gRNA的递送，包括一系列基因组操作（如染色体易位9,10、中等规模11和大规模基因组改变12,13）、基因组工程（如使用Cas9切口酶14、条件等位基因的构建11,15或连续突变16）以及谱系示踪策略17。此外，对于其他一些方法（如转录调控工程18、表观基因组工程19,20），虽然多个靶向位点并非绝对必需，但通常只有在使用多个gRNA时才能达到最佳效果。
已有多种有用的方法被用于构建包含多个gRNA表达盒的gRNA载体21,22,23,24,25,26,27。本文介绍一种STAgR（string assembly gRNA cloning，串联组装gRNA克隆）方案，该方法在简便性与快速性方面表现突出（仅需一个过夜克隆步骤），具有低成本（DNA模板可多次重复使用）、可定制性（适用于不同的gRNA系统和启动子）以及高效性（可构建包含大量gRNA表达盒的载体）等优势28。
原则上，STAgR 可用于构建表达载体，所含表达盒数量可少至几个（1–2 个 gRNA）、中等数量（3–5 个 gRNA），甚至达到目前报道的最高水平（6–8 个 gRNA）28。同样，STAgR 适用于任何 gRNA 序列、载体骨架或启动子。然而，由于 STAgR 主要基于聚合酶链式反应（PCR）和吉布森组装（Gibson assembly），对于序列相似性较高的 gRNA，应采用其他方法进行构建。

<table><tbody><tr><td>Phusion 高保真 DNA 聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td>用于 Gibson 主混合液以及所有 PCR 反应的聚合酶</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Life Technology</td><td>R0191</td><td>用于所有 PCR 反应的 dNTPs</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Life Technology</td><td>R0141</td><td>用于 Gibson 主混合液的 dNTPs</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Life Technology</td><td>R0151</td><td>用于 Gibson 主混合液的 dNTPs</td></tr><tr><td>dGTP</td><td>Life Technology</td><td>R0161</td><td>用于 Gibson 主混合液的 dNTPs</td></tr><tr><td>dTTP</td><td>Life Technology</td><td>R0171</td><td>用于 Gibson 主混合液的 dNTPs</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>VWR</td><td>443666A</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP 磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>用于 DNA 纯化</td></tr><tr><td>Tris HCL</td><td>Roth</td><td>9090.2</td><td>用于 Gibson 主混合液</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Life Technology</td><td>R0861</td><td>用于 Gibson 主混合液</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>VWR</td><td>RC- 077</td><td>用于 Gibson 主混合液</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Cayman Chemicals Company</td><td>16077</td><td>用于 Gibson 主混合液</td></tr><tr><td>T5 核酸外切酶</td><td>NEB</td><td>M0363S</td><td>用于 Gibson 主混合液</td></tr><tr><td>Taq DNA 连接酶</td><td>NEB</td><td>M0208S</td><td>用于 Gibson 主混合液</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>SigmaAldrich</td><td>PHR1393-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNA 标准品 1 kb Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>质粒与引物序列</td><td></td><td></td><td>所有序列可在 Figshare 获取（https://goo.gl/UGdc3Q）。</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReacAppliChem</td><td>6381-92-6</td><td>用于 TLE 缓冲液</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>SigmaAldrich</td><td>M8266</td><td>用于 Gibson 主混合液</td></tr><tr><td>Top10 化学感受态细菌</td><td>Thermo Scientific</td><td>C404003</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. 培养基</td><td>Thermo Scientific</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>SigmaAldrich</td><td>Y1625</td><td>用于溶菌肉汤（LB 培养基）</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>S7653</td><td>用于溶菌肉汤（LB 培养基）</td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>SigmaAldrich</td><td>91249</td><td>用于溶菌肉汤（LB 培养基）</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>SigmaAldrich</td><td>5040</td><td>用于溶菌肉汤（LB 培养基）</td></tr><tr><td>Taq DNA 聚合酶</td><td>Quiagen</td><td>201203</td><td></td></tr></tbody></table>

一种可定制的串联组装grna克隆（stagr）方案

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

细菌的CRISPR/Cas9系统极大地拓展了生命科学家的方法学选择。由于该系统的应用，遗传与基因组工程已可广泛适用于多种体系。此外，许多转录调控和表观基因组工程策略如今首次实现了普遍可行性。CRISPR具有广泛应用性的一个原因在于其双组分特性：短小的向导RNA（gRNA）决定了该复合物的基因组靶点、Cas9蛋白的不同变体以及局部的分子效应。然而，许多CRISPR技术依赖于将多个gRNA同时递送至单个细胞中。本文介绍了一种可定制的串联组装gRNA克隆（STAgR）方案，该方法可在单次克隆步骤中简便、快速且高效地构建多重gRNA表达载体。STAgR具有成本效益，因为在本方案中，各个靶向序列通过短的突出端引物引入，而gRNA表达盒的长DNA模板则可多次重复使用。此外，STAgR支持在单一步骤中插入大量gRNA，以及不同gRNA变体、载体和启动子的任意组合。

采用本方案可实现定制化多重gRNA载体的构建（图1）。图2展示了使用六种不同gRNA表达盒进行STAgR操作的代表性结果。图2A显示了用于获取STAgR片段的PCR反应的典型结果（方案3.1–3.3）。六个扩增产物（BB、S1–S5）为线性DNA片段，其两端分别含有各自的gRNA N20序列。质粒骨架（BB）现已通过gRNA1和gRNA6的靶向序列进行延伸，因此具备与另外两个PCR产物（S1和S5）进行Gibson组装所需的同源末端（图2A，表3）。经纯化后，载体和插入片段的DNA得率均可达到至少1 µg。
Gibson 组装后，细菌转化应产生 100 至 700 个细菌菌落。图 2B 展示了采用含有六个 gRNA 表达盒的 STAgR 方案后，通过菌落 PCR 对 10 个细菌菌落进行的代表性分析。凝胶电泳结果表明，其中有三个克隆显示出完整组装预期的扩增片段大小（表 2）。其他克隆可能获得了含有一个至五个 gRNA 表达盒的 STAgR 载体，而其中一个克隆（图 2B，编号 18）为空载体。
<img alt="包含引物、序列和骨架模板的基因编辑示意图；启动子序列整合。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58556/58556fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：STAgR 引物设计概览。 首先选择第一个 gRNA 编号及其支架，然后确定 gRNA 的顺序和启动子，最后确定应使用的载体类型。针对每个 gRNA，设计一条特异性正向引物，该引物包含以正义方向排列的 gRNA 靶向序列，以及“scf-FP”或“sam-FP”的通用部分。类似地，为生成各自的反向引物，将相应启动子序列（RP）与下一个 gRNA 的 N20 序列的反向互补序列进行融合。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58556/58556fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="PCR凝胶电泳；序列/载体分析；gRNA结果；DNA片段可视化；实验示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58556/58556fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：使用六种不同gRNA表达盒的STAgR方法的代表性结果。（A）五个插入片段以及载体STAgR_Tomato的PCR代表性示例。（B）使用hU6和mU6启动子以及经典gRNA和SAM支架的6x STAgR反应的菌落PCR。共分析了22个细菌菌落，其中7个显示出预期条带，表明组装完整。DNA分子量标准：1 kb plus，数值单位为碱基对（bp）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58556/58556fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>用于支架和载体的正向引物</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scaffold_fwd</td>
			<td>GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAM_fwd</td>
			<td>GTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>用于支架和载体的反向引物</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hU6_rev</td>
			<td>CGGTGTTTCGTCCTTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mU6_rev</td>
			<td>CAAACAAGGCTTTTCTCCAAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hH1_rev</td>
			<td>CTGGGAAAGAGTGGTCTCATACAGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>h7SK_rev</td>
			<td>CCGAGGTACCCAAGCGG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：gRNA骨架和启动子的引物序列。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>启动子和支架的大小。</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hU6</td>
			<td>265 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hH1</td>
			<td>225 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mU6</td>
			<td>316 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>h7SK</td>
			<td>245 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gRNA支架</td>
			<td>83 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAMloop + gRNA支架</td>
			<td>143 bp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：用于计算菌落PCR结果的各表达盒理论大小。
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>hU6</td>
			<td>hH1</td>
			<td>mU6</td>
			<td>h7SK</td>
			<td>STAgR_Neo</td>
			<td>STAgR_tdTomato</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gRNA Scf</td>
			<td>400 bp</td>
			<td>360 bp</td>
			<td>451 bp</td>
			<td>380 bp</td>
			<td>3722 bp</td>
			<td>4487 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAM</td>
			<td>460 bp</td>
			<td>420 bp</td>
			<td>511 bp</td>
			<td>440 bp</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：启动子与支架的尺寸。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>hU6</td>
			<td>hH1</td>
			<td>mU6</td>
			<td>h7SK</td>
			<td>STAgR_Neo</td>
			<td>STAgR_tdTomato</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gRNA Scf</td>
			<td>368 bp</td>
			<td>328 bp</td>
			<td>419 bp</td>
			<td>348 bp</td>
			<td>+74 bp</td>
			<td>+67 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAM</td>
			<td>428 bp</td>
			<td>388 bp</td>
			<td>479 bp</td>
			<td>408 bp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：PCR后STAgR片段的计算大小。

本文介绍了串联组装gRNA克隆（STAgR）方法，该方法可轻松实现CRISPR/Cas9技术中gRNA载体的多重化。STAgR使gRNA多重化过程变得简单、高效且可定制。

一种可定制的串联组装gRNA克隆（STAgR）方案

细菌的 CRISPR/Cas9 系统极大地拓展了生命科学家的研究方法。由于该系统的应用，遗传学与基因组学……

细菌的 CRISPR-Cas9 系统极大地拓展了生命科学家的实验手段。然而，多种 CRISPR 技术依赖于将多个向导 RNA 同时递送至单个细胞。串联组装 gRNA 克隆技术可在单次克隆步骤中快速、简便地构建多重 gRNA 表达载体。但STAgR不仅操作简单，而且高效、成本低廉且易于定制。首先，将N20 gRNA序列作为末端突出序列添加至STAgR DNA片段的正向扩增引物上。对于常规支架，将正义链gRNA序列添加至支架正向引物（Scaffold forward primer）的5'端；对于含MS2的支架，则添加至SAM正向引物（SAM forward primer）的5'端。接下来，将反向互补的 N20 gRNA 序列添加到反向引物序列中，根据所用的特定启动子和序列选择反向引物（RP）。为开始生成用于吉布森组装（Gibson Assembly）的单个克隆片段，将 10 µL 高保真缓冲液转移至离心管中。加入 1 µL 10 mmol/L dNTPs 以及各 0.25 µL 的 100 µmol/L 末端引物。加入10纳克的DNA模板链或载体，以及1.5微升的DMSO。加入足够的水使终体积达到49.5微升，然后加入0.5微升的HF聚合酶。按照文本方案中所述，将反应置于热循环仪中孵育。此后，从PCR反应中取出5.5 µL的等分试样。向所有等分试样中加入上样染料，并将其加样至1%琼脂糖凝胶上。同时加载合适的DNA分子量标记物，使用适当的凝胶电泳缓冲液，在120伏电压下电泳30分钟。在凝胶电泳进行的同时，向剩余的44.5 µL载体PCR反应产物中加入5 µL限制性内切酶配套提供的缓冲液和0.5 µL DpnI，以去除PCR过程中残留的质粒模板。37°C孵育30至60分钟。检查扩增产物是否为预期大小。开始DNA纯化时，每1微升PCR产物中加入1.8微升磁珠，通过移液器上下吹打混匀。室温孵育2分钟。使用磁力架将磁珠结合的DNA片段与残余液体分离。用70%乙醇冲洗沉淀，不要完全重悬，以洗涤磁珠。重复此洗涤步骤一次。使用移液器吸除所有乙醇，并让沉淀在空气中干燥。然后加入15至20微升水，用移液器上下吹打混合，以溶解沉淀物。使用磁铁将磁珠与液体分离。将澄清的上清液转移至新离心管中。此后，使用分光光度计测定DNA浓度。首先，按照文本方案中所述配制5x等温反应缓冲液。对于Gibson Assembly预混液，将320 µL的5x等温反应缓冲液与697 µL水混合。加入3 µL T5核酸外切酶、20 µL DNA聚合酶和160 µL Taq DNA连接酶。将7.5 µL组装主混合液转移至新离心管中，然后按照文本方案所述，加入2.5 µL插入载体中的片段。将样品在50摄氏度下孵育45至60分钟。孵育结束后，将样品置于冰上或20摄氏度保存，用于后续转化。当准备转化细菌时，将化学感受态TOP10 E. coli细菌在冰上解冻。接下来，将5 µL Gibson反应混合液加入50 µL感受态细菌中，通过轻轻弹击管底混匀。冰上孵育30分钟。将离心管置于42 °C水浴或加热块中45秒，对细菌进行热激处理。然后将离心管放回冰上。向细菌中加入 250 µL SOC 培养基，并在 37 °C 摇床培养箱中复苏 30 至 45 分钟。细菌复苏后，将其涂布于含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 1.5% LB 琼脂平板上。将培养皿在37摄氏度下孵育过夜。首先，为每个构建体准备至少两组200微升PCR反应管。将其中一组反应管加入含100微克/毫升氨苄青霉素的100微升LB培养基。使用无菌的移液器吸头，刮取一个细菌菌落的生物材料，并将其涂抹于一个空的 200 微升 PCR 反应管底部。立即将移液器吸头转移至含有 LB 培养基的第二个对应的反应管中。轻轻旋转吸头，确保部分细菌被转移至 LB 培养基中。37 摄氏度孵育以备后续使用。然后，按照文本方案中的说明，每根反应管准备 10 微升 PCR 预混液。将 10 微升 PCR 预混液加入已标记的 PCR 反应管中，不含 LB 培养基。使用热循环仪，按照文本方案中所述的条件孵育反应。随后，向扩增产物中加入上样染料，并将样品上样至1%琼脂糖凝胶。同时加入合适的DNA分子量标记物用于片段大小比对，在适当的电泳缓冲液中以120伏电压电泳30分钟。通过将所用启动子、gRNA支架以及N20序列的数量各自的大小相加，计算扩增片段的理论大小。根据菌落PCR结果，基于正确的条带大小判断细菌克隆是否可能含有正确的载体。使用相应的100微升培养物，接种含有100微克/毫升氨苄青霉素的2.5毫升LB过夜培养液。在37摄氏度下孵育12小时。然后，根据制造商说明书，使用商业质粒小提试剂盒提取质粒DNA。本实验采用string assembly gRNA克隆方法，以快速构建gRNA表达质粒。此处显示的是用于获取 STAgR 片段的 PCR 反应的典型结果。这六个扩增产物代表线性 DNA 片段，每个片段的两端均含有各自的 gRNA N20 序列。质粒骨架上已添加了 gRNA1 和 gRNA6 的靶向序列，因此具备与另外两个 PCR 产物进行吉布森连接（Gibson Assembly）所需的重叠序列。纯化后，载体和插入片段的DNA产量可达到至少一微克。经Gibson组装后，细菌转化可产生100至700个细菌菌落。采用STAgR方案对22个细菌菌落进行代表性分析，使用六个gRNA表达盒进行菌落PCR，结果显示有七个克隆显示出完整组装预期的扩增片段大小。其他克隆可能获得了含有一个至五个gRNA表达盒的STAgR载体，而其中一个克隆则完全为空载体。一旦掌握该技术，可在数小时内完成操作。若操作得当，可在不到一个工作周的时间内构建出大量多重gRNA表达载体。在进行该实验操作时，需特别注意N20悬垂引物的正确分配与组合。观看本视频后，您应能够充分掌握如何构建自己的多重向导RNA表达载体。

a-customizable-protocol-for-string-assembly-grna-cloning-stagr

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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一种可定制的串联组装gRNA克隆（STAgR）方案

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