Name: 使用培养的果蝇卵室延时电影对局部细胞和组织尺度的actomyosin动力学的分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学习使用Fiji软件分析果蝇卵室中单个上皮细胞和弯曲上皮组织的肌动球蛋白动力学。该方案无需编程知识，通过直观的图形用户界面帮助研究人员在细胞和组织尺度上研究细胞力学行为。

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作者非常感谢Miriam Osterfield分享了关于使用源自Celeste Berg实验室方法进行卵室体外活体成像的宝贵建议4。&#160;我们还感谢Sebastian Tosi提供了用于细胞分割的Fiji脚本。

<ol><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3679(2012).</li>
<li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68, 207-217 (2014).</li>
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<li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331, 1071-1074 (2011).</li>
<li>Andersen, D., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+ovarian+muscle+contraction+and+oocyte+growth+on+egg+chamber+elongation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila.</a> Development. 143, 1375-1387 (2016).</li>
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<li>Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bullwinkle+is+required+for+epithelial+morphogenesis+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).</li>
<li>Cetera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+rotation+promotes+the+global+alignment+of+contractile+actin+bundles+during+Drosophila+egg+chamber+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation.</a> Nature Communications. 5, 5511(2014).</li>
<li>Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+rotation+is+preceded+by+planar+symmetry+breaking+of+actomyosin+and+protects+epithelial+tissue+from+cell+deformations%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations.</a> PLOS Genetics. 13, e1007107(2017).</li>
<li>Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+polarized+actomyosin+contractile+flows+control+epithelial+junction+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling.</a> Nature. 468, 1110-1114 (2010).</li>
<li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).</li>
<li>Haase, R. Surface manager. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager">https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager</a> (2018).</li>
<li>Viktorinova, I., Haase, R., Pietzsch, T., Henry, I., Tomancak, P. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins">https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins</a> (2018).</li>
<li>Pietzsch, T. BigDataViewer. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/BigDataViewer">https://imagej.net/BigDataViewer</a> (2017).</li>
<li>Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigDataViewer%3A+visualization+and+processing+for+large+image+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets.</a> Nature Methods. 12, 481-483 (2015).</li>
<li>Turner, C. M., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons+in+the+morphogenesis+of+epidermal+hairs+during+wing+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila.</a> Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).</li>
<li>Heemskerk, I., Streichan, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cartography%3A+compressing+bio-image+data+by+dimensional+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction.</a> Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).</li>
<li>Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+Breaking+in+an+Edgeless+Epithelium+by+Fat2-Regulated+Microtubule+Polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity.</a> Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).</li>
<li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nature Methods. 12, 30-34 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

卵室解剖与培养的关键步骤及故障排除
若将过多的果蝇放入一个小瓶中，由于大量幼虫取食以及成虫被困在果蝇食物中，2–3天后果蝇食物可能变得泥泞。在这种情况下，应将剩余果蝇转移至含有新鲜食物的新瓶中，并减少果蝇数量。特别需要剔除那些被困在食物中的雌蝇。
应提前配制 Schneider 培养基（SM），并在 4 °C 下保存约 14 天。需注意，存放过久的培养基可能产生晶体，从而损伤卵室表面。每次使用时，务必用新加入胰岛素的 SM 充分混匀，并使其有足够时间恢复至室温。这可保护卵室免受冷休克损伤，冷休克会对微管的生长以及细胞骨架的平面排列产生不利影响（如在发育中的Drosophila翅中所见19）。
卵泡和选定的卵管非常脆弱，且由于体积微小，可能在含胰岛素的SM培养基（SMI）中漂浮。建议让它们在SMI中自然沉降。它们也常会粘附在解剖镊子或仙人掌针工具上。若发生此种情况，可轻轻在S...

新型成像技术和软件技术在生命科学领域的持续发展，极大地推动了人们对生命基本原理的理解。其中一个主要挑战是，如何可靠地可视化发育过程，并结合对各种组织的活体成像。组织是器官和生物体的组成部分，因此大多数组织难以直接进行成像观察。为此，研究人员已开发出相应的实验方案，通过对组织进行解剖并进行体外培养，以可视化能够充分反映活体生物体内真实情况的生物学事件。
几十年来，对类似于原始器官的果蝇（Drosophila）卵泡（具有腺泡样结构）进行培养和活体成像，极大地促进了人们对原始器官发育基本原理的理解1,2,3。目前已有多种培养方案可供选择，具体使用哪种方法取决于成像时间、目标细胞类型以及细胞位置的可及性（例如，内部生殖系细胞与外部体细胞系）4。
所有这些培养方案的一个共同特点是需要将表现出强烈收缩活性的卵室固定在液体培养基中。卵室的收缩活性主要由覆盖在成串相连卵室表面的肌细胞层引起5,6,7。因此，为了有效固定年轻的卵室，已发展出多种方法，包括使用盖玻片6,8,9、柔性覆盖膜4,10或低熔点琼脂糖包埋3,11来固定卵室。这些方法较为常用，因为它们还能通过轻微压平卵室的环周表面，实现更大视野范围的成像。
然而，最近的研究表明，年轻的卵室（1-8 阶段）会围绕其前后轴旋转6，而这种组织运动是由靠近这些年轻卵室周向表面的一层精细的肌动蛋白-肌球蛋白网络所驱动的12。因此，由于该组织轻微压扁所导致的细胞表面人为改变，可能对产生力的肌动蛋白-肌球蛋白装置的行为产生负面影响。相反，如果卵室组织未被压扁，则在卵室周向表面的蛋白质显微成像将因成像平面尺寸减小而受到更大限制。
因此，我们整合了Prasad等人的实验方案。9 以及Celeste Berg的实验室4,10 并且进一步改进了这些方法，使得所开发的方法中无需使用盖玻片、柔性覆盖膜或琼脂糖。 黑腹果蝇 卵室在培养基中自由培养，本文所述方案仅适用于倒置显微镜观察。该方案包含两个部分：第一部分侧重于分析卵室内局部细胞尺度（最多15个细胞）的肌动球蛋白信号；第二部分旨在克服因卵室自由培养所导致的成像平面受限的问题。为此，我们开发了一种基于Fiji的新型计算方法，配备半交互式图形用户界面，可选择性地提取并展开环状组织表面的特定层次。随后的方案描述了如何在组织尺度上分析肌动球蛋白（即 &#62;50个细胞）。由于使用传统的z轴堆叠投影难以选择性地提取弯曲上皮组织的特定薄层，图1），这种易于使用的方法是全面理解的重要前提&#160;薄层（的）行为&#60;1 µm）的肌动球蛋白网络在组织尺度上 果蝇 卵室
此外，为了便于实验操作，我们提供了荧光标记的非肌性常规肌球蛋白II行为的示例延时成像视频（TLMs）和样本文件（见 补充文件 3）。肌球蛋白&#160;II 是一种马达蛋白，代表肌动球蛋白机械装置中具有活性的收缩部分。为了对肌球蛋白 II 进行成像，我们使用 果蝇 表达经修饰的肌球蛋白II调节轻链（称为MRLC::GFP）的转基因品系（参见 材料表 详情请见12,13为了可视化细胞膜，该方案基于商用染料（参见 材料表）。该方案不仅适用于小亚细胞结构中MRLC::GFP信号的分析12 但也可用于其他大小相似的亚细胞颗粒（约 ±300 µm），例如使用 Life-Act::GFP 观察到的颗粒12,14.
尽管本方案中使用的是体外培养的黑腹果蝇（Drosophila）卵室，但通过优化培养基，并根据实验条件选择使用荧光标记蛋白及相应的商用染料，或例如通过mRNA显微注射以获得瞬时基因表达谱，该肌动球蛋白信号的获取方法也可应用于其他组织。类似地，基于Fiji的从环周表面提取薄层图像的方案也可更广泛地应用于类椭球形或类器官组织。

<table><tbody><tr><td>施奈德培养基</td><td>Gibco</td><td>21720-024</td><td>[+]-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>&amp;nbsp;[+] 10.000 单位/毫升 青霉素 [+] 10.000 &amp;micro;g/mL 链霉素</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;F135</td><td>热灭活</td></tr><tr><td>人胰岛素溶液</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;I9278</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon管</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>无菌的</td></tr><tr><td>Millex-GV 滤器</td><td>Millipore</td><td>SLGV033NS</td><td>33 mm</td></tr><tr><td>玻璃底小孔培养皿</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>35 mm 培养皿，14 mm 微孔，No. 1.5 盖玻片</td></tr><tr><td>镊子</td><td>A. Dumont &amp;amp; Fils</td><td></td><td>&amp;nbsp;#55</td></tr><tr><td>CellMask Deep Red（细胞膜染料）</td><td>Invitrogen</td><td>C10046</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64（细胞膜染料）</td><td>ThermoFisher/Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>抑郁解剖载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-560B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>例如 Zeiss</td><td></td><td>Stemi SV 6</td></tr><tr><td>倒置共聚焦显微镜</td><td>例如 Zeiss/Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋转盘显微镜</td><td>例如 Zeiss/Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜用玻璃/盖玻片</td><td>例如：Thermo Scientific/Menzel Glas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cactus 工具&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wironit 针持</td><td>Hammacher</td><td>9160020</td><td></td></tr><tr><td>仙人掌刺</td><td>金琥/仙人球</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;果蝇&lt;/em&gt; 文稿中使用的品系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;AX&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;/AX&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>详情请参见 Rauzi 等：平面极化肌动球蛋白收缩流调控上皮细胞连接重塑。Nature 2010，第468卷，第1110-1115页。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;AX&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;/AX&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;；sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP；fat2&lt;sup&gt;58D&lt;/sup&gt;/fat2&lt;sup&gt;103C&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>详情参见 Viktorinova 等：上皮旋转先于肌动球蛋白平面的对称性破缺，并保护上皮组织免受细胞形变。《PLoS 遗传学》2017 年，第 13 卷，第 11 期，页码 e1007107。</td></tr></tbody></table>

利用培养细胞延时成像分析局部细胞与组织尺度下的肌动球蛋白动力学 黑腹果蝇 卵室

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila 的未成熟卵称为卵室，其结构类似于原始器官，在发育过程中会经历从圆形到椭圆形的形态变化。这一发育过程称为卵发生，对于产生具有功能的成熟卵子以确保下一代果蝇的繁衍至关重要。因此，卵室一直是研究动物器官发育的理想且相关的模型。
已开发出多种体外培养方案，但这些方案存在若干缺点。其中之一是使用各种盖片对成像的卵室施加人为压力，以固定卵室并增加所分析卵室圆周表面的成像获取平面。这种方法可能对产生驱动力使卵室沿其长轴旋转的细小肌动球蛋白装置的行为产生负面影响。
因此，为了克服这一局限性，我们将 Drosophila 卵室在培养基中进行游离培养，以便可靠地分析卵室周长上的肌动球蛋白装置。在本实验方案的第一部分，我们提供了一份操作手册，详细说明如何在局部细胞尺度（最多15个细胞）的有限成像平面内分析肌动球蛋白装置。在方案的第二部分，我们向用户提供了一个基于Fiji的新插件，该插件可简单地提取卵室周向表面的特定薄层。随后的实验流程进一步描述了如何在组织尺度（&#62;50个细胞）上分析肌动球蛋白信号。最后，我们指出了这些方法在局部细胞尺度和组织尺度上的局限性，并探讨了其未来可能的发展方向与应用前景。

本实验方案使科研人员能够研究上皮组织中肌动球蛋白网络的行为。只有当在局部细胞尺度（数个细胞）对肌动球蛋白行为进行详细分析，并与在组织尺度（大量细胞）进行的类似分析相结合时，才可能实现这一研究。然而，上皮组织通常具有曲面结构，此前难以有效分离出这些组织的薄层，果蝇卵室的研究即为此例（Drosophila egg chambers，图1）。本文提供的实验方案为使用者给出了简明的操作步骤，用于在上述两个尺度上分析肌动球蛋白的行为（图2）。
本方案的第一部分重点介绍如何使用Surface manager插件分析肌动球蛋白脉冲（图3），并描述如何在局部细胞尺度上手动分析单个肌动球蛋白的行为（图...

本方案提供了一种基于Fiji的、用户友好的方法，并附有简明的说明，解释如何可靠地分析单个细胞和弯曲上皮组织中的肌动球蛋白行为。遵循本教程无需编程技能；所有步骤均通过Fiji的图形用户界面及其相关插件以半交互方式进行。

果蝇未成熟卵称为卵室，其结构类似于原始器官，会经历从圆形到……的形态学变化

本方案有助于科学家在单个上皮细胞中分析亚细胞肌动肌球蛋白网络，同时也可在弯曲的上皮组织中进行多细胞尺度的类似分析。本方案是 Fiji 软件应用的一个良好范例，具有直观的图形用户界面，且无需任何脚本编写知识。因此，该方法也十分适用于该领域的初学者。尽管我们的方法是针对果蝇卵室开发的，但也可应用于果蝇上皮以外的体系。我们鼓励科研人员在各自的研究模型中尝试使用我们的实验方案。使用附带的测试文件来熟悉本实验方案。这将帮助您确定本方案的哪一部分适用于您的具体研究问题。本方案的这一部分允许用户在延时成像视频中对上皮细胞进行分割，随后利用表面管理器（Surface Manager）对单个细胞随时间变化的肌动球蛋白脉冲进行分析。首先，打开 Fiji，按照随附的文字方案所述导入宏文件 TissueCellSegmentMovie.ijm。然后，打开一个经过漂白校正的 TIFF 文件，并通过菜单栏依次选择图像（Image）、颜色（Color），再选择拆分通道（Split Channels），将该漂白校正后的文件的通道进行拆分。通过点击已打开脚本中的“运行”图标，将上传的脚本应用于所选延时电影的活性细胞膜通道。为了获得理想的细胞掩膜，将高斯模糊设置为 2.500，细胞检测灵敏度设置为 -1，然后点击“确定”。接着，对于使用 63x 物镜采集的延时电影，将估计的噪声容差设置在 10 到 20 之间，然后点击“确定”。在分析后的延时电影中会出现生成的细胞掩膜，同时会弹出一个名为 ParticleStack 的新窗口，以及一个名为“操作要求”的小窗口。根据延时电影中的细胞掩膜，仅关注位于中央区域的细胞，并选择在整个延时序列中能够提供完整且轮廓清晰的细胞。当中心选定的细胞与真实的细胞膜良好对应时，将 ParticleStack 另存为 TIFF 文件。在 Fiji 中打开相应的 ParticleStack TIFF 文件。在 Fiji 中安装了 Surface Manager 插件后，打开该插件。在表面管理器中，单击“读取轮廓图像”按钮，并将雅卡尔指数设置为 60%。加载轮廓可能需要几分钟时间，具体时长取决于细胞数量。加载完成后，每个细胞将被分配一个 S 编号，并显示在表面管理器窗口的左侧部分。单击选定的 S 编号，以选中来自 ParticleStack1 的已导入细胞轮廓。在延时电影中会出现 tiff。检查每个导入的 S 编号在整个电影中的细胞轮廓质量，并删除显示不正确细胞轮廓的不需要的细胞。要删除不需要的细胞，请突出显示细胞轮廓，然后点击删除按钮。使用画笔工具校正细胞轮廓。完成后，将校正后的细胞保存为 RoiSet.zip 文件。为了确定所分析的组织中是否存在肌动球蛋白脉冲，并了解肌动球蛋白信号的详细行为及其方向性，首先打开 Fiji。打开一个延时成像视频，加载已保存的 ParticleStack1.tiff 细胞掩膜和经过漂白校正的延时成像视频，然后加载 Surface Manager 插件以及来自 RoiSet 的相应感兴趣区域。压缩文件。接下来，在表面管理器中，激活包含感兴趣信号的通道。单击“统计”按钮，打开名为“逐层平均灰度值”的窗口。肌动球蛋白信号的平均值和中位强度将随时间以任意单位显示，同时还会显示与细胞面积和形态相关的其他参数。通过进入统计窗口，点击文件，然后选择“另存为”，将这些数值保存为电子表格文件。类似地，生成细胞掩膜并将其载入表面管理器，以在组织尺度上分析肌动球蛋白脉冲。本实验方案部分允许用户随时间选择性地提取弯曲上皮组织中的一层薄层肌动球蛋白。这些步骤操作简便，基于直观的图形界面。打开 Fiji 软件，并确保已安装 Ellipsoid Surface Projection 插件。然后打开一个延时成像视频，依次点击 Plugins → BigDataViewer，选择 Export Current Image as XML/HDF5 file，将其导出为 XML/HDF5 文件。接下来，在“椭球体表面投影”中打开导出的文件：依次点击插件（Plugins），选择 BigDataViewer，然后点击椭球体表面投影（Ellipsoid Surface Projection），并选择 XML 文件。这将打开一个显示卵室矢状面视图的新窗口，同时会出现一个引导用户完成处理流程的对话框。该名为“卵巢投影”（Ovaries Projection）的对话框包含多个选项卡。在名为“边界框”的第一个对话框选项卡中，定义延时录像中卵室的 x 和 y 边界，以及边界框的 z 轴宽度，然后点击“设置”。卵室被选中的部分将以粉红色高亮显示。接下来，在“卵巢投影”窗口中名为“查找斑点”的对话框选项卡中，定义信号斑点的大小。设定sigma值和最小峰强度值，然后点击“计算”以识别肌动球蛋白信号，这些信号将显示为绿色斑点。请使用不同的参数重复此步骤，直到找到约100个斑点为止。确定肌动球蛋白信号是至关重要的一步。该步骤依赖于信号的质量以及所检测到的斑点的正确大小。如果图像中没有可见的绿色斑点，则下一步将无法进行。为了设计椭球体，请继续选择名为“fit ellipsoid”的选项卡。将随机采样数设置为 10,000，内外截断距离设置为 1 到 10，然后点击计算。完成此操作后，“projection”选项卡将自动打开，并允许定义表面提取。在投影选项卡中，将最小和最大投影距离设置为所需椭球体的宽度。最小和最大投影距离必须合适，以确保粉红色定义的椭球区域包含卵室的整个外层。然后，将切片距离定义为1。在点击计算之前，请确保卵室上已定义的椭球体的粉红色区域可见。这有助于评估新椭球体拟合的质量。接下来，将椭球体的输出宽度设置为大于或等于800，高度设置为大于或等于400。然后，设置表面提取的持续时间，并选择球面或柱面投影。如有需要，翻转Z轴并调整Y轴对齐。点击“计算”按钮，将在名为“image”的新窗口中获得两个通道的表面提取结果。通过点击“图像”，进入“调整”菜单并选择“亮度/对比度”，调节所得图像窗口的亮度和对比度，以便观察投影的肌动球蛋白信号。如果表面提取效果良好，将两个通道分别保存为 TIFF 文件。此外，将日志窗口文件保存下来，以便日后参考该特定卵室表面的提取过程。然后，在 Fiji 中使用首选的颜色编码合并通道，并将结果保存为 TIFF 文件。本方案使科学家能够研究上皮组织中肌动球蛋白网络的行为。只有将局部细胞尺度上对肌动球蛋白行为的详细分析与组织尺度上的类似分析相结合，才可能实现这一目标。图中展示了对照组和fat2突变型果蝇卵室在局部细胞尺度和组织尺度上肌球蛋白II动态行为的代表性示例。在基底单层平面上，对照组卵室中肌球蛋白II的绿色修饰型调节轻链信号沿前后轴垂直方向移动。这种极性在fat2突变型卵室中丧失，导致肌球蛋白II出现各向异性的脉冲和振荡。在组织层面，对照样品中肌球蛋白II的绿色修饰型调节轻链产生同步的收缩力，从而促进上皮层旋转。相比之下，fat2突变型卵室的滤泡上皮在基底侧强烈脉冲，却无法产生促进上皮层旋转所需的同步收缩力。在果蝇卵室的顶端狭窄区域，fat2 突变体也表现出肌球蛋白 II 的绿色修饰型调节轻链的动态行为发生改变。观看本视频后，您应能够较好地掌握如何使用 Fiji 软件在果蝇卵室中对肌动球蛋白网络在局部和组织尺度上进行分析。有关更多实用技巧和故障排除方法，请参见实验方案后的讨论部分。如果您对 Fiji 或我们的插件有任何疑问，请访问相应的网页或与我们联系。

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发育生物学

使用培养的果蝇卵室延时电影对局部细胞和组织尺度的actomyosin动力学的分析

动粒是纺锤体组装检查点（SAC）启动信号、监控姐妹染色单体有丝分裂分离的位点。本文介绍了一种利用徕卡激光扫描共聚焦系统，在Drosophila胚胎中可视化动粒蛋白招募与周转过程，并将其与染色体运动进行协调分析的方法。...

通过展示活细胞中动粒蛋白动态行为与染色体运动研究有丝分裂检查点 果蝇 合胞体胚胎

本文展示了一种利用快速扫描共聚焦显微镜透过蛹壳直接成像细胞行为的方法。通过保持蛹壳完整，该方法能够在果蝇发育的某一难以直接研究的阶段，实现对动态细胞过程的观察与测量。...

透过黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）蛹壳进行成像

本文描述了一种可调节的 离体 Ca成像的实验方案2+ 卵子激活过程中 果蝇.

成像钙离子 果蝇 在卵子激活时

本文展示了如何在活体运动神经末梢上进行单分子光激活定位显微镜成像 黑腹果蝇...

体内 果蝇运动神经突触前末梢的单分子示踪

本文介绍了一种以非侵入性且注重细节的方式记录黑腹果蝇（Drosophila）胚胎肌肉收缩的方法。...

活体成像与肌肉收缩的分析 果蝇 胚胎

本实验方案的目的是将罗丹明标记的球状肌动蛋白注射到Drosophila胚胎中，并在热应激后观察细胞核内肌动蛋白棒状结构的组装过程。...

活细胞热应激下核内肌动蛋白杆状结构的成像 果蝇 胚胎

在 果蝇卵母细胞核在卵子发生过程中会发生微管依赖性迁移。本文介绍了一种通过卵室活体成像来追踪该迁移过程的实验方案...

Drosophila 卵母细胞中的核迁移

在早期 果蝇 胚胎中许多细胞器具有运动性。原则上，可对它们进行活体成像 通过 特异性荧光探针，但卵壳阻碍了其对胚胎的直接应用。本方案描述了如何将此类探针引入胚胎 通过 显微注射，然后分析细胞器的大规模运动 通过...

可视化细胞骨架依赖性脂质囊泡在 Drosophila 胚胎中的运输

用于模拟细胞骨架的（多孔）弹性收缩性肌动球蛋白网络的力学特性

肌球蛋白收缩力在细胞和组织形态发生中起着重要作用。然而，调控肌动球蛋白收缩力具有挑战性 体内 急性地。本方案描述了一种光遗传学系统，可快速抑制由 Rho1 介导的肌动球蛋白收缩力 果蝇 胚胎，揭示肌动球蛋白失活后上皮张力的立即丧失 体内.

光遗传学抑制Rho1介导的肌动球蛋白收缩力并结合上皮张力测量 黑腹果蝇 胚胎

学习使用Fiji软件分析果蝇卵室中单个上皮细胞和弯曲上皮组织的肌动球蛋白动力学。该方案无需编程知识，通过直观的图形用户界面帮助研究人员在细胞和组织尺度上研究细胞力学行为。

利用培养细胞延时成像分析局部细胞与组织尺度下的肌动球蛋白动力学黑腹果蝇卵室

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利用培养细胞延时成像分析局部细胞与组织尺度下的肌动球蛋白动力学 黑腹果蝇 卵室

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