一种可定制的串联组装gRNA克隆（STAgR）方案

细菌的 CRISPR-Cas9 系统极大地拓展了生命科学家的实验手段。然而，多种 CRISPR 技术依赖于将多个向导 RNA 同时递送至单个细胞。串联组装 gRNA 克隆技术可在单次克隆步骤中快速、简便地构建多重 gRNA 表达载体。

但STAgR不仅操作简单，而且高效、成本低廉且易于定制。首先，将N20 gRNA序列作为末端突出序列添加至STAgR DNA片段的正向扩增引物上。对于常规支架，将正义链gRNA序列添加至支架正向引物（Scaffold forward primer）的5'端；对于含MS2的支架，则添加至SAM正向引物（SAM forward primer）的5'端。

接下来，将反向互补的 N20 gRNA 序列添加到反向引物序列中，根据所用的特定启动子和序列选择反向引物（RP）。为开始生成用于吉布森组装（Gibson Assembly）的单个克隆片段，将 10 µL 高保真缓冲液转移至离心管中。加入 1 µL 10 mmol/L dNTPs 以及各 0.25 µL 的 100 µmol/L 末端引物。

加入10纳克的DNA模板链或载体，以及1.5微升的DMSO。加入足够的水使终体积达到49.5微升，然后加入0.5微升的HF聚合酶。按照文本方案中所述，将反应置于热循环仪中孵育。

此后，从PCR反应中取出5.5 µL的等分试样。向所有等分试样中加入上样染料，并将其加样至1%琼脂糖凝胶上。同时加载合适的DNA分子量标记物，使用适当的凝胶电泳缓冲液，在120伏电压下电泳30分钟。

在凝胶电泳进行的同时，向剩余的44.5 µL载体PCR反应产物中加入5 µL限制性内切酶配套提供的缓冲液和0.5 µL DpnI，以去除PCR过程中残留的质粒模板。37°C孵育30至60分钟。检查扩增产物是否为预期大小。

开始DNA纯化时，每1微升PCR产物中加入1.8微升磁珠，通过移液器上下吹打混匀。室温孵育2分钟。使用磁力架将磁珠结合的DNA片段与残余液体分离。

用70%乙醇冲洗沉淀，不要完全重悬，以洗涤磁珠。重复此洗涤步骤一次。使用移液器吸除所有乙醇，并让沉淀在空气中干燥。

然后加入15至20微升水，用移液器上下吹打混合，以溶解沉淀物。使用磁铁将磁珠与液体分离。将澄清的上清液转移至新离心管中。

此后，使用分光光度计测定DNA浓度。首先，按照文本方案中所述配制5x等温反应缓冲液。对于Gibson Assembly预混液，将320 µL的5x等温反应缓冲液与697 µL水混合。

加入3 µL T5核酸外切酶、20 µL DNA聚合酶和160 µL Taq DNA连接酶。将7.5 µL组装主混合液转移至新离心管中，然后按照文本方案所述，加入2.5 µL插入载体中的片段。

将样品在50摄氏度下孵育45至60分钟。孵育结束后，将样品置于冰上或20摄氏度保存，用于后续转化。当准备转化细菌时，将化学感受态TOP10 E. coli细菌在冰上解冻。

接下来，将5 µL Gibson反应混合液加入50 µL感受态细菌中，通过轻轻弹击管底混匀。冰上孵育30分钟。将离心管置于42 °C水浴或加热块中45秒，对细菌进行热激处理。

然后将离心管放回冰上。向细菌中加入 250 µL SOC 培养基，并在 37 °C 摇床培养箱中复苏 30 至 45 分钟。细菌复苏后，将其涂布于含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 1.5% LB 琼脂平板上。

将培养皿在37摄氏度下孵育过夜。首先，为每个构建体准备至少两组200微升PCR反应管。将其中一组反应管加入含100微克/毫升氨苄青霉素的100微升LB培养基。

使用无菌的移液器吸头，刮取一个细菌菌落的生物材料，并将其涂抹于一个空的 200 微升 PCR 反应管底部。立即将移液器吸头转移至含有 LB 培养基的第二个对应的反应管中。轻轻旋转吸头，确保部分细菌被转移至 LB 培养基中。

37 摄氏度孵育以备后续使用。然后，按照文本方案中的说明，每根反应管准备 10 微升 PCR 预混液。将 10 微升 PCR 预混液加入已标记的 PCR 反应管中，不含 LB 培养基。

使用热循环仪，按照文本方案中所述的条件孵育反应。随后，向扩增产物中加入上样染料，并将样品上样至1%琼脂糖凝胶。同时加入合适的DNA分子量标记物用于片段大小比对，在适当的电泳缓冲液中以120伏电压电泳30分钟。

通过将所用启动子、gRNA支架以及N20序列的数量各自的大小相加，计算扩增片段的理论大小。根据菌落PCR结果，基于正确的条带大小判断细菌克隆是否可能含有正确的载体。使用相应的100微升培养物，接种含有100微克/毫升氨苄青霉素的2.5毫升LB过夜培养液。

在37摄氏度下孵育12小时。然后，根据制造商说明书，使用商业质粒小提试剂盒提取质粒DNA。本实验采用string assembly gRNA克隆方法，以快速构建gRNA表达质粒。

此处显示的是用于获取 STAgR 片段的 PCR 反应的典型结果。这六个扩增产物代表线性 DNA 片段，每个片段的两端均含有各自的 gRNA N20 序列。质粒骨架上已添加了 gRNA1 和 gRNA6 的靶向序列，因此具备与另外两个 PCR 产物进行吉布森连接（Gibson Assembly）所需的重叠序列。

纯化后，载体和插入片段的DNA产量可达到至少一微克。经Gibson组装后，细菌转化可产生100至700个细菌菌落。采用STAgR方案对22个细菌菌落进行代表性分析，使用六个gRNA表达盒进行菌落PCR，结果显示有七个克隆显示出完整组装预期的扩增片段大小。

其他克隆可能获得了含有一个至五个gRNA表达盒的STAgR载体，而其中一个克隆则完全为空载体。一旦掌握该技术，可在数小时内完成操作。若操作得当，可在不到一个工作周的时间内构建出大量多重gRNA表达载体。

在进行该实验操作时，需特别注意N20悬垂引物的正确分配与组合。观看本视频后，您应能够充分掌握如何构建自己的多重向导RNA表达载体。