Name: 基于细胞健康监测的实时细胞成像分析对低密度脂蛋白胆固醇的吸收检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 学习实时细胞成像技术检测低密度脂蛋白胆固醇吸收的方法，使用HepG2、HK2和HCAECs等人类细胞系。该技术可同时监测细胞形态以评估化合物毒性，支持胆固醇代谢研究和药物开发。

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本研究获得了以下资助：LAS 收到美国国立卫生研究院（R56HL132209 和 1R01HL140468）以及迈阿密心脏研究所的资助。KY 获得了美国心脏协会博士前奖学金（18PRE33960070）。HepG2 细胞由迈阿密大学米勒医学院的 Emmanuel Thomas 博士惠赠46,47,48。

1. 在24孔板中接种细胞
<ol>
	<li>吸去细胞培养基，用 5 mL 的杜氏磷酸盐缓冲液（dPBS）洗涤细胞，然后吸去 dPBS。对于 100 mm 培养皿中的 HepG2 细胞，使用 1.5 mL 的 0.25% 胰蛋白酶/EDTA；对于 HK2 细胞或 HCAEC 细胞，使用 1.5 mL 的 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 溶液以解离细胞。</li>
	<li>将培养皿置于 37 °C 培养箱中孵育 4 分钟，或直至细胞完全解离。孵育 4 分钟后，加入 3 mL 完全培养基（针对 HepG2 和 HK2 细胞）或 3 mL 胰蛋白酶中和液（含 5% 胎牛血清的 dPBS）以中和胰蛋白酶活性。</li>
	<li>将细胞转移至 15 mL 圆锥形离心管中，在 250 × g 条件下离心 5 分钟，吸去上清液，并用完全培养基重悬细胞沉淀。</li>
	<li>轻轻将细胞悬液通过 40 μm 孔径的细胞筛过滤，以分散细胞团块。切勿用液体冲洗细胞筛上的残留物。</li>
	<li>计数细胞，并以优化的密度接种。例如，在 24 孔板中，每孔接种 5,000 个 HepG2 细胞，或每孔接种 10,000 个 HK2 细胞或 HCAEC 细胞，可获得最佳实验结果。</li>
	<li>将培养板在 37 °C 条件下过夜孵育，使细胞充分贴壁。</li>
	<li>次日，更换为相应细胞系的基础培养基（不含 FBS），并添加 5% 脂蛋白缺陷血清（LPDS）或低浓度（2%）FBS 培养基，具体根据实验处理条件而定（参见步骤 1.7）。继续孵育 24 小时以进行细胞饥饿处理。在 24 孔板中，每孔使用 500 μL 总培养体积。</li>
	<li>随后以以下三种方式之一处理细胞：加入 10 µg/mL 的重组 PCSK9（rPCSK9）（或对照溶剂），并将细胞放回 37 °C 培养箱孵育 1 小时；加入 40 µM Dynasore Hydrate（或对照溶剂二甲基亚砜），放回 37 °C 培养箱孵育 10 分钟；或加入 1 µM 辛伐他汀（Simvastatin）（或对照溶剂二甲基亚砜），放回 37 °C 培养箱孵育 12、18 或 24 小时。rPCSK9 或 Dynasore 处理时使用含 5% LPDS 的培养基；辛伐他汀处理时使用低（2%）FBS 培养基或含 5% LPDS 的培养基。 
	注意：对于长期实验，可在更换脂蛋白饥饿培养基时（步骤 1.6）同时加入待处理化合物；对于短期实验，则可在分析前进行处理。此外，也可根据实验类型和目的自定义处理时间。</li>
	<li>随后，向每孔加入 5 µL pHrodo 红色荧光标记的低密度脂蛋白（LDL）（储存液浓度为 1 mg/mL），使终浓度达到 10 µg/mL。然后，小心去除孔中的气泡。</li>
</ol>
2. 活细胞分析
<ol>
	<li>加入标记的LDL后，立即将培养板放入活细胞分析系统培养箱中（参见材料表），并让培养板平衡15分钟，以减少培养板内的冷凝现象。</li>
	<li>在此期间，打开软件并通过添加放置培养板的容器来设置扫描程序。使用红色和相差通道，以10倍物镜每小时拍摄一次，每次每孔拍摄16张图像，持续4小时。</li>
	<li>创建用于数据处理的板图。
	<ol>
		<li>点击属性选项卡，选择板图，在化合物选项卡中输入细胞类型和处理条件。</li>
		<li>点击区域选项卡，选择每组重复样本，并将其保存为区域。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 设置分析参数
<ol>
	<li>实验运行完成后，在软件中创建一个图像集，以训练计算机量化计数集中包含的每个参数。
	<ol>
		<li>在软件中打开平板视图，然后在分析任务工具框中选择创建或添加到图像集合。</li>
		<li>选择新建图像集合，输入图像集合的名称，并通过勾选通道旁的复选框选择红色和相位通道。</li>
		<li>再选择5张图像，并将其添加到当前图像集合中以扩充图像集合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为细胞创建处理定义。表1列出了本LDL流入实验方案中HepG2、HK2和HCAE细胞处理定义的参数。
	<ol>
		<li>在分析任务工具框中，选择新建处理定义。从下拉菜单中选择步骤2.1.2中命名的图像集合。根据表1输入相应细胞类型的参数。</li>
		<li>在预览框中，使用下拉菜单选择预览全部。</li>
		<li>在分析掩膜框中，勾选汇合度掩膜和红色对象掩膜，以查看处理定义分析所包含的区域。参见图1。</li>
		<li>滚动浏览图像集合，确保细胞和LDL均被包含在掩膜内。选择文件并保存该处理定义。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析实验运行所得的一组图像。
	<ol>
		<li>在平板视图中打开实验。在分析任务工具框中，选择启动新分析任务。选择已保存的处理定义。</li>
		<li>为分析任务命名，选择分析的时间范围，并高亮标记需要分析的实验孔。点击启动按钮。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 分析与数据处理
<ol>
	<li>分析任务完成后，导出数据：
	<ol>
		<li>选择已完成的分析，点击 查看。在 工具 菜单中，选择 指标/图表导出。</li>
		<li>在 区域 菜单中选择 所有孔；在 分组 菜单中，若要获得每组孔的平均值，请选择 重复孔，若要导出每个孔的单独数值，请选择 无。</li>
		<li>在 红色对象指标 菜单中，选择 红色对象总整合强度（RCU × µm2/图像）。该参数表示每个孔中所有图像的红色信号强度总和（以 RCU 为单位）乘以红色信号面积（以 µm2 为单位），对应于细胞对 LDL 的总摄取量。</li>
		<li>点击 数据导出 按钮，并勾选 将数据分解为单个图像。数据将自动复制到剪贴板，可粘贴至新的电子表格文件中。</li>
		<li>在 相位对象指标 菜单中，选择 融合度（百分比），并勾选 将数据分解为单个图像，然后点击 数据导出 按钮。导出的数据可复制到包含“红色对象总整合强度”数据的同一电子表格文件中。</li>
		<li>使用以下公式将百分比融合度转换为总面积： 
		 
		总相位面积（µm2/图像） = 融合度（%） × （图像高度（像素） × 分辨率） × （图像宽度（像素） × 分辨率） 
		 
		注：融合度（%）参数表示每幅图像中相位面积所占的百分比，对应于每个孔中细胞所占的面积。导出后，应将该指标转换为每幅图像的总相位面积。各实验容器所用的相位通道图像参数（图像高度、宽度和分辨率）可通过查看 图像通道 下的 容器属性 获取。</li>
		<li>使用以下公式，将每幅图像的“红色对象总整合强度”归一化为 4.1.6 步骤中计算得到的“总相位面积”，以消除各孔间细胞密度的差异：
		<ol>
			<li>将每幅图像的 红色对象总整合强度（RCU × µm2/图像） 除以其对应的 总相位面积（µm2/图像），得到每幅图像的 LDL 摄取量（RCU） 值。</li>
			<li>然后，计算每个孔所有图像的 LDL 摄取量（RCU） 的平均值，得到该孔的平均 LDL 摄取量；再计算各重复孔 LDL 摄取量的平均值，得到组均值。这些数据即为最终的 LDL 摄取量，可用于作图及使用选定软件进行统计分析。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在本实验方案中，我们展示了活细胞成像技术作为一种新颖且更有效的方法，用于实时动态监测多种人源细胞系对低密度脂蛋白（LDL）的摄取。人肝癌（HepG2）细胞在筛选降胆固醇治疗药物的研究中被广泛使用21,22,23,24,25,26,39,40。因此，我们选择该细胞类型来验证活细胞成像系统在LDL流入研究中的应用能力。结果显示，HepG2细胞适用于这一新技术，其摄取动力学呈现类似S形的曲线，表明在整个流入实验期间LDL持续被摄取，直至以4.33小时作为最终检测时间点（图&#160;2A 和 图3）。
胆固醇稳态在多种肾病的病理生理过程中起着重要作用。事实上，胆固醇在肾组织中的蓄积是导致慢性肾病的重要因素，也是多种肾病的主要病理特征28,29,30,31。因此，我们采用人肾小管上皮细胞（HK2细胞）作为肾病研究领域常用且可靠的细胞模型，验证了本方法的应用效果。我们的数据也支持利用活细胞成像系统检测HK2细胞中低密度脂蛋白（LDL）内流的可行性。如图2B所示，在整个内流实验期间（4小时），HK2细胞对LDL胆固醇的摄取呈线性增加趋势。
由于胆固醇代谢在动脉粥样硬化（心血管疾病的主要病因，而心血管疾病是全球首要死因42）的发生和发展过程中具有重要作用32,33,41，我们旨在在与动脉粥样硬化相关的细胞类型中验证本方法。我们采用了人冠状动脉内皮细胞（HCAECs），因为这类细胞是动脉粥样硬化患者冠状动脉管腔中最早暴露于胆固醇损伤的细胞类型之一。我们在图2C中展示的数据表明，该低密度脂蛋白（LDL）流入方法在HCAECs中同样有效。所得曲线呈类似S形，与HepG2细胞的结果相似。
为了验证这种改进的低密度脂蛋白（LDL）流入检测法在筛选影响LDL-胆固醇摄取的化合物时的有效性和灵敏度，我们使用了三种对照：降低LDL摄取的试剂Dynasore和rPCSK9，以及促进LDL流入的激活剂辛伐他汀（Simvastatin）。在此，我们在进行流入检测前，用优化浓度的Dynasore或rPCSK9处理上述细胞系（HepG2、HK2和HCAECs）。结果显示，在4小时的时间过程中，所有三种测试细胞系对处理均表现出显著的LDL流入减少（图2）。例如，在4.33小时这一最终时间点，用40 µM Dynasore处理可使HepG2细胞、HK2细胞和HCAECs中的LDL流入分别显著降低53%、68%和54%（p&#60;0.0001；图2A-C 和 表2A-C）。此外，10 µg/mL的rPCSK9可使HK2细胞中的LDL流入显著减少55%（p&#60;0.0001；图2B 和 表2B）。此外，我们的研究发现，用辛伐他汀处理HepG2细胞可显著增加LDL摄取（图3），这进一步支持了该方法在检测LDL流入显著变化方面的灵敏性。本方案中未包含rPCSK9在HepG2和HCAEC细胞中的处理研究，因为rPCSK9作为已有充分文献记录的附加对照处理，其小剂量采购成本较高。因此，rPCSK9仅用于在HK2细胞中验证本方案的可行性。
活细胞成像分析结合对低密度脂蛋白（LDL）内流的功能性和实时测量，可对细胞的健康状态和形态进行持续监测。该优势能够高效检测所用化合物潜在的细胞毒性，使该方法成为同时监测药理活性与细胞毒性的理想技术。图5-7展示了三种测试细胞系在实验终点（4.33小时）的代表性图像，用以直观反映不同处理对净LDL内流的影响，同时也显示了经处理后细胞仍保持良好的形态。我们建议对每个孔的所有图像进行目视检查，以确保在整个研究过程中细胞形态健康。例如，在未展示的数据中，当观察经80 μM Dynasore处理的HepG2细胞图像时，我们发现细胞出现脱离迹象，表现为细胞边缘从培养板上翘起，提示在较高浓度Dynasore下发生细胞脱离。此外，辛伐他汀的高浓度（3–10 μM）也会导致细胞形态改变，提示诱导了细胞凋亡，这与已有文献报道的高剂量他汀类药物效应一致45。本实验方案用于对Dynasore（20–80 μM）和辛伐他汀（0.5–10 μM）进行浓度梯度处理，随后通过细胞图像分析评估细胞健康状况，并确定不同浓度处理下的潜在细胞毒性。结果表明，40 μM Dynasore和1 μM辛伐他汀为最佳使用浓度。
最后，如果使用本方法测试其他细胞系，我们建议进行细胞密度滴定实验，以确定每孔的最佳细胞数量，从而获得一致的结果。我们的细胞密度优化实验表明，在24孔板中每孔接种10,000个细胞可使HK2和HCAE细胞的LDL流入结果保持一致。需要注意的是，对于使用活细胞成像系统的该LDL流入实验，理想情况是在孔中形成均匀分布的非融合单层细胞，因为细胞团块可能导致最终归一化的LDL流入值出现误差。其原因是，在对流入数据进行归一化时，相位对象面积被用作细胞密度的衡量指标，而当形成细胞团块时，这一参数可能受到不利影响。我们观察到，HepG2细胞在接种密度超过每孔5,000个细胞时容易形成团块，导致流入结果不一致；因此，我们选用在24孔板中每孔5,000个细胞作为HepG2细胞的最佳密度。
综上所述，我们的方法提供了一个中高通量的平台，可用于同时筛选调控低密度脂蛋白（LDL）内流的化合物的药理活性和细胞毒性。该方法可轻松适用于其他进入溶酶体区室的荧光标记配体，以实时评估配体的摄取情况。尽管本方案提供了InCucyte活细胞成像与分析系统的具体操作参数，但该方案也可根据需要调整用于其他成像系统，例如Cellomics。

低密度脂蛋白受体（LDLR）介导的低密度脂蛋白（LDL）内吞作用是一个重要的研究领域，因为循环中的LDL胆固醇水平是心血管疾病1、肾脏疾病2以及多种炎症性疾病3和胆固醇转运基因突变所致遗传性疾病4,5,6,7的核心因素。关于LDLR介导胆固醇内流的研究已促成了多种研究工具的发现，例如动力蛋白（Dynamin）抑制剂——化学物质Dynasore8,9,10，以及调控LDL的蛋白质，如前蛋白转化酶枯草溶菌素/Kexin 9型（PCSK9）11,12。
低密度脂蛋白-低密度脂蛋白受体（LDL-LDLR）内吞途径始于细胞表面的LDL-LDLR复合物被募集到网格蛋白包被的小窝中13。随后，细胞膜内陷形成囊泡，将LDL-LDLR复合物包裹于囊泡内，转运至细胞内部。随着囊泡逐渐成熟为早期内体，进而发育为晚期内体，晚期内体内部pH值下降，导致LDL与其受体解离14。过去，定量检测LDL摄入的方法依赖于将放射性标记的125I-LDL与细胞共孵育，随后从细胞中提取放射性标记蛋白进行定量分析15。此后，该方法被荧光标记的LDL蛋白（如DiI-LDL）所取代，通过后续的免疫染色或蛋白提取，利用分光光度计或酶标仪检测荧光信号进行定量15,16。荧光标记的LDL还被用于荧光激活细胞分选（FACS），以分析LDL的内化过程及细胞表面LDL的结合情况17。尽管这些方法可在处理后收集数据，但在处理过程中无法实时监测细胞的活力。
晚期内体的酸性pH环境使得可以使用pH激活的荧光LDL探针（如pHrodo Red LDL），该探针在被细胞内化后产生荧光18,19。这一特性使得能够在活细胞中连续监测LDL摄取过程的时间进程。因此，本实验方案采用活细胞分析中的pHrodo Red-LDL荧光成像技术，对LDL摄取进行连续测定，同时同步监测细胞健康状态。实验结果表明，该新型技术在三种不同的人源细胞系——人肝癌（HepG2）细胞、人肾小管上皮（HK2）细胞和人冠状动脉内皮细胞（HCAEC）中，经过四小时时间序列检测，均表现出良好的可靠性。这些细胞系在LDL清除20,21,22,23,24,25,26,27、肾脏疾病28,29,30,31以及心脏病32,33方面具有重要的临床意义。除了监测LDL的流入外，本方案还包括使用两种已知的LDL摄取抑制剂——Dynasore Hydrate和重组PCSK9蛋白，以及一种可诱导LDLR表达并促进LDL摄取的他汀类药物辛伐他汀（simvastatin）进行干预处理。Dynasore和重组PCSK9分别通过不同的信号通路抑制LDL的摄取。
Dynasore 是一种动力蛋白（Dynamins）的小分子抑制剂10，可通过阻断网格蛋白依赖性内吞作用介导的 LDL-LDLR 复合物内化，从而减少细胞对 LDL 的摄取10,34。另一方面，重组 PCSK9 属于 S8 家族肽酶，可与 LDLR 结合并抑制其在内吞复合物释放 LDL 后向细胞膜表面再循环的过程，其机制是通过阻断所需的构象变化35,36。细胞表面 LDLR 密度的降低最终导致细胞对 LDL 的摄取减少。他汀类药物（Statins）虽主要通过直接抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶活性，从而抑制胆固醇的生物合成，但也被证实可上调 LDLR 的表达25,38，进而增强细胞对 LDL 的摄取。本实验方案的灵敏度已通过三种临床相关的人源细胞系（HK2、HepG2 和 HCAECs）得到验证：Dynasore 和/或重组 PCSK9 可显著降低 LDL 的流入，而辛伐他汀（Simvastatin）可在4小时的时间过程中显著增加 HepG2 细胞对 LDL 的摄取，同时对细胞形态和健康状态进行监测。综上所述，该方法提供了一个中高通量的平台，可用于在活细胞中同步筛选调控 LDL 摄取的化合物的药理活性及其细胞毒性。

<table><tbody><tr><td>pHrodo Red-LDL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34356</td><td></td></tr><tr><td>HepG2 细胞</td><td>E. Thomas 实验室，迈阿密大学</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Sigma</td><td>M0325</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM 溶液</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>HK2 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2190</td><td></td></tr><tr><td>角质形成细胞无血清培养基试剂盒</td><td>Gibco</td><td>17005-042</td><td></td></tr><tr><td>原代冠状动脉内皮细胞</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-020</td><td></td></tr><tr><td>血管细胞基础培养基</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-030</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长试剂盒-VEGF</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-041</td><td></td></tr><tr><td>人脂蛋白缺乏血清</td><td>Millipore</td><td>LP4</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.05%)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-150</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶中和液</td><td>ATCC</td><td>PCS-999-004</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Falcon</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;M 网格细胞筛</td><td>VWR</td><td>10199-654</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染色液 (0.4%)</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数板</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte Zoom</td><td>Sartorius</td><td>Zoom</td><td>成像与分析平台</td></tr><tr><td>Dynasore 水合物</td><td>Sigma</td><td>D7693</td><td></td></tr><tr><td>PCSK9 重组蛋白</td><td>Cayman Chemicals</td><td>20631</td><td></td></tr></tbody></table>

使用活细胞成像分析结合细胞健康监测的低密度脂蛋白胆固醇摄取检测

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

通过低密度脂蛋白受体（LDLR）介导的内吞作用调控低密度脂蛋白（LDL）胆固醇的摄取，是代谢紊乱、心血管疾病和肾脏疾病等多种重大病理学领域的重要研究方向。目前尚无可用的方法在评估LDL摄取的同时，实时监测细胞的健康状态。本研究提出了一种利用活细胞成像分析系统进行连续测量LDL流入并同步监测细胞健康状况的实验方案。该新技术在三种人类细胞系（肝细胞、肾小管上皮细胞和冠状动脉内皮细胞）中进行了为期四小时的时间过程测试。此外，通过已知的LDL摄取抑制剂Dynasore和重组PCSK9蛋白，以及LDL摄取促进剂辛伐他汀，验证了该技术的敏感性。综上所述，该方法提供了一个中高通量的平台，可同时筛选调节LDL流入的化合物的药理活性，并监测细胞形态变化，从而评估其细胞毒性。该分析方法可与不同的成像系统和分析软件兼容使用。

活细胞成像可实现对三种人源细胞系胆固醇流入研究过程中细胞健康的可靠监测 
我们在三种胆固醇稳态调节具有重要病理生理学作用的人源细胞系中验证了本检测方法，包括人肝癌（HepG2）细胞、人肾上皮（HK2）细胞以及人冠状动脉内皮细胞（HCAECs）。我们采用活细胞成像系统对低密度脂蛋白（LDL）摄取实验进行为期4小时的时间过程检测，每1小时进行一次连续测量。结果显示，所有测试的细胞类型均适用于该新技术，在整个流入研究期间均呈现持续性LDL摄取趋势，最终时间点为4.33小时（图2）。图2所示的流入数据通过对每张图像中pHrodo Red标记的LDL总荧光强度（每幅图像中红色物体的总积分荧光强度，单位为RCU × µm²/图像）与每孔图像中的总细胞面积（每幅图像中相位物体面积，单位为µm2/图像）进行归一化处理获得，以消除不同孔之间细胞密度差异带来的影响。此外，为验证该LDL流入检测方法在筛选影响LDL胆固醇摄取化合物方面的敏感性，我们使用了两种已知可抑制LDL流入的阳性对照物——Dynasore和重组PCSK9（rPCSK9），以及一种已知可促进LDL摄取的阳性对照物——辛伐他汀（Simvastatin）。实验结果证实，在Dynasore和rPCSK9处理后，三种测试的人源细胞系（HepG2、HK2和HCAEC）在4小时时间过程中均表现出LDL流入显著降低（图2A-C）。例如，图2A显示，与DMSO处理组相比，Dynasore处理导致HepG2细胞的LDL流入随时间显著减少；而作为Dynasore溶剂对照的DMSO组与未处理对照组相比，对LDL流入无显著影响。此外，我们的研究结果还显示，HepG2细胞在辛伐他汀处理后LDL摄取明显增加（图3），进一步支持该方法能够灵敏地检测LDL流入的显著变化。在约4.5小时这一LDL摄取研究中典型的时间点，Dynasore或rPCSK9处理均显著降低LDL流入，而辛伐他汀处理则显著提高LDL流入（图4）。
利用活细胞成像技术研究低密度脂蛋白（LDL）摄取的主要优势在于，该系统可提供每个孔中细胞的实时图像，可用于监测受试化合物可能产生的细胞毒性。图5-7展示了三种细胞系在初始时间点（0.33 h）和最终终点（4.33 h）的代表性图像，作为净LDL内流的视觉参考。这些图像证实了经Dynasore或rPCSK9处理后细胞形态正常，表明这两种化合物具有有效性和安全性。
活细胞分析可对不同处理条件下的胆固醇流入进行可靠的连续定量测量
使用该方案结合活细胞成像系统的一个主要优势在于，能够在整个时间过程中持续收集数据，并在多个时间点比较低密度脂蛋白（LDL）的内流情况，而不仅仅是像传统方法那样仅在最终时间点进行比较。通过该方案，我们不仅可以在实验终点时间点计算LDL内流的降低百分比，还可以在时间过程中的每1小时时间点进行计算。表2总结了在经40 µM Dynasore预处理10分钟或10 µg/mL rPCSK9预处理1小时后，三种测试的人类细胞系中LDL内流的减少情况。在以4.33小时作为最终研究终点时，40 µM Dynasore处理使HepG2细胞、HK2细胞和HCAECs细胞中的LDL内流分别显著降低了53%、68%和54%（表2A-C）；而10 µg/mL rPCSK9处理使HK2细胞中的LDL内流减少了55%（表2B）。除了像传统检测方法一样对终点时间点进行定量分析外，我们还能够在实验的每个时间点对处理引起的LDL内流减少进行定量分析。例如，表2B显示，在rPCSK9处理后的1.33小时、2.33小时和3.33小时，HK2细胞的LDL摄取量相比未处理细胞分别减少了79%、67%和59%。该方案为处理后LDL内流的定量分析提供了一种可靠的方法。
<img alt="显微镜中的细胞分割方法；图像分析显示未遮罩、相位和红色物体叠加图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：处理定义掩码。 展示了应用适当处理定义（详见表 1）后的HK2细胞代表性图像。图像分别为未进行遮罩的HK2细胞（A），应用相位遮罩后的图像（B），应用红色物体遮罩后的图像（C），以及同时应用相位和红色物体遮罩后的图像（D）。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="肝细胞、肾细胞、冠状动脉细胞的低密度脂蛋白摄取图；显示时间依赖性脂质吸收结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：使用活细胞成像系统在4.33小时时间过程中观察到的低密度脂蛋白（LDL）摄取减少。 使用活细胞分析系统检测人肝癌（HEPG2）细胞（A）、人肾小管上皮（HK2）细胞（B）和人冠状动脉内皮（HCAE）细胞（C）中的LDL内流。实验中使用Dynasore（运行前10分钟处理）或rPCSK9（运行前1小时处理）作为阳性对照，Dynasore的溶剂对照使用DMSO。阳性对照在所有三种细胞系中均显著降低了LDL内流量。LDL内流值通过将红色物体的总积分强度（RCU×µm2/图像）归一化至相位物体总面积（µm2/图像）获得。数据以均值±标准误表示，每组n = 6个孔，结果代表2至3次独立实验。****p &lt; 0.0001 与空白组比较，####p &lt; 0.0001 与DMSO组比较，采用双因素方差分析（two-way ANOVA）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="肝癌细胞中LDL摄取图示；DMSO与辛伐他汀作用效果；时间依赖性分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3。使用活细胞成像系统检测LDL摄取随4.33小时时间进程的增加情况。 采用活细胞分析系统测定人肝癌（HEPG2）细胞中LDL的内流。在含2% FBS的培养基中，经辛伐他汀处理12小时（A）、18小时（B）或24小时（C）后，LDL摄取显著增加。24小时时间点还使用了含5% LPDS（不含FBS）的培养基进行实验。DMSO作为阴性对照。LDL内流量通过将红色物体总积分强度（RCU × µm2/图像）归一化至相位物体总面积（µm2/图像）获得。数据以均值±标准误表示。每组n = 6个孔。数据代表一次独立实验的结果。****p &lt; 0.0001，与DMSO组相比，采用Student t检验。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="不同人类细胞类型中LDL摄取的比较；柱状图显示Dynasore作用的统计结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4。LDL摄取抑制剂在4.3小时时间点显著降低LDL内流。 在人肝癌（HepG2）细胞（A）、人肾小管上皮（HK2）细胞（B）和人冠状动脉内皮（HCAE）细胞（C）中，经LDL摄取抑制剂Dynasore处理10分钟或rPCSK9处理1小时后，LDL内流显著降低。辛伐他汀处理HepG2细胞12、18或24小时后，LDL内流明显增加（D）。数据以均值±标准误表示，n = 每组6个孔，数据代表2至3次独立实验。****p &lt; 0.0001，采用双因素方差分析（two-way ANOVA）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="人肝癌细胞观察、延时显微成像、治疗比较、实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5．Dynasore 降低肝细胞癌（HepG2）细胞中低密度脂蛋白（LDL）的内流。 显示 HepG2 细胞在 0.33 小时（左图）和 4.33 小时终点（右图）的相差图像与红色荧光图像，表明细胞处于健康状态。使用已知可减少 LDL-胆固醇摄取的 40 µM Dynasore 作为阳性对照（C）。图像以 10 倍放大倍数拍摄。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="人肾小管上皮细胞；随时间比较不同处理的显微镜实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6。Dynasore 和 rPCSK9 降低人肾小管上皮（HK2）细胞中低密度脂蛋白（LDL）的内流。 HK2细胞在0.33小时（左图）和4.33小时终点（右图）的相差图像与红色荧光图像代表性显示，表明细胞处于健康状态。使用已知可减少LDL胆固醇摄取的40 µM Dynasore（C）或10 µg/mL rPCSK9（D）作为阳性对照。图像以10倍放大倍数拍摄。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="人冠状动脉内皮细胞在0.33小时和4.33小时的显微图像；实验分析显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58564/58564fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7．Dynasore降低人冠状动脉内皮细胞（HCAECs）低密度脂蛋白（LDL）流入量。 显示HCAECs在0.33小时（左图）和4.33小时终点（右图）的相差图像与红色荧光图像，表明细胞处于健康状态。使用已知可减少LDL-胆固醇摄取的40 µM Dynasore作为阳性对照（C）。图像以10倍放大倍数拍摄。比例尺 = 100 µm。数据以均值±标准误表示。每组N = 6个孔。数据代表2至3次独立实验的结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58564/58564fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="HepG2、HK2、HCAEC 细胞图像分析参数表；包含分割、荧光强度、面积等细节。" src="/files/ftp_upload/58564/58564table1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="表 1"> 
表 1：处理定义参数。这些参数针对本实验方案所使用的分析系统而设定。参数设置应针对红光通道中的红色区域以及相差通道中的细胞区域进行分析。文中列出了 HepG2、HK2 和 HCAEC 细胞系的参数设置。
<img alt="细胞处理比较，HepG2、HK2、HCAEC 数据，药物反应结果表格。" src="/files/ftp_upload/58564/58564table2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Table 2"> 
表 2：使用 Dynasore、rPCSK9 或辛伐他汀处理 4.3 小时后，HepG2、HK2 和 HCAE 细胞中 LDL 摄取量的百分比变化。（A）HepG2 细胞，（B）HK2 细胞，（C）HCAE 细胞，以及（D）HepG2 细胞。

本方案提供了一种高效的方法，利用活细胞成像系统在多种细胞类型中实时测量低密度脂蛋白（LDL）胆固醇的摄取速率。该技术为筛选影响LDL内流的化合物的药理活性提供了平台，同时可监测细胞形态，从而评估潜在的细胞毒性。

通过低密度脂蛋白受体介导的内吞作用对低密度脂蛋白胆固醇摄取的调控，是多种重大疾病（包括代谢性疾病）研究中的重要领域……

我们介绍一种用于活细胞成像分析低密度脂蛋白（LDL）胆固醇进入多种人类细胞类型的实验方法。该方法可用于筛选能够调节LDL胆固醇转运的化合物。采用活细胞成像技术定量LDL摄入的主要优势在于，可在整个实验过程中持续监测细胞形态，从而有可能识别出具有细胞毒性的化合物。首先，吸除先前准备好的细胞中的培养基，并用 5 毫升杜氏磷酸盐缓冲液洗涤细胞。吸除 DPBS。接下来，为了使细胞从 100 毫米培养皿上脱落，向 HepG2 细胞中加入 1.5 毫升 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，向 HK2 细胞或 HCAECs 细胞中加入 1.5 毫升 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液。将培养板在37摄氏度下孵育4分钟。然后加入3毫升完全培养基以中和HepG2和HCAEC细胞中的胰蛋白酶。对于HK2细胞，使用3毫升胰蛋白酶中和溶液，该溶液用含5%胎牛血清（FBS）的DPDS配制。将细胞转移至15毫升锥形管中，然后以250g离心5分钟。离心后吸除上清液，并用完全培养基重悬细胞沉淀。用40微米细胞筛轻轻过滤细胞悬液，以分散细胞团块。计数细胞，并以优化的密度将细胞接种于24孔板中。于37摄氏度培养过夜，使细胞贴壁。次日，将细胞培养基更换为不含FBS的该细胞系基础培养基，或含5%脂蛋白缺陷血清，或含2% FBS的培养基。在24孔板中，每孔加入500微升完全培养基。随后继续孵育24小时以饥饿细胞。在饥饿步骤期间或次日，可根据需要对细胞加入目标化合物及相应的对照处理。饥饿处理24小时后，向每孔含500微升培养基的孔中加入5微升pHrodo Red标记的LDL，使终浓度达到每毫升10微克。小心去除孔中的任何气泡。加入标记的LDL后，立即将培养板放入活细胞分析系统的培养箱中，并使培养板平衡15分钟，以减少培养板内的冷凝现象。在细胞孵育的同时，打开软件并通过添加承载培养板的容器来安排扫描。每孔拍摄16张图像，在红色和相差通道下以10倍放大倍数每隔一小时拍摄一次，共持续四小时。然后创建用于数据处理的孔板图，选择属性选项卡并选定该孔板图。在“细胞”选项卡中输入细胞类型，在“化合物”选项卡中输入处理条件。然后点击“区域”选项卡，选择每组重复实验，并分配相应区域。当一次实验运行完成后，在软件中创建一个图像集，以训练计算机对计数集合中包含的每个参数进行量化。在软件中，打开微孔板视图，然后在分析任务工具框中选择“创建图像集”或“添加至图像集”。选择新建图像集，输入图像集的名称，并通过勾选通道旁的复选框选择红色和相差通道。再从不同的孔和时间点选择另外五幅图像，通过添加到当前图像集的方式将其加入该图像集中。在分析任务工具框中，选择新建处理定义，从下拉菜单中选择图像集，输入与细胞类型相关的参数。在预览框中，使用下拉菜单选择预览全部。在分析掩模框中，勾选汇合度掩模和红色对象掩模，以查看处理定义中分析所包含的区域。滚动浏览图像集合，确保细胞和低密度脂蛋白（LDL）包含在掩模内。选择文件并保存处理定义。接下来，打开实验板视图，以分析实验运行中的一组图像。在分析任务工具框中，选择启动新的分析任务，并选中已保存的处理定义。为分析任务命名，选择分析的时间范围，并高亮标记需要分析的实验孔。点击启动按钮。分析任务完成后，导出数据，选择已完成的分析并点击查看。在工具菜单中，选择指标图导出。在区域菜单中，选择所有孔；在分组菜单中，为获得每组孔的平均值，选择重复孔。若要导出每个孔的单个数值，请选择“无”。在红色对象度量菜单中，选择红色对象总积分强度。然后点击数据导出按钮。将断裂数据拆分为单独的图像。数据会自动复制到剪贴板，可粘贴至新的电子表格文件中。在相位物体测量菜单中，选择融合度，然后点击数据导出按钮。在提示选项卡中，勾选“将数据拆分为单个图像”。数据将自动复制到剪贴板，可粘贴至包含红色物体总整合强度数据的电子表格文件中。随后可根据方案中的步骤 4.1.7 和 4.1.8 对导出的数据进行归一化处理，以获得最终的 LDL 摄取值。经Dynasore或重组PCSK9处理后，三种经测试的人源细胞系在4小时的时间过程中均表现出LDL内流显著减少。与以DMSO作为对照处理的细胞相比，人肝癌细胞（HepG2细胞）在Dynasore处理后，随时间进程LDL内流减少。在不同时间点对HepG2细胞中LDL内流进行活细胞成像，结果显示经辛伐他汀处理后LDL摄取明显增加，表明该方法能够灵敏地检测LDL内流的显著变化。在初始时间点和最终时间点进行的实时成像结果证实，经 Dynasore 处理后细胞形态正常，表明该化合物具有有效性和安全性。在向细胞中加入额外的红色标记 LDL 以保持其荧光活性后，必须注意将培养板避光保护，直至将其放入活细胞成像系统的培养箱中。来自不同器官的细胞对处理的反应可能不同，表现为相反的方向，或者虽然反应方向相同，但在胆固醇摄取的变化速率上存在差异。只有通过活细胞成像，才能检测并准确定量这些差异。

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使用活细胞成像分析结合细胞健康监测的低密度脂蛋白胆固醇摄取检测

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