字符串装配 grna 克隆 (stacr) 的可自定义协议

细菌CRISPR-Cas9系统大大增加了生命科学家的实验选择。但是，几种 CRISPR 方法依赖于将多个引导 RNA 同时传递到单个单元。字符串组装 gRNA 克隆允许在单个克隆步骤中简单快速生成多路复用 gRNA 表达载体。

但STAgR不仅简单，而且高效，便宜，易于定制。首先，将 N20 gRNA 序列添加到 STAgR DNA 字符串的向前放大底转中，作为悬垂。将 sense gRNA 序列五个底数添加到前底图、脚手架前底图、常规脚手架或包含 MS2 的脚手架的 SAM 前进底转。

接下来，将反向补充 N20 gRNA 序列添加到反向底因序列中，根据使用的特定启动子和字符串选择 RP 底转。要开始为吉布森组件生成单个克隆片段，请将 10 微升高保真缓冲液转移到管中。添加一个微升 10 英里 dNTP 和 0.25 微升两个 100 微摩尔悬垂底片。

添加 10 个 DNA 模板字符串或矢量的南图和 1.5 微升的 DMSO。加入足够的水，使最终体积达到49.5微升，然后加入0.5微升HF聚合酶。如文本协议中所述，在热循环器上孵化反应。

在此之后，从PCR反应中服用5.5微升等分。将装载染料添加到所有等分中，并将其装入 1%的加糖凝胶上。加载适当的脱氧核糖核酸梯进行尺寸调整，并在适当的凝胶运行缓冲液中以 120 伏运行 30 分钟运行凝胶。

在凝胶运行时，在含有限制性酶的缓冲液中加入5微升，在剩余的44.5微升向向量PCR反应中加入0.5微升DpnI，以去除PCR期间使用的残留质粒模板。在37摄氏度下孵育30至60分钟。检查以确保安普利森大小正确。

要开始DNA纯化，每微升PCR产品添加1.8微升磁珠，然后上下移液混合。在室温下孵育两分钟。使用磁铁，将DNA片段中的珠子与残留液体分离。

用70%乙醇冲洗颗粒，无需完全重新暂停，即可清洗珠子。再重复一次此洗涤。使用移液器，取出所有乙醇，让颗粒干燥。

然后加入15至20微升水，上下移液器混合和溶解颗粒。使用磁铁将珠子与液体分离。将透明上清液转移到新管中。

在此之后，使用分光光度计确定DNA浓度。首先，准备文本协议中详述的5倍等温反应缓冲液。对于吉布森装配主混合，将 5 倍等温反应缓冲液的 320 微升与 697 微升水混合。

加入3微升T5外核酶、20微升DNA聚合酶和160微升TaqDNA利连酶。将 7.5 微升的装配主混合转移到新鲜管中。然后添加 2.5 微升插入向量，如文本协议中所述。

在50摄氏度下孵育样品45至60分钟。在此之后，将样品储存在冰上，或在20摄氏度下，以便进行后续转化。当准备改变细菌时，在冰上解冻化学能力 TOP10 E.Coli 细菌。

接下来，将吉布森混合的五微升添加到50微升的称职细菌中，然后轻轻轻拂管底进行混合。在冰上孵育30分钟。将管子放在42摄氏度的水浴或热块中45秒，以热击细菌。

然后，把管子放回冰上。在细菌中加入250微升的S、C培养素，让它们在37摄氏度的高温下在摇培养箱中恢复30至45分钟。细菌恢复后，将它们板到1.5%LB的阿加板上，每毫升安他西林含有100微克。

在夜间在37摄氏度下孵育盘子。首先，为每种结构准备至少两套200微升PCR反应管。用100微升LB介质填充其中一组反应管，每毫升安他西林含有100微克。

使用无菌移液器尖端，从一个细菌群体中刮掉生物材料，并扩散在空的200微升PCR反应管的底部。立即将移液器尖端转移到包含 LB 介质的第二个相应反应管。旋转尖端，以确保一些细菌被转移到LB介质。

在37摄氏度下孵育，供以后使用。然后，准备10微升的PCR主混合每个反应管，如文本协议中概述。将 10 微升 PCR 主混合添加到标有 PCR 反应管，无需 LB 介质。

使用热循环器，孵化文本协议中概述的反应。在此之后，将加载染料添加到放大的碎片中，并将它们加载到 1%的加糖凝胶上。加载适当的脱氧核糖核酸梯进行尺寸调整，并在适当的凝胶运行缓冲液中以 120 伏运行 30 分钟运行凝胶。

通过添加已用启动子、gRNA 基架和 N20 序列数的单个尺寸来计算放大器的理论大小。从菌落PCR的结果，确定细菌克隆，基于正确的波段大小，以及它们是否可能藏有正确的载体。使用相应的100微升培养，接种含有每毫升100微克每毫升安西林的2.5毫升隔夜LB培养素。

在37摄氏度下孵育12小时。然后，使用商业质粒微型套件提取质粒DNA，根据制造商的说明。在这个过程中，字符串组装gRNA克隆用于快速生成gRNA表达质粒。

此处可以看到用于获取 STAgR 片段的 PCR 的典型结果。六个安普利子表示线性DNA片段，每个片段的末端都包含单独的gRNA N20序列。质粒骨干与gRNA1和gRNA6的靶向序列一起扩展，因此具有吉布森大会所需的两个PCR的重叠。

纯化后，可对载体和插入物进行至少一微克的DNA生成。吉布森组装后，细菌转化导致100至700个细菌菌落。对22个细菌菌落进行代表性分析，通过带6个gRNA盒的STAgR协议，通过菌落PCR，表明7个克隆显示全组装的预期安培量。

其他克隆可能接收STAgR向量，包含1至5个gRNA盒，而一个克隆是完全空的。一旦掌握了，这项技术可以在几个小时内完成。执行得当，它允许在一周内生成多种多路复用 gRNA 表达载体。

在尝试此过程时，必须注意 N20 悬伸底项的正确分配和组合。观看此视频后，您应该对如何创建自己的多路复用指南 RNA 表达载体有一个很好的了解。