Name: 肿瘤切片提取物的建立与分析是诊断检测的前提 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学习建立和分析小鼠肺肿瘤器官型切片的方法，优化切片厚度和药物浓度以进行临床前药物测试。该技术可模拟原生组织复杂生物学功能，为肿瘤诊断和个性化医疗提供重要工具。

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本研究工作获得了创新药物计划联合企业项目资助协议编号o 115188、赫尔辛基大学生物医学博士项目奖学金（A.S.N.），以及西格丽德·尤塞柳斯基金会和奥瑞安-法尔莫斯基金会（E.W.V.）。我们诚挚感谢PREDECT组织切片技术平台联盟成员（www.predect.eu）在切片技术合作开发方面的支持，特别是John Hickman、Heiko van der Kuip、Meng Dong、Emma Davies、Simon Barry、Wytske van Weerden和Hanneke van Zoggel。感谢Taija af Hällström和Siv Knaappila在建立旋转系统方面提供的支持，以及Riku Turkki在MATLAB分析方面的协助。&#160;感谢Jouko Siro拍摄图1照片。感谢FIMM WebMicroscope团队对组织学切片进行扫描，以及实验动物中心提供的饲养支持。

本研究中描述的所有小鼠实验均遵循芬兰国家动物实验委员会的指南，并经赫尔辛基大学实验动物委员会和芬兰南部省级办公室批准（许可证编号 ESAVI/9752/04.10.07/2015）。
1. 切片前的准备工作
<ol>
	<li>准备好以下材料：振动切片机样品夹持器、振动切片机缓冲液槽、振动切片机冰浴装置、10 cm 培养皿、24孔板、10 mL 移液管、移液器助吸器、废液袋、装有70%乙醇的50 mL 离心管（用于器械消毒）以及组织胶。</li>
	<li>准备振动切片机：用70%乙醇擦拭刀片夹持器，安装新刀片，并根据说明书中的指导进行振动校准（http://photos.labwrench.com/equipmentManuals/10103-3895.pdf）。 
	注意：执行振动校准步骤非常重要，因为它可最大限度减少刀片的垂直偏转，从而确保获得高质量的切片。</li>
	<li>在24孔板的每个孔中加入1 mL 含100 U/mL 青霉素和100 µg/mL 链霉素的汉克斯平衡盐溶液（HBSS + P/S）；将该板置于冰上保存。</li>
	<li>配制F12培养基，添加100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、2 mM GlutaMAX、22 mM 葡萄糖和10%胎牛血清（FBS）。 
	注意：肿瘤组织切片培养基及生长因子添加剂的组成可能因肿瘤组织类型而异25。</li>
	<li>根据步骤1.4所述成分配制用于药物处理的F12培养基，但省略FBS成分。 
	注意：由于血清中的生长因子可能影响培养切片中的致癌信号通路，因此建议在肿瘤组织切片的短期药物干预研究中使用无血清培养基。若需分析较长期的组织切片培养，应首先评估无血清培养基对未处理切片中组织活力及肿瘤特异性标志物表达的影响。</li>
</ol>
2. 荷瘤肺组织的采集
<ol>
	<li>当荷瘤小鼠出现呼吸困难和体重下降症状时，采用颈椎脱位法处死。 
	注意：CO2介导的安乐死已知会在肺部诱导缺氧状态，这种状态可能通过引发缺氧反应，影响组织切片的存活能力或致癌活性。</li>
	<li>将已处死的小鼠固定于聚苯乙烯泡沫塑料盖上，通过插入25&#160;将小鼠四肢用G针固定于四个足垫，使其胸部暴露。&#160;在暴露的皮肤表面喷洒70%乙醇。</li>
	<li>从腹部向胸部切开皮肤，直至颈部区域。用镊子将两侧皮肤拉伸，并插入25 G针头。切开腹部区域，随后切开肋骨和膈肌，以暴露肺和心脏。&#160; 通过切除周围组织暴露气管。保持剪刀呈倾斜角度，以避免组织损伤。</li>
	<li>将带瘤的肺脏与心脏一同解剖取出，放入含有30 mL冰浴HBSS + P/S的50 mL离心管中；保持管子处于冰浴状态，并尽快进行下一步操作。 
	注意：肺肿瘤样本处理的延迟可能会改变致癌功能，例如信号通路活性。</li>
</ol>
3. 精密切割肺肿瘤组织片的制备
<ol>
	<li>将带有肿瘤的肺组织转移至含有 P/S 的 HBSS 中，并放入 10 cm 组织培养皿内。使用无菌剪刀和镊子分离肺叶，并选择表面有肿瘤的肺叶用于切片。 
	注意：大小 &#62;3 mm 的肿瘤适合切片。由于大肿瘤周围的正常肺组织因组织硬度差异会影响切片效果，因此应将用于切片的肿瘤组织与正常组织分离，使清晰的肿瘤区域面向振动切片机刀片。</li>
	<li>将选好的带有肿瘤组织的肺叶放置在一片滤纸上以防止滑动，并使用无菌手术刀切除肿瘤周围的部分正常肺组织或额外的肿瘤组织，从而形成一个平坦的组织表面。
	<ol>
		<li>将平坦的载玻片浸入一滴氰基丙烯酸酯胶水中。将此侧粘附到振动切片机的样品夹持器上，使肿瘤朝向刀片并保持直立位置。让胶水干燥 2–3 分钟。 
		注意：粘在样品夹持器上的正常肺组织不会干扰肿瘤组织的切片，且在切片过程中会在到达正常组织前停止。有时由于粘在夹持器上的正常肺组织具有海绵状质地，导致肿瘤组织弯曲，影响其直立位置。若发生此情况，可在已固定的正常肺组织旁再粘附一块额外的正常肺组织作为支撑，以保持肿瘤处于直立位置（图 1A iii）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品夹持器放入金属缓冲托盘中，并加入冷的含 P/S 的 HBSS，直至组织完全浸没于缓冲液中，然后用仪器配套的有机玻璃盖盖住缓冲托盘。将金属缓冲托盘置于白色冰浴中，并添加冰块以确保切片过程中组织保持低温。</li>
	<li>将白色冰浴固定到振动切片机上。选择合适的切片参数：振幅范围为 2.5–2.8，切片速度为 0.10–0.14 ms，切片厚度范围为 160–250 µm。&#160;将振动切片机刀头移至切片位置，设定切片区间并开始切片。 
	注意：切片参数需根据组织硬度进行调整。较硬的组织比柔软组织更容易切片，而较软的组织需要以较低速度（0.1–0.12 ms）和较高振幅（2.6–2.8）进行切片。一个直径约 4–5 mm 的肿瘤通常可获得 15–20 片厚度为 200 µm 的切片。对于短期培养，小鼠肿瘤可在超净台外的半无菌条件下进行切片。然而，临床来源的肿瘤必须始终在 II 级生物安全柜内的层流环境中进行切片，以避免人体组织中可能存在的传染性病原体暴露风险。</li>
	<li>使用无菌镊子将切片收集至置于冰上的 24 孔板各孔中，每孔含 1 mL HBSS，并密切记录切片的顺序。根据实验设计标记 24 孔板的各个孔。例如，将 24 孔板中的连续孔标记为不同培养时间点，或标记为 0 h、溶剂对照组（C）、药物处理组（T）（图 1B ii）。 
	注意：收集切片时切勿扰动或牵拉肿瘤组织，否则会改变肿瘤相对于刀片角度的方向，导致后续切片厚度不一致。</li>
	<li>当所有切片收集完毕后，将其转移至放置于 6 孔板中的钛网（每张网放置 2–3 片），每孔含 2.5 mL 培养基。确保钛网与培养基之间无气泡产生。
	<ol>
		<li>为将切片加载至钛网，将 6 孔板倾斜放置，使部分培养基覆盖钛网，然后将切片置于钛网上的培养基中；若切片卷曲，可用镊子轻轻展开。将装有钛网的 6 孔板放入恒温旋转培养装置中，该装置置于温度维持在 37 °C、含 95% 空气和 5% CO2 的加湿培养箱内，并启动旋转循环（图 1C i-ii）。 
		注意：在启动旋转装置前，必须准确平衡金属网格和&#160;6 孔板的重量。应将切片置于钛网中央，以确保其在旋转过程中能充分交替接触空气和液体相。若切片位置过高或过低，则无法充分获得氧气或营养物质（图 1C i），可能影响组织活性。在培养过程中需持续关注切片在钛网上的位置，因其偶尔可能发生滑移。若在培养开始后 1–2 小时内发生滑移，应及时调整其位置，并注明该样本可能存在损伤。若切片长时间处于错误位置，则应弃用，因其组织活性会因氧气供应和营养供给不当而显著受损。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在培养切片附近另取一片组织作为 0 h 未培养的对照参考样本。至少收集三片参考切片，分别代表被切组织的顶部、中部和中心区域。立即固定 0 h 切片，并按步骤 5.1 所述方法进行处理。 
	注意：若切片数量有限，例如，当进行多种化合物处理或多重复实验时，每个处理样本与其相邻的 0 h 样本之间的比较可能难以实现。在此类情况下，可使用最近的 0 h 切片（至少相距 400–600 µm）来评估培养起始时的相对组织活性或相关标志物的表达水平。</li>
	<li>对于长期培养，每天更换一次培养基。使用无菌镊子提起含有组织切片的钛网，将其暂时放置于 6 孔板的空孔中；更换 70% 的培养基为新鲜培养基后，再将钛网放回培养基中。继续按照步骤 3.6 所述方式进行旋转培养。</li>
</ol>
4. 使用小分子抑制剂处理肿瘤切片
<ol>
	<li>配制处理培养基中所需浓度的化合物。通常，为在组织切片中实现靶点抑制，所需药物浓度约为细胞培养中测得的IC50值的10倍。为避免非特异性细胞毒性，应测试一系列浓度，以确定每种化合物的最低有效浓度。此处，&#160;在小鼠非小细胞肺癌组织切片上测试了0.1–1 µM的PI3K/mTOR抑制剂dactolisib和0.05–0.5 µM的MEK抑制剂selumetinib。</li>
	<li>向6孔板中每孔加入2.5 mL含有稀释药物、DMSO或其他溶剂对照的培养基。将钛网放入各孔中。</li>
	<li>将组织切片放置于网格上，具体操作如步骤 3.6 所述。</li>
	<li>进行溶剂或药物处理24小时。随后按照第5节所述方法进行组织固定，并将切片处理成石蜡包埋块。 
	注意：药物处理时间可根据实验目的进行优化，同时需考虑组织切片保持其活性的能力。 原位 培养期间分析的组织功能。</li>
</ol>
5. 组织切片的固定与处理
<ol>
	<li>将未培养的0 h对照样本或已培养的组织切片小心地转移到浸有PBS的滤纸上。
	<ol>
		<li>具体操作：在直径10 cm的培养皿中放置一张滤纸，并在其上加入2–3 mL PBS。将组织切片置于滤纸表面，使用镊子将滤纸连同切片一起提起。</li>
		<li>将滤纸转移至组织包埋盒中，并在组织切片上滴加一滴稀释的苏木精染液（按1:1比例用去离子水稀释），以便在后续处理步骤中清晰标记切片位置（图1D）。</li>
		<li>盖上包埋盒，将其放入4%中性缓冲甲醛溶液中，在4 °C下固定过夜。 
		注意：将切片置于滤纸上时，需确保切片的顶部朝上；此方向对于后续切片和分析过程中识别切片的顶部、中部和底部区域至关重要，具体见步骤6.3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>次日，将包埋盒转移至70%乙醇中，并立即进行石蜡包埋组织处理步骤。</li>
	<li>在组织处理前，用100%乙醇将组织包埋盒清洗两次，每次10分钟。本实验使用微波组织处理仪，选择适用于1 mm厚组织的程序，并按照仪器说明书操作（https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf）。 
	注意：若使用其他类型的组织处理仪，应选择适用于薄组织样本的处理程序。</li>
	<li>进行石蜡包埋时，打开组织包埋盒，用手术刀小心地将切片从滤纸上剥离。弃去滤纸，将切片转移至含有液态石蜡的模具中。
	<ol>
		<li>用平头重物等工具将组织压紧至包埋模具底部，以确保切片均匀。将组织包埋盒的底部置于模具上方，在其上覆盖液态石蜡。将模具置于冷台上冷却30分钟，随后将模具与石蜡块分离。 
		注意：除水平包埋外，也可选择垂直包埋，即将组织切片直立放置。垂直切片可在单一切片上直接分析细胞活力或功能标志物表达的梯度变化25。而采用水平包埋切片进行梯度分析时，则需按照步骤6.2所述进行石蜡切片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 甲醛固定及石蜡包埋（FFPE）组织的处理与分析
<ol>
	<li>使用切片机对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的组织切片块制备厚度为 4 µm 的薄切片。切片时，调整组织块的角度，使其表面相对于刀刃呈水平方向；这是获得整个组织均匀切片的必要条件。</li>
	<li>为便于捕获可能由培养引起的细胞活力梯度、细胞在切片中的迁移现象，或培养后切片中生物标志物表达的梯度变化，请按照下文所述方法，从每个组织切片的顶部、中部和底部层次分别收集切片并置于载玻片上。</li>
	<li>首先将石蜡包埋组织切片的连续切片收集到载玻片的上部区域，随后继续将较深层组织的切片依次收集至载玻片的中部，最后收集至底部区域（图 1E）。 
	注意：为在一张载玻片上容纳三个切片，需修剪掉包埋组织周围多余的石蜡。</li>
	<li>将切片在 37 °C 下干燥过夜，随后按以下说明进行苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色或免疫组织化学染色。 
	注意：若 FFPE 切片在高温或长时间储存条件下存放，可能导致抗原性丧失。建议将石蜡切片储存于 4 °C，并在切片制备后 6 个月内完成免疫组织化学（IHC）分析。
	<ol>
		<li>进行 H&amp;#38;E 染色时，按以下步骤对石蜡切片进行脱蜡和水化处理：二甲苯中浸泡 3 次，每次 5 分钟；100% 乙醇中 3 次，每次 1 分钟；96% 乙醇中 2 次，每次 1 分钟；70% 乙醇中 1 次，1 分钟；去离子水中 2 次，每次 1 分钟。</li>
		<li>将切片浸入新鲜过滤的苏木精溶液中染色 10 分钟，然后在流动自来水下冲洗 5 分钟。将切片浸入酸性酒精（1% HCl 的 70% 乙醇溶液）中 2 次，随后再次在流动自来水下冲洗 5 分钟，接着用 0.5% 伊红溶液孵育 2 分钟。</li>
		<li>伊红染色后，按以下顺序将载玻片浸入酒精和二甲苯溶液中进行脱水：96% 乙醇中 2 次，每次 15 秒；100% 乙醇中 3 次，每次 30 秒；二甲苯中 3 次，每次 1 分钟。最后，使用基于二甲苯的封片介质封固切片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 组织活力与生物标志物表达的分析
<ol>
	<li>使用扫描仪对苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色的切片进行全片扫描，获取高分辨率图像。为评估组织活性，从组织扫描图像中截取代表切片顶部、中部和底部区域的快照。
	<ol>
		<li>使用图像处理软件，手动在组织坏死区域绘制掩膜，随后使用 MATLAB 对坏死区域进行定量分析。</li>
		<li>参照我们之前的研究方法（Närhi et al., 图 S2B 和 C）26，计算不同培养时间点切片相对于最近的 0 h 切片的相对活性。类似地，通过定量培养切片顶部、中部和底部区域的活性，并分别计算各区域相对于其最近 0 h 切片的相对活性，评估潜在的切片内活性梯度。 
		注意：尽管小鼠非小细胞肺癌（NSCLC）切片的单纯培养即可诱导坏死性细胞死亡，但不同肿瘤组织对离体（ex vivo）培养条件的生物学反应存在差异。例如，在源自乳腺癌模型的滤膜支持切片培养中检测到 HIF1α、ER 以及 F4/80 标记的巨噬细胞存在梯度分布25。因此，针对每种组织类型，均需结合 H&amp;#38;E 染色和免疫组化（IHC）分析来评估培养切片的状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对石蜡切片进行免疫组化（IHC）染色。以下 IHC 操作流程为起始方案，其他抗体需进一步优化。简要步骤如下：二甲苯浸泡 3 次，每次 5 分钟；100% 乙醇（EtOH）3 次，每次 1 分钟；96% 乙醇 2 次，每次 1 分钟；70% 乙醇 1 次，1 分钟；去离子水清洗 2 次，每次 1 分钟。
	<ol>
		<li>为暴露抗原表位，使用 pH 6 的 10 mM 枸橼酸缓冲液在 PT 模块中进行加热介导的抗原修复，随后在室温（21–23 °C）下用含 1% 牛血清白蛋白（BSA）和 10% 正常山羊血清（NGS）的 1× PBS 封闭 30 分钟。</li>
		<li>将一抗用含 1% BSA 和 5% NGS 的 1× PBS 稀释后孵育，可在室温下孵育 1–2 小时，或在 4 °C 过夜孵育。随后在室温下用抗兔二抗孵育 30 分钟，再使用 3,3′-二氨基联苯胺（DAB）进行显色检测。</li>
		<li>切片用苏木精（以去离子水 1:10 稀释）复染 30 秒，自来水冲洗 5 分钟，然后依次浸入酒精和二甲苯溶液中脱水：70% 乙醇 1 次，96% 乙醇 2 次，100% 乙醇 3 次，二甲苯 3 次（每步 1 分钟）。最后使用基于二甲苯的封片剂封片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对免疫组化染色切片进行全片扫描，&#160; 使用图像查看软件以能够完整捕获待分析组织区域的放大倍数导出为 TIFF 图像，并使用 ImageJ 进行定量分析。 
	注意：除扫描仪外，也可采用显微镜在 20× 或 40× 放大倍数下获取图像用于定量。图像放大倍数可根据待定量的标志物选择；核染色建议使用高倍镜图像，而细胞质或膜标志物可使用 20× 图像进行定量。
	<ol>
		<li>对于核标志物（本例为 NKX2-1 表达）的定量，使用 Fiji-ImageJ 将每张图像转换为 16 位图像，并上传图像进行分析。</li>
		<li>根据具体分析需求定制图像分析流程。本方案中采用以下流程定量 NKX2-1 阳性细胞核：识别主要对象 | 测量对象强度 | 过滤对象（最小值=0.0025） | 计算数学运算。结果以 DAB 染色细胞核占总细胞核数的百分比表示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

各种复杂的 体外 肿瘤模型，包括三维培养和类器官，已被开发用于模拟肿瘤的结构和致癌功能 体内 肿瘤组织29,30然而，三维培养或类器官的建立涉及组织解离，并在人工环境中选择性地培养单一细胞类型或少数几种细胞类型的共培养。因此，这类模型无法充分再现肿瘤异质性及肿瘤-间质相互作用的复杂性。相比之下，原位肿瘤切片能够维持组织结构及肿瘤生物学的复杂特征 原位 肿瘤，且无需进行大量操作。组织切片能够在原生微环境中模拟肿瘤细胞的这一能力，使其在临床前研究中具有显著优势。我们先前报道了一种优化的流程，用于制备和分析精密切割的肿瘤切片，并证明与滤膜支持相比，旋转培养装置可提高短期培养的小鼠非小细胞肺癌（NSCLC）组织切片的存活率。25,31然而，在旋转培养装置上进行培养在技术上具有挑战性，需要持续监测。本文介绍了一种用于生成肿瘤组织切片并利用旋转孵育装置进行培养的实验方案，以及配套的监测方法，以评估组织切片保持特定能力的情况 原位 肿瘤生物学，药物反应测试前的必要前提。
该方案中有多个关键步骤可确保组织完整性和肿瘤切片的活性。如果肿瘤周围存在正常肺组织，由于正常组织与肿瘤组织在质地和硬度上的差异，振动切片机可能产生厚度不一致或受损的切片。因此，在进行肿瘤切片前，必须去除周围的正常肺组织。另一个关键步骤是切片厚度，应针对每种组织类型仔细优化。此外，切片完成后，必须将切片大致置于网格的中央位置，以确保其能够准确地间歇浸入培养基并接触氧气。最后，在切片旋转培养期间，密切跟踪其位置非常重要，因为切片可能掉入培养基中；若发生此情况，可按照方案第3.6步所述采取相应措施。
除了组织处理以确保完整性外，免疫组化分析中还有一些关键步骤，用于判断切片在多大程度上反映了原始组织的特征。我们之前的研究表明，小鼠非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤在致癌信号通路活性方面表现出显著的瘤内空间异质性26这意味着，使用空间上分离的组织切片作为对照组或药物处理组可能会影响实验数据的可靠解读，因此应使用相邻近的切片作为对照组和测试样本。我们进一步发现，在新切割且未经培养的0小时切片中，增殖或致癌性磷酸化蛋白的表达水平与 原位 肿瘤组织的培养切片显示出癌性磷酸化蛋白表达的改变，特别是p4EBP1和pSRC的表达变化，以及通过Ki67免疫组化分析检测到的增殖改变。在24小时的人非小细胞肺癌（NSCLC）和前列腺癌切片培养中也检测到p4EBP1表达的类似改变（Narhi 等，补充图S3B-S3C、S5和S7）26这些发现表明，将培养的脑片与其最近时间点（0小时）未培养的脑片进行比较，对于评估组织保存状况至关重要 原位 肿瘤在培养切片中的功能。
尽管旋转系统提高了器官型切片的存活率25，但在技术层面上仍存在局限性。将组织切片放置于钛网支架上比使用滤膜插入式培养更困难，且旋转培养装置可能不易获得。作为替代方案，可使用静止的滤膜支撑系统，但此时仅能分析切片暴露于空气的一侧，因为在滤膜支撑的切片培养中，切片存活率和通过HIF1α表达检测到的缺氧状态会迅速形成从空气到滤膜的梯度变化（Davies et al.，图5及图7A-7B）25。我们还进一步发现，与原始肿瘤相比，肿瘤切片培养物可能表现出增殖活性和致癌信号通路活性的改变26，这可能是由于切片对离体（ex vivo）培养产生的伤口愈合反应或代谢适应所致32。尽管小鼠非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤在培养72小时期间保持了主要的形态学特征，但培养诱导的增殖性变化可能影响对培养切片的准确分级。因此，组织切片仅适用于短期功能性研究。
使用旋转孵育装置可在一定程度上改善组织切片内部的存活率或生物标志物表达梯度，尤其是在培养的前24小时内。在确认组织切片结构完整性和功能正常后，可将其用于功能研究，例如药物处理研究。除了药物反应谱分析外，药物处理后靶标表达水平的变化也有助于抗体验证。这一点在使用小鼠单克隆抗体检测小鼠表位时尤为重要，因为此类抗体通常会产生较高的染色背景。此外，在诊断和临床环境中获得可靠且可重复的数据，必须依赖经过充分验证的抗体。因此，药物处理后组织切片中相关表位的丰度或磷酸化水平发生改变，为抗体验证提供了便捷且实用的应用途径。肿瘤组织切片培养的一个主要优势在于能够模拟空间分布的功能，包括肿瘤细胞或基质细胞中的致癌信号通路活性或药物反应，使其成为一种有吸引力的离体（ex vivo）模型。然而，切片在培养过程中会发生旋转，且培养过程本身可能进一步损伤组织，尤其是边缘区域。因此，将0小时切片的生物标志物染色免疫组化图像与培养后切片中检测到的坏死区域进行精确叠加存在挑战，这限制了将空间生物标志物活性与药物反应精确关联的能力。此外，在小鼠非小细胞肺癌（NSCLC）组织切片中，肿瘤固有的、培养诱导的以及药物诱导的坏死反应至少在目前难以区分，从而影响对空间药物反应的准确量化。最后，肿瘤组织切片培养使研究人员能够在同一肿瘤上测试多种化合物，而无需对动物进行处理，从而实现了对实验动物使用的优化、减少和替代。
作为一种未来应用，所述方案可适用于临床实体瘤样本。可能需要根据不同的组织类型进行进一步的调整或优化，首先应调整振动切片机的参数，包括切片厚度和振动速度，以适应肿瘤组织的质地或硬度。此外，不同肿瘤组织对营养物质和生长因子的需求可能存在差异。例如，已有研究在培养乳腺癌组织切片时，在培养基中添加了胰岛素。13,18由于手术或活检过程中获取的组织材料有限，患者来源的肿瘤切片培养的优化可能具有挑战性，原因在于难以获得足够数量的重复样本。此外，由于患者间样本异质性显著，尤其是在肿瘤细胞比例与纤维化区域或间质浸润以及坏死组织成分之间的差异，数据的可重复性也受到挑战。最后，若将肿瘤切片应用于诊断场景，则需要进一步研究治疗前活检所获取的组织切片对药物的反应在多大程度上与治疗后的实际疗效相匹配。 体内 反应

实体瘤组织（包括肺癌）具有遗传和表型异质性，并含有复杂的微环境1,2肿瘤细胞与其周围微环境之间的相互作用对药物敏感性及耐药机制的影响3这凸显了建立能够准确模拟原发肿瘤中生物学复杂性与功能的临床前模型的必要性。由新鲜肿瘤直接制备的精密切割切片提供了一种独特的资源，因其具有真实再现肿瘤主要生物学特性的能力 体内 生物学，至少在短时间内，包括个体肿瘤内空间分布的表型。临床切除的肿瘤是癌症患者中少数可获取的个性化样本之一，其诊断用途值得深入审视。
类器官培养的历史可追溯至20世纪初th 20世纪，人类颅内肿瘤被手工切割成组织块，并采用所谓的悬滴法进行培养。将组织碎片附着在盖玻片上，使其浸入肝素化的人体血浆中，随后将盖玻片倒置、密封，并培养数周。4人工切割的肿瘤组织块已采用多种其他方法进行培养，例如在血浆凝块上培养5，在液体培养基中6，或0.45 µm孔径滤膜上6术语 &#34;器官型&#34; 首次用于1954年一项关于鸡胚眼睛视网膜分化的研究7随后，研究采用了源自鸡胚的肺和心脏组织外植体8以及成年大鼠的脑组织外植体9.
已报道多种切片方法，包括手动切片器10,11、Krumdieck组织切片器12,13以及振动切片机（vibratomes）11,14,15,16。Krumdieck组织切片器可制备出圆柱形的组织芯，随后使用切片机将其切成圆形组织切片。而振动切片机则采用振动刀片切片机进行切片。在一项关于肝组织切片的研究中发现，与Krumdieck切片器相比，Leica振动切片机所制备的切片具有更高的可重复性和一致性15。所使用的切片厚度范围为250至500 µm，多项研究报道即使培养至16天，切片仍能维持其活性及形态学特征14,10,17,18。然而，肿瘤具有多变的代谢特征，可能影响其营养需求，而组织硬度和基质成分等参数也可能影响通气和营养物质的流动。因此，不同类型的组织可能需要对切片方法和培养条件进行优化。
已采用不同的培养方法来支持脑片培养：i) 静止液-气界面培养，也称为静止支撑培养，其中将脑片置于浸没于培养基中的半透膜插入物表面。在此条件下，脑片的上表面暴露于空气中，而下表面则通过多孔插入物获得营养物质14,19；ii) 刮刀法（Trowel method），最初用于培养完整器官或胚胎组织切片。在此方法中，脑片被放置在由金属网格支撑的棉布或滤纸之上，滤纸浸入培养基中。为保持组织湿润，在脑片上方添加一层薄薄的培养基20,21,22。前两种方法统称为液-气界面培养；iii) 滚筒管培养，其中将脑片置于含有培养基的塑料管的扁平端内部，通过缓慢旋转管体，使组织在一个循环的前半段被培养基覆盖，后半段则暴露于空气进行通气23；iv) 旋转培养装置，其中脑片间歇性地接触含有营养物质的培养基并接受通气。与滚筒管培养不同的是，该方法中脑片被放置在置于含培养基的6孔板内的多孔钛网之上24。
来自切除实体瘤的组织切片自然呈现出一种诱人的 离体 可用于测试抗癌药物治疗反应的模型，因其能够在原生肿瘤微环境中评估特定肿瘤的存活能力、靶向通路活性及分子谱型。然而，需进一步验证肿瘤切片中测得的药物反应是否具有预测性 原位 在评估组织切片是否保留肿瘤特异性的生物学功能（如细胞增殖、组织病理学特征相关的细胞分化或致癌信号通路活性）时，明确这些功能的保留程度至关重要。制备、操作及培养过程中机械应力所引发的影响，以及培养诱导的适应性变化对组织切片质量和生物学功能的作用，是亟待解决的基本问题，直接关系到肿瘤来源切片在功能诊断中的实际应用能力。
我们获得IMI资助的联盟项目PREDECT（http://www.predect.eu）设立&#160;通过研究来自多种来源的组织切片外植体，系统性地解决这些基础性问题。该联合研究利用乳腺、前列腺和肺癌模型获得的组织切片，采用了定性评估以及定量的苏木精和伊红（H&amp;#38;E）为基础的检测结果，证明培养切片在72小时内维持活性需要大气氧及静止的滤膜支持。此外，对培养切片进行免疫组织化学（IHC）分析揭示了切片内部的存活率梯度，表现为源自小鼠非小细胞肺癌（NSCLC）切片的坏死梯度、乳腺癌切片中的雌激素受体（ER）、HIF1α和γH2AX梯度，或前列腺癌切片中的雄激素受体（AR）表达梯度。25有趣的是，在旋转培养装置中培养24小时后，小鼠非小细胞肺癌组织切片内的活性梯度得到改善，我们最近的研究表明，其活性可延长至72小时26尤其是顶部区域保持了最高的活性26支持对组织切片的这一侧进行药物反应分析为最佳选择。
尽管组织切片在多大程度上能够重现 原位 肿瘤功能研究中，它们被广泛用于测试对抗癌药物的反应，包括靶向药物、单克隆抗体和化疗药物10,11,13,14,18,27我们最近发现，与刚切好的0小时小鼠NSCLC组织切片相比，在培养后其增殖和致癌信号通路活性均表现出动态变化。26这表明有必要研究靶向 原位 在进行扰动研究之前，生物功能在培养过程中得以适当保留。尽管有这些发现，我们仍证明肿瘤切片能够模拟靶向治疗的空间响应，尽管药物处理时间较短（24小时），且在培养开始时即启动药物干预。26以下方案描述了在将肿瘤组织切片培养物应用于药理学药物测试之前，建立和分析该培养体系时所需考虑的重要验证方面。

<table><tbody><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 培养基</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21765-037</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺 200 mM</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯粘合剂 (GLUture)</td><td>Abbott</td><td>32046-90-1</td><td></td></tr><tr><td>Leica VT1200 S 振动切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td>14048142066</td><td></td></tr><tr><td>切片刀</td><td>VWR</td><td>PERS60-0138</td><td></td></tr><tr><td>钛网</td><td>Albamma 研发公司</td><td>MA0036</td><td></td></tr><tr><td>切片孵育装置</td><td>Albamma 研发公司</td><td>MD2500</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 组织培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>83.1802</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Sarstedt</td><td>83.1836</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Sarstedt</td><td>83.1839</td><td></td></tr><tr><td>Neolus 皮下注射针头</td><td>Terumo Neolus</td><td>NN2525R</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Greiner&amp;nbsp;</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Fisher</td><td>F/1501/PB08</td><td></td></tr><tr><td>三折组织包埋盒纸</td><td>Cancer Diagnostics</td><td>DX26280</td><td></td></tr><tr><td>组织包埋盒</td><td>VWR</td><td>720-2199&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>KOS 微波多功能组织处理仪</td><td>Milestone SRL</td><td>CAT307EN-003</td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>HM355S</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Ultra plus 载玻片</td><td>VWR</td><td>631-0099</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>NGS</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>PT-Module</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A80400012</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;E 染色用苏木精</td><td>Merck</td><td>1.09249.0500</td><td></td></tr><tr><td>复染用苏木精</td><td>Dako</td><td>S3309</td><td></td></tr><tr><td>伊红</td><td>Sigma</td><td>E4382</td><td></td></tr><tr><td>NKX2-1 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab133638</td><td>批号：GR98031-12</td></tr><tr><td>pERK 1/2 抗体</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>CST 4370</td><td>批号：17</td></tr><tr><td>p4EBP1 抗体</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>CST 2855</td><td>批号：20</td></tr><tr><td>BrightVision 多聚-HRP 山羊抗兔二抗</td><td>ImmunoLogic</td><td>VWRKDPVR-110HRP</td><td></td></tr><tr><td>封片剂 Pertex</td><td>VWR</td><td>MEDT41-4021-00</td><td></td></tr><tr><td>DAB&amp;nbsp;</td><td>ImmunoLogic</td><td>VWRKBSO4-110</td><td></td></tr><tr><td>Dactolisib (NVP BEZ-235)</td><td>Selleckchem</td><td>S1009</td><td></td></tr><tr><td>Selumetinib (AZD2644)</td><td>Selleckchem</td><td>S1008</td><td></td></tr><tr><td>Pannoramic 250 玻片扫描仪</td><td>3DHISTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://se.mathworks.com/products/matlab.html">https://se.mathworks.com/products/matlab.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER&amp;nbsp;</td><td>3DHISTECH</td><td></td><td>https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS6</td><td>Adobe</td><td></td><td>https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&amp;mv=search&amp;s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&amp;ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s</td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td>ImageJ</td><td></td><td>https://imagej.net/Fiji</td></tr><tr><td>CellProfiler</td><td>CellProfiler 细胞图像分析软件</td><td></td><td>http://cellprofiler.org/</td></tr></tbody></table>

建立和分析肿瘤组织切片外植体作为诊断检测的先决条件

Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

器官型原代组织外植体培养，包括精密切割的组织切片，能够保留天然组织的三维（3-D）结构以及多细胞间的相互作用。组织&#160;从新鲜切除的肿瘤中立即切取的组织切片可保留瘤内异质性（ITH）的空间特征，因此可作为研究瘤内异质性的有效替代模型 体内 生物学。组织切片制备及培养条件的精细优化，对于肿瘤组织外植体的预测性诊断潜力至关重要。在此方面，小鼠模型具有重要价值，因其可提供持续稳定的肿瘤组织来源，以开展重复性和可再现性的实验。本方案描述了利用旋转式培养装置培养小鼠肺癌来源组织切片的方法，该系统可实现组织间歇性接触氧气和营养物质。我们先前的研究表明，与其他培养方法（特别是漂浮切片法和静态滤膜支持法）相比，使用旋转式培养装置可显著提高组织的存活率。本文进一步表明，切片厚度会影响培养后切片的存活状态，提示应针对不同类型的组织优化切片厚度。在关键的肿瘤发生功能方面，如信号通路活性、基质细胞浸润或分化标志物表达，常存在显著的瘤内异质性（ITH），因此有必要对相邻组织切片进行分析，以评估药物处理或培养过程本身所引起的标志物表达变化。综上所述，本方案介绍了小鼠肺癌组织切片的制备及其在旋转式培养装置中的培养方法，并展示了在开展药物反应研究之前，如何系统性地分析异质性组织标志物的表达情况。

关键词：生物学，小鼠模型，肿瘤组织切片，旋转式培养装置，瘤内异质性，药物反应研究，组织培养，信号通路，基质细胞浸润，分化标志物

图1展示了从小鼠非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤中制备、培养和分析精准切割组织切片的工作流程。在本研究中，我们使用了一种基因工程小鼠模型（GEMM）产生的肿瘤，该模型具有KrasG12D的条件性激活以及Lkb1（也称为丝氨酸/苏氨酸激酶11）的缺失，以下简称KL。小鼠繁育及肺肿瘤诱导方法如文献26,28所述。图2A展示了使用旋转培养装置培养24小时后，组织切片厚度对切片存活率的影响。结果显示，160 µm的薄切片在整个切片范围内出现大面积坏死区域。此外，与200 µm的切片相比，250 µm的切片也表现出明显的坏死梯度。最薄的160 µm切片整体存活率较差，可能是由于在将切片放置于网格上时操作过程中技术处理所致，因为这些切片较为脆弱且容易卷曲。另一方面，当切片过厚时，可能因氧气或营养物质在切片内部扩散受限而出现缺氧或营养不足，在小鼠NSCLC离体组织中表现为坏死性死亡梯度25。然而需要注意的是，即使使用相同的振动切片机设置，从同一个肿瘤中仍可能产生不同厚度的切片。因此建议从多个不同肿瘤样本中分析多个重复样本。重要的是，每种组织类型都需要优化切片厚度以实现最大存活率，因为组织的质地和硬度可能影响氧合和营养物质的流动。图2B-2C展示了对NKX2-1表达进行的定量免疫组化（IHC）分析，NKX2-1是肺腺癌（AC）分化良好状态的标志物，检测样本为培养至72小时的组织切片及其匹配的0小时未培养切片。结果表明，与0小时未培养切片相比，培养切片中的NKX2-1表达无显著变化，提示培养过程并未明显影响AC肿瘤组织的分化状态。图2D展示了肿瘤组织切片在评估靶向药物有效性方面的应用价值。我们近期研究表明，与肺腺鳞癌（ASC）肿瘤相比，Kras突变型小鼠肺腺癌（AC）中磷酸化ERK1/2（代表MAPK通路活性增强）表达水平较高，而磷酸化4EBP1（代表mTOR通路活性）在AC和ASC肿瘤中表达相似26。为了验证这些通路是否可在组织切片上被有效靶向，KL型AC组织切片分别用DMSO或梯度浓度的化合物处理：使用0.1–1 µM的dactolisib靶向mTOR通路，或0.05–0.5 µM的selumetinib靶向MAPK通路。结果显示，1 µM dactolisib或0.5 µM selumetinib可分别有效抑制4EBP1或ERK1/2的磷酸化。此外，靶向磷酸化蛋白的剂量依赖性抑制表明，组织切片也可用于验证特异性识别磷酸化位点的抗体。
<img alt="肺肿瘤切片过程；振动切片；组织培养装置；FFPE包埋块制备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：建立和分析小鼠非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤来源的组织切片外植体的工作流程示意图。（A）肿瘤肺组织采集与切片前准备的示意图。从小鼠中取出肺叶，并将肿瘤组织从正常组织中分离。黑色箭头和星号分别指示约4 mm和1 mm大小的肿瘤。白色箭头指示被胶固定在样品托表面的肺组织。红色箭头指向额外添加的一块正常肺支持组织，用于保持肿瘤处于直立位置。（B）振动切片机进行组织切片及切片收集。白色箭头指示切片方向。将连续切片收集至含有冷HBSS + P/S的24孔板中。切片可用于不同时间点（此处为24–72 h）的培养，以评估培养期间肿瘤特异性标志物的表达（上排），或用于药物处理实验。C：溶剂对照，T：药物处理（下排）。（C）使用旋转培养装置进行组织切片培养的放置方法。倾斜6孔板，使部分培养基覆盖网格顶部，用镊子将组织切片置于网格中央的培养基表面，并将其展平。确保6孔板重量平衡，以实现平稳的旋转循环。X：表示错误，<img alt="静力平衡，ΣFx=0示意图，用于说明力矩平衡、杠杆系统分析" src="/files/ftp_upload/58569/58569eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式">：表示切片的正确放置位置。（D）肿瘤切片FFPE包埋块的照片。黑色箭头指向经苏木精染色的石蜡包埋组织切片。（E）FFPE包埋块中切片的切片顺序示意图；这些切片可进一步处理，用于评估组织活力及肿瘤特异性生物标志物的表达。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<img alt="NSCLC 组织切片中的活力检测和 NKX2-1 表达；显微图像、图表分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：NSCLC 组织切片中活力及组织学亚型特异性标志物表达的评估，以及靶向药物处理效果。（A）培养 24 小时后，不同厚度的肺腺癌（AC）NSCLC 切片的代表性 H&amp;E 染色图像。与 160 µm 或 250 µm 厚的切片相比，200 µm 厚的切片具有更好的存活能力。深蓝色代表 H&amp;E 染色的活组织，粉红色表示伪彩色显示的坏死区域。浅蓝色表示因组织质量差或存在纤维性间质而被排除在分析之外的区域。T1 和 T2 代表来自两个不同肿瘤的生物学重复样本。比例尺 = 500 µm。（B）在指定时间点培养后的 AC 切片中 NKX2-1 表达的代表性免疫组化（IHC）图像。箭头指示高倍放大所示区域。结果显示，与 0 小时切片相比，培养后的切片中 NKX2-1 表达未发生改变。低倍和高倍放大的比例尺分别为 500 µm 和 50 µm。（C）（B）中所示数据的定量分析。（D）0 小时切片、DMSO 处理切片或经梯度浓度 dactolisib（dact，上排）处理切片中磷酸化 4EBP1 或 ERK1/2 表达的代表性 IHC 图像；以及 0 小时切片、DMSO 处理切片或 selumetinib（sel，下排）处理切片中磷酸化 ERK1/2 表达的代表性 IHC 图像。黑色方框表示高倍放大所示区域。低倍和高倍放大的比例尺分别为 1 mm 和 50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们提供了一种用于生成、培养及系统分析源自小鼠肺癌肿瘤的器官型组织切片的方法。同时介绍了如何优化切片厚度，以及如何选择药物浓度以处理肿瘤切片。

保留三维（3-D）组织结构以及细胞间相互作用的器官型原代组织外植体培养，包括精密切割的组织切片，能够再现……

该方法有助于回答临床前研究中的关键问题，其中肿瘤组织切片的药物反应研究可能具有诊断价值。该技术的主要优势在于，组织切片在短时间内能够模拟天然组织的复杂生物学特性，包括空间分布的功能。尽管该方法可为小鼠肺癌组织切片的应用提供见解，但也适用于其他类型的组织，包括人类组织。首先，根据说明书中的操作步骤准备振动切片机并进行 VibraCheck。然后向 24 孔板的每个孔中加入 1 毫升含有青霉素和链霉素的 Hank's 平衡盐溶液，并将该板置于冰上。将一只已处死的小鼠放置在泡沫塑料盖上，用 25 号针头插入其四只足垫，使胸部暴露并拉伸动物体。在暴露的皮肤表面喷洒70%酒精。将剪刀呈倾斜角度放置，从腹部向胸部方向剪开皮肤，直至颈部区域。使用镊子将两侧皮肤拉伸，并插入25号针头。切开腹部区域，然后切开肋骨和膈肌以暴露肺和心脏。通过切除周围组织暴露气管。将肺脏与心脏一同解剖取出。将组织放入含有30毫升冰上预冷的、添加了青霉素-链霉素的HBSS溶液的50毫升离心管中，并立即尽快进行下一步操作。随后将带有肿瘤的肺组织转移至一个10厘米的组织培养皿中。使用无菌剪刀和镊子分离肺叶，并选择表面有肿瘤的肺叶进行切片。将带有肿瘤组织的肺叶放置在滤纸上以防止滑动，然后使用无菌手术刀切除肿瘤周围的部分正常肺组织或额外的肿瘤组织，以获得一个平坦的组织切面。将平坦的一面浸入一滴氰基丙烯酸酯胶水中，然后将其固定在振动切片机的样品托上，使肿瘤朝向刀片并保持直立位置，静置干燥两到三分钟。将振动切片机的样品架放入金属缓冲液托盘中。向托盘内加入含有青霉素-链霉素的冷HBSS，直至组织完全浸没在缓冲液中。用仪器附带的有机玻璃盖盖住缓冲液托盘，并将托盘置于白色冰浴中，加入冰块以确保切片过程中组织保持低温。将白色冰浴槽连接至振动切片机。然后选择合适的切片参数并开始切片。将振动切片机的刀片移至切片位置，并设定切片范围。使用无菌镊子将切片收集到24孔板中，每孔加入1毫升添加了青霉素-链霉素的HBSS，并置于冰上。在记录切片顺序的同时，根据实验方案标记24孔板的每个孔。收集与培养切片相邻的组织切片，作为零小时或未培养的对照。至少采集三个参考切片，以代表组织的顶部、中心和底部。切片完成后，继续进行固定和处理。随后，准备六孔板，每孔加入 2.5 毫升培养基，并将钛网置于其中。确保钛网与培养基之间无气泡形成。将脑片加载到钛网上时，将六孔板保持倾斜，使部分培养基覆盖钛网。然后将脑片置于钛网上的培养基中，并用镊子将其展开。放置切片后，将六孔板放入置于37摄氏度、含95% O₂和5% CO₂的湿化培养箱内的旋转孵育装置上，启动旋转循环。对于长期培养，每天需更换培养基：用无菌镊子将承载组织切片的网格取出，并将其置于六孔板的空孔中，然后更换新鲜培养基。更换70%的培养基，并重新放回网格。继续按照之前的旋转周期进行操作。对肿瘤切片进行药物处理时，向六孔板中加入2.5毫升含有稀释药物或溶剂对照的培养基。将钛网放入孔板的孔中，然后像之前一样将切片放置在钛网上。处理24小时后，继续进行固定和后续处理。开始固定时，用镊子小心地将目标切片转移至一个10厘米的培养皿中，培养皿内放置浸有2–3 mL PBS的滤纸，让切片漂浮其上。然后用镊子将滤纸取出，放入组织学包埋盒中。将滤纸转移至组织学包埋盒内。在组织切片上滴加一滴稀释的苏木精溶液，以标记切片位置，便于后续步骤操作。关闭包埋盒，将其放入4%中性缓冲甲醛溶液中，在4摄氏度下固定过夜。按照实验方案所述进行包埋盒的洗涤和后续处理后，打开组织包埋盒，用手术刀小心地将固定的组织切片从滤纸上剥离。弃去滤纸，将切片转移至含有液体石蜡的模具中。使用平底重物将组织压紧在包埋模具底部，以确保切片均匀。将组织学包埋盒的底部分置于模具上方，然后在其上添加液态石蜡。将模具在冷板上冷却 30 分钟。随后将冷却后的模具与石蜡块分离。使用切片机对 FFPE 组织切片块进行切片，制备厚度为 4 µm 的薄片。修剪掉组织周围多余的石蜡。为了在整个组织中获得均匀的切片，调整包埋块的角度，使其表面相对于刀片呈水平方向。使用细刷从玻片上端开始，收集石蜡包埋组织切片的连续组织切片。继续从深层组织切片向中间层收集切片，随后收集玻片底部区域的切片。将来自每张组织切片不同层次的切片转移至载玻片，旨在捕获可能由培养诱导产生的活力梯度、细胞迁移或生物标志物表达的变化。完成切片收集后，按照本实验方案所述步骤继续进行后续处理与进一步分析。组织切片的厚度可能影响培养切片的存活率。在此情况下，与200微米厚的切片相比，250微米厚的切片表现出更明显的坏死梯度，原因是较厚的切片更容易出现氧气或营养物质在切片内扩散不足的问题。然而，160微米的薄切片则存在较大的坏死区域，这可能是由于切片在定位过程中的技术操作所致，因为这些切片较为脆弱且容易卷曲。对肺腺癌分化良好的标志物NKX2-1的分析显示，与0小时未培养的组织切片相比，培养后的组织切片中其表达水平未发生显著改变。对NKX2-1表达的定量分析进一步证实，培养与未培养的组织切片之间其表达水平无显著差异，表明培养过程未明显影响腺癌组织的分化状态。为了验证肿瘤组织切片是否可用于评估靶向药物的疗效，研究中将其分别用DMSO或不同浓度梯度的化合物进行处理。当使用1 µM靶向mTOR通路的dactolisib处理时，4EBP1的磷酸化受到抑制。0.5 µM靶向MAP激酶通路的selumetinib可有效抑制ERK1/2的磷酸化。观看本视频后，您应能够充分理解如何操作并批判性分析从珍贵肿瘤组织新鲜切割的组织切片。我们之前的博士后研究员 Katja Narhi 与 IMI Predect 联盟组织切片平台的同事们合作，为本方法的建立做出了重要贡献。

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