Name: 细胞细胞接触物蛋白质-蛋白质相互作用的荧光波动光谱测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学习荧光波动光谱法在活细胞中研究细胞接触位点的蛋白质相互作用。该方法无需固定或破坏细胞即可实时分析受体介导的粘附与识别动态，适用于培养细胞、单膜囊泡及小型模式生物。

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本工作部分得到了德国研究基金会（DFG）项目编号254850309的资助。作者感谢Madlen Luckner对稿件的审阅。

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述实验方法可用于研究细胞间接触处的蛋白质-蛋白质反式相互作用，采用荧光涨落光谱技术，即sFCCS和ccN&amp;#38;B。这些方法通过对两个相邻细胞接触处表达的、分别与目标蛋白融合的两种光谱可区分的荧光蛋白所发出的荧光信号涨落进行统计分析，来量化邻近细胞质膜中蛋白质共扩散的程度，从而检测反式复合物的存在。除详细的样品制备、数据采集与分析方案外，本文还提供了该方法成功应用于神经细胞黏附蛋白APLP1的研究证据。我们证明，APLP1在细胞间接触处发生特异性的同型反式相互作用。此外，锌离子可促进APLP1在细胞间接触处形成簇状结构，从而为反式相互作用提供多价平台，并增强反式结合能力。
与以往基于破坏性生化方法检测此类相互作用的检测技术相比6该方法可直接在活细胞上进行，无需固定或分离蛋白质复合物。此外，通过检测与目标蛋白基因融合的荧光蛋白，该方法可提供分子特异性和相关信息，与以往的定性检测方法不同。8</su...

许多生物过程发生在细胞间相互作用的位点， 例如， 细胞间黏附1,2,3细胞-细胞融合4 以及细胞识别5此类事件在多细胞生物的发育过程以及细胞间通讯中尤为重要， 例如， 在免疫反应过程中，这些过程通常由定位于细胞表面的蛋白质介导。 即， 在邻近细胞的质膜（PM）上，并在细胞-细胞接触处发生特定的相互作用，这些相互作用在空间和时间上受到精确调控。在多数情况下，这些相互作用是直接的同源或异源蛋白质-蛋白质相互作用 转 相互作用，但也可能涉及作为细胞外连接物的离子或配体1尽管具有根本性的重要意义，但目前仍缺乏能够在活细胞天然环境中直接检测这些特定蛋白质-蛋白质相互作用的实验方法。许多技术手段都需要破坏细胞例如， 共免疫沉淀等生化实验6），固定（例如， 一些超分辨率光学显微技术与细胞间接触的电子显微镜观察7，或具有非特异性， 例如， 聚集/黏附实验8,9为解决这一问题，已采用基于荧光共振能量转移（FRET）的荧光技术10 或荧光互补11然而，为了实现荧光团之间足够小的距离，这些方法需要在蛋白质的胞外侧进行荧光标记10，可能会产生干扰 转 相互作用。
在此，我们介绍一种基于荧光的替代性检测方法，用于检测细胞间接触处的蛋白质-蛋白质相互作用。该方法结合了荧光交叉相关分析技术（扫描荧光交叉相关光谱法（sFCCS）、交叉相关数量与亮度分析（ccN&amp;B）以及表达目标蛋白融合构建体的细胞的混合 例如， 一种黏附受体。对两个相互作用细胞中所研究的受体分别用两种光谱分离的荧光蛋白（FPs）从细胞内侧进行标记（参见 图1A).
所采用的方法基于对荧光融合蛋白在共聚焦激光扫描显微镜焦点体积内扩散运动所引起的荧光强度波动进行统计分析。更具体而言，该检测方法可探测细胞间接触处相邻质膜（PM）中目标蛋白的共扩散行为。如果这些蛋白发生trans相互作用，则形成的trans复合物将携带可在两个光谱通道中发射荧光的荧光蛋白，从而导致两个荧光发射体的荧光波动呈现相关性；反之，若无结合发生，则相对质膜中蛋白的数量波动将相互独立，不会产生相关的荧光波动。数据采集可通过两种方式进行：1）扫描荧光相关光谱（sFCCS）基于对细胞间接触区域进行线状扫描，有效探测接触区某一特定位置的相互作用。通过对荧光波动的时间序列分析，sFCCS还可提供动力学信息，即蛋白复合物的扩散系数；2）细胞接触区光子计数与亮度分析（ccN&amp;B）则基于对细胞间接触区域获取的一系列图像进行逐像素分析。该方法能够探测并绘制整个接触区域（在一个焦平面内）的相互作用分布图，但无法提供动力学信息。两种方法均可结合分子亮度分析，即单个扩散蛋白复合物在单位时间内发射的平均荧光信号强度，从而估算细胞间接触处蛋白复合物的化学计量比。
本文提供了在商用共聚焦激光扫描显微镜上实施所述检测方法的详细实验方案，包括样品制备、仪器校准、数据采集与分析。该实验可在配备光子计数或模拟检测器以及高数值孔径物镜的任意仪器上进行。我们进一步讨论了实验方案中的关键步骤，并提供了针对多种导致伪信号波动过程的校正方法。 例如， 检测器噪声、光漂白或细胞运动。该检测方法最初用于研究贴壁细胞间的相互作用，但可经修改用于悬浮细胞，或调整以模拟膜系统。 例如， 巨大单层囊泡（GUVs）或巨大质膜囊泡（GPMVs），可用于在不同脂质环境或缺乏有序细胞骨架的情况下定量分析分子间相互作用12,13.
扫描荧光交叉相关光谱法 是荧光交叉相关光谱技术的一种改进版本14 并专门设计用于探测脂质膜中缓慢的扩散动力学15基于垂直于质膜（PM）的线扫描采集，其中包含感兴趣的荧光蛋白。为探究两种不同标记蛋白物种之间的相互作用，使用两条激光线和两个检测窗口，在两个光谱通道中进行采集，以实现光谱分离的荧光团检测。由于蛋白质在质膜中扩散动力学较慢（D≤~1 µm2/s），通过逐行交替激发方案，可实现无串扰的测量15分析始于：1）基于约1000行分块平均的侧向细胞运动校正比对算法，2）确定荧光信号最强的位置，即 PM位置，在每个模块中，以及3）将所有模块移至一个共同的原点12,15，分别在每个通道中进行。随后，通过对所有配准线段之和进行高斯拟合，并选取其中心区域，自动选择对应于质膜（PM）的像素。即， 中心 ± 2.5σ）。对每条线中的信号进行积分，得到膜荧光时间序列 F(t) 每个通道（g = 绿色通道，r = 红色通道）。请注意，像素尺寸必须足够小， 例如， &lt;200 nm，以重构点扩散函数的形状并确定其对应于 PM 位置的中心。当存在显著的光漂白时，可使用双指数函数对每个通道的荧光时间序列进行建模，然后通过以下公式进行校正：16
<img alt="数学建模的函数方程；公式显示；方程分析。" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 1">.    (1)
需要注意的是，与从未经校正的 F(t) 所得参数估计值相比，该公式可有效校正从 F(t)c 相关分析中获得的振幅和扩散时间。随后，计算荧光信号的自相关和互相关函数（ACFs/CCFs）：
<img alt="荧光涨落光谱分析中的自相关函数公式 G_auto(τ)。" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 2">，（2）
<img alt="涨落分析、显微镜背景下使用的互相关函数方程 G_cross(τ)。" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 3">，（3）
其中 δFi = Fi(t) - <img alt="色谱方程 ΣFx=0 示意图；化学分离过程中的质量平衡。" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1">Fi(t)<img alt="静态平衡；ΣFx=0 示意图；力学平衡图示；物理学教学概念。" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2">，且 i = g,r。
然后将一个二维扩散模型拟合到所有相关函数（CFs）上：
<img alt="荧光相关光谱分析公式，\( G(\tau) \) 的表达式。" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 4">.   (4)
此处， N 表示观察体积内荧光蛋白的数量 τd 每个通道的扩散时间。该模型考虑到，在所述实验条件下，蛋白质在质膜中的扩散发生在 x-z 平面，而与常用的荧光相关光谱（FCS）实验配置不同，后者通常探测共聚焦体积 x-y 平面内的膜扩散。17腰围0 以及描述伸长 w 的结构因子 Sz z方向上焦体积的，S = wz/ w0通过使用光谱特性相似的染料，并采用已知的扩散系数值，在相同的光学设置下进行单点FCS校准测量而获得 D染料:
<img alt="“方程 w₀=√(4τd,dyeDdye)；分子扩散分析；公式，研究”" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 5">， （5）
其中 τd,dye 是通过将三维扩散模型拟合到数据中得到的染料分子的实测平均扩散时间，拟合时需考虑所有 N 个分子中有一部分比例为 T 的分子以时间常数 ττ 转变为三重态：
<img alt="荧光相关光谱方程；用于分析分子动力学，τ依赖公式。" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 6">.   (6)
最后，如下计算sFCCS数据的扩散系数（D）、分子亮度值（ε）和相对交叉相关性（rel.cc.）：
<img alt="阻尼系数公式，D=ω₀²/4τd，显示动态稳定性分析方程。" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 7">,    (7)
<img alt="静态平衡方程，ε=⟨F(t)⟩/N，公式，教育研究，简明描述。" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq11.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 8"> ,   (8)
<img alt="静态平衡，公式：rel.cc=max{C_cross(0)/C_g_auto(0),C_cross(0)/C_r_auto(0)}。" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq12.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 9">,   (9)
其中，Gcross(0) 为互相关函数的幅度，<img alt="静态平衡；ΣFx=0，ΣFy=0；示意图；力学稳定性分析方程。" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq14.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 14"> 为第 i 个通道自相关函数的幅度。
相对互相关函数的这一定义， 即 使用 最大 而不是 平均值 在公式9中，考虑了两种不同浓度的蛋白质物种所形成的复合物的最大数量受限于数量较少的物种。
交叉相关数与亮度基于在样品固定位置随时间采集的图像序列中每个像素的荧光强度矩分析，该图像序列通常包含约 100–200 帧，并具有两个光谱通道（g = 绿色通道，r = 红色通道）。根据时间平均值 <img alt="色谱方程 ΣFx=0 图示；化学分离过程中的质量平衡。" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1">I<img alt="静力平衡；ΣFx=0 图示；力学平衡示意图；物理学教学概念。" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2">i 和方差 <img alt="静力平衡；公式 Σσ²ᵢ；物理方程；教学图示" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq16.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 16">，可在每个像素和光谱通道（i = g，r）中计算出分子亮度 εi 和分子数 ni18：
<img alt="静态平衡方程：εᵢ = (σᵢ²/⟨Ι⟩ᵢ) - 1，数学公式示意图。" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq20.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 10">,   (10)
<img alt="统计数据分析方程，显示加权平均值计算方法的公式" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq21.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 11">。（11）
需要注意的是，上述方程适用于理想情况下的真正光子计数探测器。对于模拟检测系统，应使用以下方程19,20：
<img alt="静力平衡方程；应变分析符号 εi；材料应力评估的数学公式。" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq22.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 12">,   (12)
<img alt="过程分析的统计公式；方程包含偏移量计算和方差项。" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq23.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 13">.   (13)
此处，S 是检测到的光子数与记录的数字计数值之间的转换系数， <img alt="静力平衡公式 σ₀²；方程图像。" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 24"> 是读出噪声，以及 偏移量 指检测器的强度偏移量。通常，对于任何类型的检测器，都应基于在稳定光照条件下测量检测器方差随强度的变化来校准这些参数。19, 例如， 反射性金属表面或干燥的染料溶液。 偏移量 可通过测量无激发光照射样品时的计数率来确定。通过对接收器相关方差进行线性回归分析 <img alt="静态平衡；ΣFx=0 方程；示意图；教育，物理概念，受力分析" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq25.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 25"> 与强度的关系（I）图，S 和 <img alt="静力平衡公式 σ₀²；方程图像。" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 24"> 可以确定19:
<img alt="静态平衡公式 σ²d = S(l) - S ⋅ offset + σ²₀。数学方程示意图。" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq27.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 14">.   (14)
最后，计算每个像素的交叉相关亮度，其通用定义为21
<img alt="光谱相关系数的BCC公式；方程；研究与分析关键词。" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq28.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 15">， (15)
其中 <img alt="数学语境中的统计符号 σ²，用于方差计算。" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq29.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 29"> 为互协方差 <img alt="信号处理分析中的互协方差公式 σ²_cc；数学方程。" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq30.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 30">。
为了滤除长寿命的波动，所有 ccN&amp;B 计算在对每个像素独立进行箱形滤波后执行22简而言之， niεi (i = g, r）和 Bcc 在滑动片段中进行计算 例如， 8-15 帧。随后可对所得数值取平均值，以获得最终的像素数量和亮度值。
化学计量学分析 
为了估算细胞-细胞接触处蛋白质复合物的化学计量比，可对 sFCCS 或 ccN&amp;B 数据的每个光谱通道分别分析分子亮度。在 sFCCS 中，每次测量在每个通道中获得一个亮度值。在 ccN&amp;B 中，获得对应于细胞-细胞接触的所有像素的亮度直方图，并可使用其平均值（或中位数）作为该次测量的代表性亮度。通过对单体参考蛋白进行相同的分析，所有亮度值均可归一化，从而直接获得所检测蛋白质复合物的平均寡聚状态。此时，重要的是需校正非荧光荧光蛋白（FP）的存在，因其可能导致对寡聚状态的低估。通常通过使用单色 sFCS 或数量与亮度（N&amp;B）方法测量同源二聚体参考蛋白的亮度来实现这一校正23,24。

<table><tbody><tr><td>DMEM 培养基</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-01548</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 DPBS</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 DPBS</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-35500</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 EDTA</td><td>PAN-Biotech</td><td>P10-023100</td><td></td></tr><tr><td>TurboFect 转染试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T 细胞</td><td>DSMZ</td><td>ACC 635</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 NHS 酯</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明 B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83689-1G</td><td></td></tr><tr><td>质粒 DNA</td><td>Addgene</td><td>NA</td><td>有关所有质粒的详细描述，请参见参考文献 12（Dunsing 等，MBoC 2017）</td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Starlab</td><td>CC7672-7506</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿</td><td>CellVis</td><td>D35-14-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM780 共聚焦显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 软件包</td><td>MathWorks</td><td>&amp;nbsp;2015b&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 细胞计数板</td><td>Marienfeld</td><td>640110</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于检测细胞间接触处蛋白质-蛋白质相互作用的荧光涨落光谱分析方法

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

多种生物学过程涉及细胞间的相互作用，这些相互作用通常由位于相邻细胞界面处相互结合的蛋白质介导。目前，仅有少数检测方法能够特异性地直接探测活细胞中的此类相互作用。本文介绍一种用于测量相邻细胞表面表达的蛋白质在细胞-细胞接触区域结合情况的检测方法。该检测方法包括两个步骤：将表达目标蛋白（分别与不同荧光蛋白融合）的细胞混合，随后利用共聚焦激光扫描显微镜在细胞-细胞接触部位进行荧光涨落光谱测量。我们通过测量淀粉样前体样蛋白1（APLP1）在细胞间连接处的相互作用，验证了该方法在生物学相关背景下的可行性。本文提供了基于荧光技术的数据采集详细方案，包括扫描荧光互相关光谱、互相关计数与亮度分析，以及所需仪器校准步骤。此外，我们还讨论了数据分析中的关键步骤，以及如何识别并校正由光漂白或细胞运动等因素引起的外部干扰信号变化。
通常，该检测方法适用于同型或异型细胞间接触处的蛋白质-蛋白质相互作用，可用于相同或不同类型的细胞之间，并可在商用共聚焦激光扫描显微镜上实施。一个重要的要求是系统的稳定性，必须足够稳定，以在数分钟内探测目标蛋白质的扩散动力学。

蛋白质-蛋白质相互作用检测的初步实验 即， 表达光谱不同的荧光蛋白的细胞混合，随后进行sFCCS/ccN&amp;B 测量（图1），应在那些不预期在细胞-细胞接触处发生相互作用的蛋白质上进行即， 阴性对照）。因此，将表达豆蔻酰化-棕榈酰化-mEYFP（myr-palm-mEYFP）或-mCardinal的HEK 293T细胞混合，并在细胞-细胞接触区域进行溶液荧光相关光谱（sFCCS）分析（图2A）。在理想情况下，由于蛋白质在质膜（PM）中的扩散运动以及焦体积内蛋白质分子数量的统计学波动，每个通道的荧光信号应围绕一个稳定的均值波动。对于不发生相互作用的蛋白质，两个通道中的波动彼此独立，因此光谱交叉相关性预期在零值附近波动。事实上，在典型的测量中观察到相对交叉相关性接近于零。图2C）。ACF 显...

本方案描述了一种基于荧光涨落光谱的方法，用于研究介导细胞间相互作用的蛋白质之间的相互作用。 即 位于活细胞细胞连接处的蛋白质。我们提供了有关仪器校准、数据采集与分析的详细指南，包括对可能产生伪影的来源进行校正的方法。

多种生物过程涉及细胞间的相互作用，通常由位于相邻细胞界面处相互作用的蛋白质介导……

该方法有助于理解细胞间相互作用领域的关键问题，例如哪些受体介导了细胞间接触中的黏附或识别，以及特定配体是否触发了它们的相互作用。该技术的主要优势在于，它允许直接在活细胞中研究此类相互作用，而无需对细胞进行固定或破坏。尽管该方法常用于研究培养细胞之间的相互作用，但也可应用于其他系统，如单层膜囊泡甚至小型模式生物。通常，初次使用该方法的研究人员应仔细检查细胞运动情况及信号的缓慢变化，以确认样品在数分钟内具有足够的稳定性以完成数据采集。首先，在转染前一天，将适当数量的细胞接种至六孔板的至少四个孔中。在37°C、5% CO₂条件下，使用添加了10% FBS和1% L-谷氨酰胺的DMEM培养基培养细胞。进行基础实验时，在不同的孔中分别转染编码目的蛋白与绿色或黄色荧光蛋白融合的质粒以及编码红色荧光蛋白的质粒。转染四小时后，移除培养基，用一毫升含镁和钙的磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤每个孔，将PBS滴加至孔壁边缘，以防止洗涤过程中细胞脱落。随后吸除PBS。向每个孔中逐滴加入约 50 微升 EDTA 溶液，以促进细胞脱离。在 37 摄氏度孵育两分钟后，缓慢横向摇动六孔板，使细胞脱落。接着，向每个孔中加入 950 微升培养基，通过上下吹打数次重悬细胞，从而使所有细胞从孔底完全脱离。通过肉眼观察重悬后是否存在大的细胞团块，确保细胞充分重悬并彼此分离。将一个孔中的细胞悬液转移至对应的孔中，轻轻吹打数次以混匀。然后将混合细胞接种到35毫米玻璃底培养皿中，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养一天。在激光扫描共聚焦显微镜软件中设置光路。为避免光谱串扰，选择两条独立的通道，依次激发和检测mEGFP或mEYFP以及mCherry或mCardinal，并选择“逐线切换通道”。检测时，为两个通道选择合适的滤光片。将含有混合细胞的培养皿放置在样品架上。等待10分钟，以确保温度平衡并减少焦距漂移，然后在“定位”菜单中使用透射光对细胞进行聚焦。寻找一对相互接触的红色和绿色细胞。接着，使用裁剪按钮选择一条垂直于细胞间接触的扫描路径。调整放大倍数，使像素大小达到50至200纳米，并在扫描模式下选择线扫描。将帧大小设置为 128 乘以 1 个像素。将扫描速度设置为允许的最大值。然后将循环次数设置为 100,000 至 500,000。随后，选择适当的激光功率。将检测器设置为光子计数模式。按下“开始实验”以启动数据采集。将原始数据文件导出为 RGB TIF 格式的原始数据图像。该文件将包含一个共聚焦图像，其中绿色通道和红色通道的数据分别位于图像的 G 和 R 通道中。接下来，使用适当的分析软件导入该 TIF 文件，并继续进行分析。通过使用500到1000行的分段进行逐段时间平均来对齐图像行。确定每个分段中的膜位置，然后将所有分段移动至相同的横向位置。沿时间轴对所有对齐的线条求和，并使用高斯函数拟合平均强度分布。将膜位置左右各2.5个标准差范围内的像素定义为对应膜的像素，对每条线中这些像素的强度求和，从而获得每个时间点的单一荧光信号值。若观察到光漂白现象，则通过双指数函数拟合膜荧光时间序列，并应用相应的校正公式进行漂白校正。根据相应的方程计算自相关和互相关函数。为提高分析的可靠性并避免伪影，对整个测量数据的10至20个等长片段分别进行计算。检查每个片段的荧光时间序列及相关函数，并剔除明显失真的片段。最后，对所有未发生畸变的片段进行平均。在分析数据时，应仔细检查每个片段的强度时间序列和相关函数，以避免由膜周边的细胞内囊泡等因素引起的畸变。此处展示了表达myristoylated-palmitoylated-mEYFP或mCardinal的HEK 293T细胞的强度图像。在质膜中，肉豆蔻酰化-棕榈酰化-mEYFP和mCardinal的扩散表现出10至20毫秒的特征衰减时间，其自相关函数显示了这一结果，而相对互相关接近于零。在表达膜锚定异源二聚体肉豆蔻酰化-棕榈酰化-mCardinal-mEYFP的HEK 293T细胞中进行的sFCCS测量，其互相关函数具有正振幅，并显示出与自相关函数相似的衰减时间。在表达APLP1-mEYFP和APLP1-mCardinal的细胞间接触区域进行的sFCCS测量，得到0.45的正相对互相关值。从细胞-细胞接触处的 APLP1 簇获得的 sFCCS 相关函数显示，由于在较大滞后时间下振荡的衰减时间显著延长，其动力学明显降低。加入锌离子后，相对交叉相关性增加至平均值 0.8。此外，分子亮度从较小的寡聚体显著增加至每个细胞上由 10 到 50 个单体组成的较大多聚体。瞬时不稳定可能导致互相关函数出现负值或产生较高的假阳性互相关。相应的相关函数通常会显著偏离大多数片段的相关函数。作为sFCCS互相关分析的补充方法，可通过计数与亮度分析来检测蛋白质-蛋白质相互作用。在进行该操作时，需牢记混合转染细胞是一个关键步骤。应轻柔混匀细胞，并优化转染效率，以提高找到相互接触的红色和绿色细胞的概率。该技术建立后，已被免疫学领域的研究人员用于探索免疫突触中信号分子的相互作用。

a-fluorescence-fluctuation-spectroscopy-assay-protein-protein

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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蛋白质-蛋白质相互作用成像 体内

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