使用活细胞成像分析结合细胞健康监测的低密度脂蛋白胆固醇摄取检测
2018年11月17日
本方案提供了一种高效的方法，利用活细胞成像系统在多种细胞类型中实时测量低密度脂蛋白（LDL）胆固醇的摄取速率。该技术为筛选影响LDL内流的化合物的药理活性提供了平台，同时可监测细胞形态，从而评估潜在的细胞毒性。
我们介绍了一种用于活细胞成像分析低密度脂蛋白（LDL）胆固醇摄取进入多种人类细胞类型的方法。该方法可用于筛选能够调节LDL胆固醇转运的化合物。利用活细胞成像对LDL流入进行定量的主要优势在于，可在整个实验过程中持续监测细胞形态，从而有可能检测出具有潜在毒性的化合物。
首先，吸除先前准备好的细胞中的培养基，并用 5 毫升杜氏磷酸盐缓冲液洗涤细胞。吸除 DPBS。接下来，为了从 100 毫米培养皿中消化细胞，向 HepG2 细胞中加入 1.5 毫升 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，向 HK2 细胞或 HCAECs 细胞中加入 1.5 毫升 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液。
将培养板在37摄氏度下孵育4分钟。然后加入3毫升完全培养基以中和HepG2和HCAEC细胞中的胰蛋白酶。对于HK2细胞，使用3毫升胰蛋白酶中和溶液，该溶液用含5%胎牛血清（FBS）的DPDS配制。
将细胞转移至15毫升锥形管中，然后以250g离心5分钟。离心后，吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于完全培养基中。用40微米细胞滤网轻轻过滤细胞悬液，以分散细胞团块。
计数细胞，并以优化的密度将细胞接种于24孔板中。于37摄氏度培养过夜，使细胞贴壁。次日，将细胞培养基更换为不含FBS的基础培养基，或含5%脂蛋白缺陷型血清，或含2% FBS的培养基。
在24孔板中，每孔使用500微升总培养基。随后继续孵育24小时以使细胞饥饿。在饥饿步骤期间或次日，可对细胞施加所需的化合物及相应的对照处理。
饥饿处理24小时后，向每孔含500微升培养基的孔中加入5微升pHrodo Red标记的LDL，使终浓度达到每毫升10微克。小心去除孔中的任何气泡。加入标记的LDL后，立即将培养板放入活细胞分析系统的培养箱中，并使培养板平衡15分钟，以减少培养板内的冷凝现象。
在细胞孵育的同时，打开软件并通过添加承载培养板的容器来安排扫描。每个孔拍摄16张图像，在红色和相差通道下以10倍放大倍数每小时拍摄一次，共拍摄四小时。然后创建用于数据处理的板图，选择属性选项卡并选定该板图。
在“细胞”选项卡中输入细胞类型，在“化合物”选项卡中输入处理条件。然后点击“区域”选项卡，选择每组重复实验，并分配区域。当一次实验运行完成后，在软件中创建一个图像集，以训练计算机对计数集合中包含的每个参数进行量化。
在软件中，打开微孔板视图，然后在分析任务工具框中选择“创建图像集”或“添加至图像集”。选择新建图像集，输入图像集的名称，并通过勾选通道旁的复选框选择红色通道和相差通道。再从不同的孔和时间点选择另外五幅图像，并通过添加到当前图像集的方式将其加入该图像集中。
在分析任务工具框中，选择新建处理定义，从下拉菜单中选择图像集，输入与细胞类型对应的参数。在预览框中，使用下拉菜单选择预览全部。在分析掩模框中，勾选汇合度掩模和红色对象掩模复选框，以查看处理定义中分析所包含的区域。
滚动浏览图像集合，确保细胞和低密度脂蛋白（LDL）均包含在掩膜范围内。选择文件并保存处理定义。接下来，打开实验板视图，以分析实验运行中的一组图像。
在分析任务工具框中，选择启动新的分析任务，并选中已保存的处理定义。为分析任务命名，选择分析的时间范围，并高亮标记需要分析的实验孔。点击启动按钮。
分析任务完成后，导出数据，选择已完成的分析并点击查看。在工具菜单中，选择“指标图导出”；在区域菜单中，选择所有孔；在分组菜单中，为获得每组孔的平均值，选择“重复孔”。
若要导出每个孔的单个数值，请选择“无”。在红色物体度量菜单中，选择红色物体总整合强度。然后点击数据导出按钮。
将断裂数据拆分为单独的图像。数据会自动复制到剪贴板，可粘贴至新的电子表格文件中。在相位对象参数菜单中，选择融合度，然后点击数据导出按钮。
在提示选项卡中，勾选“将数据拆分为单个图像”。数据将自动复制到剪贴板，可粘贴至包含红色物体总整合强度数据的电子表格文件中。随后可根据方案中的步骤 4.1.7 和 4.1.8 对导出的数据进行归一化处理，以获得最终的 LDL 摄取值。
经Dynasore或重组PCSK9处理后，三种经测试的人源细胞系在4小时的时间过程中均表现出LDL内流显著减少。与以DMSO作为对照处理的细胞相比，人肝癌细胞（HepG2细胞）在Dynasore处理后，随时间进程LDL内流减少。在不同时间点对HepG2细胞中LDL内流进行活细胞成像，结果显示经辛伐他汀处理后LDL摄取明显增加，表明该方法能够灵敏地检测LDL内流的显著变化。
在初始时间点和最终时间点进行的实时成像证实，经过 Dynasore 处理后细胞形态正常，表明该化合物具有有效性和安全性。在向细胞中添加额外的红色标记 LDL 以保持其荧光活性后，必须注意将培养板避光保护，直至放入活细胞成像系统的培养箱中。来自不同器官的细胞对处理的反应可能不同，表现为相反的方向；或者反应方向相同，但在胆固醇摄取的变化速率上存在差异。
只有通过活细胞成像才能检测到这些差异并进行准确定量。
概述
本研究介绍了一种在多种人类细胞类型中对低密度脂蛋白（LDL）胆固醇摄取进行活细胞成像的方法。该技术能够筛选影响LDL转运的化合物，同时可监测细胞形态，以检测潜在的细胞毒性。
关键研究组成部分
研究领域
- 细胞生物学
- 胆固醇代谢
- 药物筛选
背景
- LDL胆固醇在细胞过程中的作用
- 实验过程中监测细胞健康的重要性
- 活细胞成像在生物研究中的应用
使用的方法
- 活细胞成像系统
- 人源细胞系，包括 HepG2、HK2 和 HCAECs
- 低密度脂蛋白（LDL）内流的定量分析
主要结果
- 使用Dynasore处理后，观察到LDL流入显著减少
- 辛伐他汀处理后，HepG2细胞对LDL的摄取增加
- 尽管进行了化合物处理，但仍确认细胞形态正常
结论
- 该方法可有效测定低密度脂蛋白（LDL）的摄取并监测细胞毒性
- 有助于进一步研究胆固醇代谢及药物开发
常见问题
行业重要性概述
该方法可同时定量低密度脂蛋白（LDL）胆固醇的流入以及实时监测细胞健康状态，填补了代谢和心血管靶点药物筛选中的关键空白。通过将细胞毒性检测与功能性摄取实验相结合，该方法提高了先导化合物筛选的预测可靠性，并减少了因脱靶毒性导致的后期研发失败。该平台支持在相关的人源细胞类型中进行中高通量筛选，从而增强靶点验证流程中的转化相关性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可将低密度脂蛋白受体（LDLR）介导的内吞作用作为代谢性疾病、心血管疾病和肾脏疾病的治疗靶点进行深入研究。
- 操作价值：可同时评估化合物对低密度脂蛋白（LDL）摄取和细胞形态的影响，有助于早期发现潜在的细胞毒性风险。
- 预测价值：通过将药物对LDL内流的调控作用与细胞健康结局相关联，支持从机制层面降低研发风险。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：利用pHrodo红标记的LDL和活细胞成像，提供对LDL流入的定量、时间分辨测量。
- 操作价值：适用于标准的24孔板格式，并可适配多种成像系统，有助于实验的标准化和可重复性。
- 可扩展性：支持在四小时时间范围内以每小时为间隔进行连续测量，可实现对化合物效应的动力学分析。
转化与临床前研究
- 转化连续性：在三种人类细胞系（肝细胞、肾小管上皮细胞、冠状动脉内皮细胞）中进行测试，反映了与疾病相关的跨组织反应分析系统。
- 机制洞察力：可检测化合物（如Dynasore、PCSK9和辛伐他汀）引起的差异性反应，支持通路特异性的靶点验证。
- 基于风险调整的决策支持：可通过将LDL摄取数据归一化至细胞汇合度，提高结构-活性关系判断的数据准确性和可信度。
流程与工作流整合
该检测方法适用于从靶点验证到先导化合物鉴定的整个发现流程，提供功能性读数，为苗头化合物向先导化合物的推进以及临床前优先级排序提供依据。
- 发现生物学：在生理学相关的人源细胞中支持对低密度脂蛋白（LDL）调控通路的假设验证及靶点结合研究。
- 筛选：提供即用型检测体系，配备标准化的染色、孵育和成像方案，适用于化合物文库筛选。
- 分析：生成整合的强度与汇合度指标，可进行归一化处理，从而获得每孔准确的LDL摄取值。
- 转化研究：采用人源细胞系，提高临床前模型的预测价值，并促进生物标志物的一致性分析。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，用于在多个治疗领域中筛选胆固醇代谢调节剂。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低低密度脂蛋白（LDL）通路调控中的机制不确定性，提高靶点验证的可信度。
- 操作价值：通过自动化图像分析和标准化处理定义，提升实验可重复性。
- 战略价值：在一个实验中将药效读数与细胞毒性筛选相结合，增强“推进/终止”决策能力。
- 项目组合影响：基于均衡的LDL药效和细胞安全性特征，实现对化合物的风险调整后优先排序。
实施注意事项
- 需要具备活细胞成像系统、荧光探针操作以及基于图像分析软件的专业技术。
- 依赖于环境控制培养箱、10倍物镜及双通道（红色/相差）成像能力的设备条件。
- 为获得一致结果，需在不同团队间对细胞制备、铺板密度和饥饿处理方案进行标准化。
- 必须考虑不同细胞类型在胰酶消化及中和条件上的特异性（例如 HepG2、HK2 与 HCAECs）。
- 若使用 pHrodo red LDL 标记后未将培养板避光保存，则存在光漂白风险，限制实验效果。
