Name: 细胞凋亡逆转后新形成乳腺癌干细胞样细胞的流式细胞仪检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: 学习使用荧光激活细胞分选技术分离凋亡逆转乳腺癌细胞，通过流式细胞术检测非干细胞向肿瘤干细胞样细胞的转化过程。该方法有助于深入理解癌症复发机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作得到了创新科技署创新及科技基金、农业生物技术国家重点实验室（香港中文大学）资助、罗桂祥 biomedical 研究基金以及李和声基金会的资金支持。Y.X. 获得了香港中文大学研究生奖学金的支持。

1. 乳腺非干细胞癌细胞的制备
<ol>
	<li>在100 mm培养皿中，使用10 mL不含酚红的Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基（添加10%热灭活胎牛血清（FBS））培养MCF-7和MDA-MB-231细胞。在100 mm培养皿中，使用10 mL不含酚红的RPMI 1640培养基（添加2 mM L-谷氨酰胺、10%热灭活FBS和1% v/v青霉素-链霉素（PS））培养T47D细胞。将细胞置于37 °C、5% CO2/95%空气的细胞培养箱中培养。 
	注意：酚红会影响基于荧光的检测，同时由于其类雌激素效应，可能对乳腺癌细胞的生长产生潜在影响31。例如，酚红可刺激MCF-7细胞的孕激素受体表达和细胞增殖31，也可能促进T47D细胞的生长31。</li>
	<li>用2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。向MCF-7和MDA-MB-231细胞中加入2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，向T47D细胞中加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA。 
	注意：不同类型的乳腺癌细胞解离所需的胰蛋白酶-EDTA浓度有所不同，不合适的浓度可能影响某些细胞表面标志物（如CD44和CD24）的表达模式32。</li>
	<li>将培养皿置于37 °C、5% CO2/95%空气条件下培养5分钟。频繁在显微镜下观察细胞脱落情况，防止胰蛋白酶-EDTA消化过度。</li>
	<li>当超过90%的细胞脱落时，向培养皿中加入5 mL完全RPMI培养基，并反复吹打细胞层表面数次。</li>
	<li>将细胞转移至15 mL锥形离心管中，在300 × g、4 °C条件下离心5分钟。 
	注意：通常当细胞融合度达到70%时，一个100 mm培养皿可获得约6 × 106个细胞。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1.5 mL微量离心管中的100 μL FACS缓冲液（含0.5% BSA和0.1%叠氮化钠的PBS）中，浓度为106个细胞/100 μL。</li>
	<li>将细胞分装至多个离心管中。对于MCF-7细胞，分为4管：两管用于同型对照，一管用于CD24单染色（作为CD24阳性对照），另一管用于双染色。</li>
	<li>对于T47D细胞，分为3管：两管用于同型对照，一管用于双染色。</li>
	<li>对于MDA-MB-231细胞，分为4管：两管用于同型对照，一管用于CD44单染色（作为CD44阳性对照），另一管用于双染色。</li>
	<li>再次在300 × g、4 °C条件下离心5分钟。弃去上清液，然后加入用FACS缓冲液按1:50稀释的Fc阻断剂。</li>
	<li>将样品置于冰上避光孵育20分钟，随后在300 × g、4 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>在双染色组中，加入分别以1:40和1:10比例稀释于FACS缓冲液中的荧光素偶联抗人CD44（PerCP-Cy5.5）和抗CD24（PE）单克隆抗体。对于阳性对照组，分别以相同浓度向MDA-MB-231细胞中加入抗CD44（PerCP-Cy5.5）抗体，向MCF-7细胞中加入抗CD24（PE）抗体。 
	注意：CD44与CD24的组合已广泛应用于乳腺癌干细胞（CSC）研究26,27,28,29,30。</li>
	<li>在同型对照组中，每106个细胞/100 μL体系中加入1:40稀释的PerCP-Cy5.5标记小鼠IgG2b,κ作为CD44抗体的同型对照，以及1:10稀释的PE标记小鼠IgG2a,κ作为CD24抗体的同型对照。 
	注意：建议使用目标抗体的同型对照作为阴性对照33。</li>
	<li>将样品（步骤1.12和1.13处理后的）在4 °C避光孵育30分钟。在300 × g、4 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用500 μL PBS洗涤沉淀两次，每次在300 × g、4 °C条件下离心5分钟。</li>
	<li>将沉淀重悬于0.5 mL PBS中，并通过40 µm尼龙滤网过滤，随后上样至流式细胞分选仪进行分选。</li>
	<li>为设门和补偿目的，使用PE标记的抗CD24抗体染色MCF-7细胞，使用PerCP-Cy5.5标记的抗CD44抗体染色MDA-MB-231细胞作为阳性对照。使用同型对照染色的细胞作为阴性对照（图1）。</li>
	<li>收集CD44-/CD24+表型的细胞至含有1 mL收集培养基（含20%热灭活FBS和2% v/v PS的不含酚红RPMI 1640培养基）的圆底聚苯乙烯12 × 75 mm试管中。在300 × g条件下室温离心5分钟，弃去上清液。 
	注意：乳腺癌中的类干细胞（CSC-like）被定义为CD44+/CD24-细胞26,27,28,29,30，而乳腺非干细胞样癌细胞被定义为CD44-/CD24+细胞18（图1）。</li>
	<li>将分选后的&#160;乳腺非干细胞样癌细胞接种至含有新鲜收集培养基的培养皿中，在37 °C、5% CO2细胞培养箱中继续培养。&#160;</li>
</ol>
2. 凋亡诱导与检测
<ol>
	<li>在DMSO中配制1 mM的staurosporine12,34。对于处理组MCF-7细胞，向MCF-7细胞的完全培养基中加入25 μL的1 mM staurosporine，用15 mL离心管定容至最终体积10 mL（即终浓度为2.5 μM staurosporine）。用移液器充分混匀。</li>
	<li>吸除细胞培养液，用2 mL PBS洗涤细胞一次。当细胞密度达到70%融合度时，向MCF-7细胞中加入含2.5 μM staurosporine的10 mL培养基，处理6小时以诱导细胞凋亡。</li>
	<li>在DMSO中配制1 mM的paclitaxel35,36。对于处理组T47D细胞，向T47D细胞的完全培养基中加入12.5 μL的1 mM paclitaxel，用15 mL离心管定容至最终体积10 mL（即终浓度为5 μM paclitaxel）。用移液器充分混匀。</li>
	<li>吸除细胞培养液，用2 mL PBS洗涤细胞一次。当细胞密度达到70%融合度时，向T47D细胞中加入含5 μM paclitaxel的10 mL培养基，处理10小时以诱导细胞凋亡。 
	注意：每次首次使用新的细胞系时，应优化诱导细胞凋亡的诱导时间及诱导剂浓度。</li>
	<li>对于溶剂处理的MCF-7组，向MCF-7细胞的完全培养基中加入25 μL无菌二甲基亚砜（DMSO），用15 mL离心管定容至最终体积10 mL（即终浓度为0.25% v/v DMSO）。用移液器充分混匀。</li>
	<li>吸除溶剂处理的MCF-7细胞的培养液，用2 mL PBS洗涤一次。然后加入含0.25% v/v DMSO的10 mL培养基，处理6小时，作为STS的溶剂对照组。</li>
	<li>对于溶剂处理的T47D组，向T47D细胞的完全培养基中加入5 μL无菌DMSO，用15 mL离心管定容至最终体积10 mL（即终浓度为0.05% v/v DMSO）。用移液器充分混匀。</li>
	<li>吸除溶剂处理的T47D细胞的培养液，用2 mL PBS洗涤一次。然后加入含0.05% v/v DMSO的10 mL培养基，处理10小时，作为紫杉醇（paclitaxel）的溶剂对照组。</li>
	<li>为观察处理后细胞的形态学变化，使用50 nM Mitotracker Red CMXRos和250 ng/mL Hoechst 33342对细胞进行染色，并在含5% CO2/95%空气的环境中于37 °C继续孵育20分钟。在60倍共聚焦激光扫描显微镜下观察典型的凋亡细胞形态（图2）。 
	注意：典型的凋亡形态学特征包括细胞皱缩、细胞膜出泡、线粒体断裂以及细胞核浓缩，但细胞膜保持完整12,13,14,15,18,37。</li>
</ol>
3. 凋亡细胞的分离与凋亡逆转步骤
<ol>
	<li>在黑暗条件下，于37 °C、5% CO2/95%空气氛围中，用3 μM Caspase-3/7 Green Detection染料对凋亡诱导剂处理组和溶剂处理组的MCF-7或T47D细胞进行染色，细胞浓度为106/mL。</li>
	<li>在上样分选前，将细胞通过40 µm尼龙滤网过滤。</li>
	<li>用于设门时，首先在点图中以正向散射光和侧向散射光作图，圈选主细胞群（R1），排除碎片（图3）。</li>
	<li>以未处理且未添加Caspase-3/7 Green Detection染料的细胞作为阴性对照，设定阴性区域（R2）（图3A）。</li>
	<li>以经staurosporine12,18,34处理24小时并染色的细胞作为阳性对照，设定阳性区域（R3）（图3B）。</li>
	<li>从诱导剂处理组中收集阳性细胞（R3），置于含有1 mL收集培养基（与步骤1.18中的收集培养基相同）的圆底聚苯乙烯12 x&#160;75 mm试管中（图3C-3D）。在300 × g、室温下离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>从溶剂处理组中收集阴性细胞（R2），置于含1 mL收集培养基的圆底聚苯乙烯12 × 75 mm试管中，操作同步骤3.6（图3E-3F）。 
	注意：可取少量细胞（例如10,000个细胞）重新上机检测，以验证活化caspase标记物的分布模式。若分选后的溶剂处理细胞中超过90%位于caspase阴性区，或分选后的诱导剂处理细胞中超过90%位于caspase阳性区，则认为所收集的细胞纯度较高（图3C-3F）；否则应重新调整分选区域和/或分选仪参数。</li>
	<li>将分选后的细胞重悬于新鲜收集培养基中，接种至12孔组织培养板，在37 °C、5% CO2/95%空气氛围中培养7天，以实现凋亡逆转。</li>
</ol>
4. Caspase 激活后细胞凋亡的确认 细胞 
<ol>
	<li>将10 mM HEPES、140 mM NaCl和2.5 mM CaCl2混合，制备annexin结合缓冲液（pH 7.4）。将缓冲液储存在4 °C，避免暴露于光线下。</li>
	<li>取5 µL的1 mg/mL PI储备液，加入45 µL annexin结合缓冲液中稀释，配制100 µg/mL的碘化丙啶（PI）工作液。将溶液储存在4 °C，避免暴露于光线下。 
	注意：PI为潜在致突变剂，操作时应小心谨慎。</li>
	<li>按照步骤2.1至2.5制备诱导剂处理的细胞。</li>
	<li>通过将培养基反复吹打细胞层3–5次，收集经诱导剂处理的MCF-7或T47D细胞，并转移至15 mL锥形管中。</li>
	<li>在室温下以300 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>在1.5 mL微量离心管中，用完全培养基重悬细胞，使细胞浓度为106/mL，并在37 °C避光条件下加入3 μM Caspase 3/7 Green检测试剂染色30分钟。</li>
	<li>在室温下以300 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用1 mL预冷的PBS洗涤细胞，在4 °C下以300 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>在100 μL annexin结合缓冲液中重悬细胞，向每100 μL细胞悬液中加入5 μL annexin V偶联物和1 µL 100 µg/mL PI工作液，在室温下孵育15分钟。 
	注意：annexin V与PI常联合用于流式细胞术中标记凋亡细胞38,39,40。</li>
	<li>加入400 µL annexin结合缓冲液，轻轻混匀。上机前将样品置于冰上保存。</li>
</ol>
5. 通过流式细胞术检测乳腺癌干细胞样细胞
<ol>
	<li>使用0.05%胰蛋白酶-EDTA收集诱导剂处理组或溶剂处理组的MCF-7细胞。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA收集T47D细胞的诱导剂处理组或溶剂处理组，操作同步骤1.2至1.5。</li>
	<li>使用荧光染料标记的抗人CD44（PerCP-Cy5.5）和CD24（PE）单克隆抗体对细胞进行染色，操作同步骤1.12。同时，制备同型对照，操作同步骤1.13。</li>
	<li>将细胞上流式细胞仪，检测表达CD44+/CD24-标志物的细胞百分比。</li>
</ol>

<ol><li>McGuire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World+Cancer+Report+2014.+Geneva%2C+Switzerland%3A+World+Health+Organization%2C+International+Agency+for+Research+on+Cancer%2C+WHO+Press%2C+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015.</a> Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).</li>
<li>Slamon, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+chemotherapy+plus+a+monoclonal+antibody+against+HER2+for+metastatic+breast+cancer+that+overexpresses+HER2%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2.</a> New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).</li>
<li>Geyer, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lapatinib+plus+capecitabine+for+HER2-positive+advanced+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).</li>
<li>Cameron, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+III+randomized+comparison+of+lapatinib+plus+capecitabine+versus+capecitabine+alone+in+women+with+advanced+breast+cancer+that+has+progressedon+trastuzumab%3A+updatedefficacy+andbiomarker+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).</li>
<li>Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+topoisomerase+poisons+as+antitumor+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs.</a> Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).</li>
<li>Hertel, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+antitumor+activity+of+gemcitabine+%282%27%2C2%27-difluoro-2%27-deoxycytidine%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2',2'-difluoro-2'-deoxycytidine).</a> Cancer Research. 50 (14), 4417-4422 (1990).</li>
<li>Ni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+expression+of+nuclear+factor+kappa+B+%28NF-kappa+B%29+in+multiple+myeloma%3A+downregulation+of+NF-kappa+B+induces+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis.</a> British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).</li>
<li>Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bortezomib%3A+proteasome+inhibition+as+an+effective+anticancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy.</a> Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).</li>
<li>Dumontet, C., Jordan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-binding+agents%3A+a+dynamic+field+of+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics.</a> Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).</li>
<li>Dean, M., Fojo, T., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+stem+cells+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour stem cells and drug resistance.</a> Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).</li>
<li>Pirozzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+cancer+stem+cells%2C+epithelial-mesenchymal+transition+and+circulating+tumor+cells+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer.</a> Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).</li>
<li>Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibility+of+apoptosis+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Reversibility of apoptosis in cancer cells.</a> British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).</li>
<li>Tang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+survival%2C+DNA+damage%2C+and+oncogenic+transformation+after+a+transient+and+reversible+apoptotic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).</li>
<li>Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genistein+promotes+cell+death+of+ethanol-stressed+HeLa+cells+through+the+continuation+of+apoptosis+or+secondary+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis.</a> Cancer Cell International. 13 (1), 63(2013).</li>
<li>Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HepG2+cells+recovered+from+apoptosis+show+altered+drug+responses+and+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatobiliary+%26+Pancreatic+Diseases+International%22%5BJournal%5D)">HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness.</a> Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).</li>
<li>Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+CaspaseTracker+biosensor+system+for+detecting+anastasis+and+non-apoptotic+caspase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity.</a> Scientific Reports. 5, 9015(2015).</li>
<li>Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+tracking+anastasis%2C+a+cell+survival+phenomenon+that+reverses+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
<li>Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+reversal+promotes+cancer+stem+cell-like+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation.</a> Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).</li>
<li>Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+anastasis+in+vivo+by+CaspaseTracker+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).</li>
<li>Li, J., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+in+apoptosis+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Caspases in apoptosis and beyond.</a> Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).</li>
<li>Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+point+of+no+return%3A+mitochondria%2C+caspases%2C+and+the+commitment+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Results+and+Problems+in+Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).</li>
<li>Ricci-Vitiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+human+colon-cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells.</a> Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).</li>
<li>O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+colon+cancer+cell+capable+of+initiating+tumour+growth+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice.</a> Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).</li>
<li>Cioffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+distinct+population+of+CD133%28%2B%29+CXCR4%28%2B%29+cancer+stem+cells+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer.</a> Scientific Reports. 5, 10357(2015).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Ponti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+stem+cells+transition+between+epithelial+and+mesenchymal+states+reflective+of+their+normal+counterparts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts.</a> Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).</li>
<li>Sheridan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44%2B%2FCD24-+breast+cancer+cells+exhibit+enhanced+invasive+properties%3A+an+early+step+necessary+for+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis.</a> Breast Cancer Research. 8 (5), R59(2006).</li>
<li>Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+of+CD24%28-%2Flow%29%2FCD44%2B+breast+cancer-initiating+cells+to+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation.</a> Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).</li>
<li>Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+activity+of+phenol+red%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Estrogenic activity of phenol red.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Different+Cell-Detaching+Methods+on+the+Viability+and+Cell+Surface+Antigen+Expression+of+Synovial+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li>
<li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+flow+cytometry+data%3A+a+guide+for+the+perplexed%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).</li>
<li>Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staurosporine+induces+apoptosis+through+both+caspase-dependent+and+caspase-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms.</a> Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).</li>
<li>Saunders, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel-induced+apoptosis+in+MCF-7+breast-cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells.</a> International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).</li>
<li>Miller, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel-induced+apoptosis+is+BAK-dependent%2C+but+BAX+and+BIM-independent+in+breast+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor.</a> PLoS One. 8 (4), e60685(2013).</li>
<li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+a+review+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: a review of programmed cell death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).</li>
<li>Ng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+voltage-gated+potassium+channels+in+the+fate+determination+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).</li>
<li>Lo, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV3+channel+negatively+regulates+cell+cycle+progression+and+safeguards+the+pluripotency+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).</li>
<li>Talanian, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificities+of+caspase+family+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Substrate specificities of caspase family proteases.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+activity+defines+colon+cancer+stem+cells+and+is+regulated+by+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment.</a> Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).</li>
<li>Shaw, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+mammosphere+assay+protocol+for+the+quantification+of+breast+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).</li>
<li>Desiderio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+fucosylation+has+a+pivotal+role+in+invasive+and+metastatic+properties+of+head+and+neck+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells.</a> Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).</li>
<li>Gupta, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+State+Transitions+Give+Rise+to+Phenotypic+Equilibrium+in+Populations+of+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells.</a> Cell. 146 (4), 633-644 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种直接且清晰的方法，用于检测乳腺非干细胞样癌细胞因凋亡逆转而转变为乳腺肿瘤干细胞（CSC）样细胞的过程。这些逆转细胞的CSC特性可通过以下方法加以验证 i体外乳腺球形成实验 体内 免疫缺陷小鼠异种移植18,24,26,27,42,43,44,45在此，我们使用了两种乳腺癌细胞系，但本方案还可进一步应用于其他乳腺癌细胞系。由于该现象在CD44数量较少的乳腺癌细胞系中表现明显+/CD24- 细胞最初存在的情况下，不建议选...

癌症一直是全球各国的主要死因之一，给世界各国带来了沉重的负担1。在所有类型的癌症中，乳腺癌在女性患者中的发病率和死亡率均位居前列1。由于癌症具有异质性，临床上通常采用多种药物联合化疗，以诱导癌细胞死亡2,3,4。然而，由于常见的化疗药物通常以DNA5,6、蛋白质合成7,8和/或微管动力学9为靶点，因此对快速增殖的细胞影响最大，而对静止期细胞（如癌症干细胞（CSC））的影响通常较小10。因此，CSC在治疗后更有可能存活下来，进而导致耐药性和癌症复发10,11。因此，清除CSC已成为癌症治疗中的一个重要课题，研究CSC的起源也十分必要。
近十年来，关于细胞凋亡逆转现象的研究日益增多12,13,14,15,16,17,18,19。在这一概念出现之前，普遍认为细胞一旦激活caspase，便会不可逆地进入凋亡过程。Caspase是一类蛋白酶家族，在凋亡的启动和执行阶段发挥关键作用，包括凋亡复合物的形成以及下游底物的切割20。执行型caspase（如caspase 3或caspase 7）的激活曾被认为是凋亡的&#34;不可逆点&#34;21。然而，研究人员近期观察到，凋亡逆转既可在体外也可在体内发生, 细胞即使在caspase激活后仍可从凋亡过程中恢复12,13,14,15,16,17,18,19。此外，在逆转的癌细胞中检测到更具侵袭性的特征，例如对原始凋亡诱导剂的抗性增强以及侵袭能力提高15。因此有研究提出，与未经处理的细胞相比，逆转细胞群体中具有干细胞样特性（CSC-like）的细胞比例更高，最终导致凋亡逆转后表现出更恶性的特征18。
此前，人们已进行了大量努力以在体外，更重要的是在体内追踪细胞凋亡的逆转过程，这极大地有助于证实该过程的普遍性16,17,19然而，由于难以有效分离真正发生凋亡逆转的细胞，目前尚缺乏针对逆转细胞后果的系统性研究。因此，迫切需要获得纯化的凋亡细胞并将其恢复，以进行后续研究。为此，我们采用传统上被广泛认可的效应半胱天冬酶（caspase）激活作为凋亡的标志物 &#34;不可逆点&#34;21 用于凋亡检测，并利用荧光激活细胞分选（FACS）区分被Caspase-3/7 Green Detection染料标记的、已激活caspase的细胞。该染料共价连接于一段短氨基酸序列DEVD，可被活化的caspase-3/7识别并切割。切割后染料被释放，从胞质溶胶转移至细胞核，与DNA结合并发出强烈荧光。该方法避免了使用整体细胞群体进行检测时部分细胞可能未发生凋亡所带来的干扰。
CSC 或肿瘤起始细胞已在多种实体瘤中被鉴定出来，通常使用单一或多种细胞表面标志物的组合，且仅需极少量这类细胞即可在免疫缺陷小鼠体内形成肿瘤22,23,24,25,26,27。CD44 与 CD24 的组合在乳腺 CSC 研究中被广泛使用，其中 CD44+/CD24- 细胞被定义为乳腺 CSC26,27,28,29,30。近期，我们开展了一系列实验以验证凋亡逆转与 CSC 之间的假定关系，并证明发生逆转的乳腺癌细胞在体外和体内均表现出更强的成瘤能力，且表达 CSC 标志物的细胞比例显著升高18。尽管我们不能排除乳腺 CSC 在凋亡逆转后存活能力更强因而被富集的可能性，但重要的是，当我们分离非干细胞表型的癌细胞并诱导其发生凋亡逆转时，原本不含干细胞特性的癌细胞群体中出现了 CSC，这表明非干细胞表型的癌细胞可在凋亡逆转过程中转化为 CSC，从而导致 CSC 比例上升。
本文旨在演示乳腺非干细胞样癌细胞在凋亡逆转后向乳腺肿瘤干细胞样细胞的转变，并通过流式细胞术检测这一转变过程。首先通过FACS分离CD44-/CD24+乳腺癌细胞，获得乳腺非干细胞样癌细胞。随后，通过显微镜下观察形态学变化，诱导并确认细胞凋亡的发生。接着，利用Caspase 3/7 Green Detection染料对凋亡细胞进行阳性标记，并通过FACS分离这些凋亡细胞，随后在无凋亡诱导剂的条件下进行培养，以实现凋亡逆转。在恢复培养7天后，对逆转后的细胞进行肿瘤干细胞标志物染色，并进行流式细胞分析。结果显示，在逆转后的细胞群体中重新出现了CD44+/CD24-标志的细胞，提示在凋亡逆转过程中，非干细胞样癌细胞已转变为肿瘤干细胞样细胞。
在多种癌细胞系以及经不同凋亡刺激物处理的正常原代细胞中，均已在体外观察到凋亡逆转现象12,13。该过程也已在体内果蝇（Drosophila）模型中被追踪记录16,17,19。通过使用本文所述技术，可获得大量关于不同癌症疾病模型中癌症复发机制以及肿瘤干细胞（CSCs）起源的信息。

<table><tbody><tr><td>MCF-7</td><td>美国模式培养物集存库 (ATCC)</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>美国模式培养物集存库 (ATCC)</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>T47D</td><td>美国模式培养物集存库 (ATCC)</td><td>HTB-133</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 标记的膜联蛋白 V 偶联物</td><td>Invitrogen</td><td>A35109</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>USB</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent caspase-3/7 绿色荧光染料</td><td>Invitrogen</td><td>C10423</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fc 封闭剂</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td>热灭活</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>USB</td><td>16926</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos</td><td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD24 单克隆抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>555428</td><td>PE 克隆：ML5&lt;br/&gt; 批号：5049759&lt;br/&gt; RRID:AB_395822</td></tr><tr><td>抗人 CD44 单克隆抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>560531</td><td>PERCP-CY5.5 克隆：G44-26&lt;br/&gt; 批号：7230770&lt;br/&gt; RRID:AB_1727485</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>紫杉醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7402</td><td></td></tr><tr><td>PE 小鼠 IgG2a, &amp;kappa; 同型对照</td><td>BD Biosciences</td><td>554648</td><td>克隆：G155-178 (RUO)&lt;br/&gt; RRID:AB_395491</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 小鼠 IgG2b, &amp;kappa; 同型对照</td><td>BD Biosciences</td><td>558304</td><td>克隆：27-35&lt;br/&gt; RRID:AB_647257</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21600010</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11835055</td><td>无酚红</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>星形孢菌素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>12 孔组织培养板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m 尼龙网细胞筛</td><td>BD Biosciences</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>FACSuite 软件套装 v1.0</td><td>BD Biosciences</td><td>651360</td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse</td><td>BD Biosciences</td><td>651155</td><td></td></tr><tr><td>FluoView FV1000 共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td>60X 物镜</td></tr><tr><td>FV10-ASW Viewer 软件 Ver.4.2b</td><td>Olympus</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>圆底聚苯乙烯 12 &amp;times; 75 mm 试管</td><td>BD Biosciences</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>S3e 分选仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1451006</td><td></td></tr></tbody></table>

流式细胞术检测乳腺癌干细胞样细胞在凋亡逆转后的新形成

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

长期以来，肿瘤学家一直在研究癌症复发问题，但其潜在机制仍不明确。近期，我们及其他研究者发现，一种称为凋亡逆转的现象在不同刺激条件下可导致多种细胞模型的致瘤性增强。以往的研究主要集中在体外和体内追踪这一过程；然而，真正发生逆转的细胞尚未被成功分离，这限制了我们对凋亡逆转后果的理解。本文中，我们利用Caspase-3/7绿色检测试剂对凋亡诱导后激活caspase的细胞进行标记，并通过荧光激活细胞分选（FACS）进一步分选出阳性信号细胞用于回收。共聚焦显微镜下的形态学观察有助于在FACS前确认细胞的凋亡状态。致瘤性的增加通常可归因于具有癌干细胞（CSC）样特征的细胞比例上升。此外，鉴于乳腺癌的高度异质性，明确这些CSC样细胞的来源对于癌症治疗至关重要。因此，我们在诱导凋亡前预先制备乳腺非干细胞样癌细胞，随后分离出caspase激活的细胞并实施凋亡逆转操作。流式细胞术分析显示，在发生逆转的细胞群体中重新出现了乳腺CSC样细胞，表明这些CSC样细胞是在凋亡逆转过程中由乳腺非干细胞样癌细胞转化而来。综上所述，本实验方案包括凋亡性乳腺癌细胞的分离，以及通过流式细胞术检测逆转细胞中CSC样细胞比例的变化。

为了观察乳腺非干细胞样癌细胞向乳腺癌干细胞样细胞（CSC）的转变，首先需要对CD44-/CD24+乳腺癌细胞进行分选。对于MCF-7细胞系（其原始细胞群中约有0.15%的细胞表达CSC标志物，图1），该步骤有助于排除在凋亡逆转过程中CSC富集的可能性。相反，若原始细胞群中不存在表达CSC标志物的细胞（如T47D细胞，图1），则可省略此分选步骤。事实上，设门策略会影响各标志物阳性与阴性群体的界定，从而最终影响所确定的CSC比例。因此，应谨慎选择并制备适当的对照，包括目标抗体的同型对照以及各标志物的单染对照，用于设门调整（图1）。
利用乳腺非干细胞样癌细胞，可建立凋亡逆转模型。加入凋亡诱导剂后可观察到典型的形态学变化，撤除药物后细胞应恢...

本文介绍了一种通过荧光激活细胞分选技术分离凋亡乳腺癌细胞的实验方案，并进一步利用流式细胞术检测乳腺非干细胞样癌细胞在凋亡逆转后向乳腺癌干细胞样细胞转变的过程。

癌症复发长期以来一直被肿瘤学家所研究，但其潜在机制仍不明确。最近，我们及其他研究者发现了一种现象……

之前，分离出真正的凋亡逆转细胞群体一直是一个难题，这极大地限制了我们对凋亡逆转后果的理解。本方案使我们能够获得更纯净的凋亡逆转细胞群体。该技术的主要优势在于所使用的材料和设备在不同机构中均广泛可得。该技术可有效分离出更纯净的、经历凋亡逆转的细胞群体。如先前报道所述，正常细胞也可发生凋亡逆转；除乳腺癌细胞外，不同的化疗细胞以及正常细胞均可启动该过程，并可使用多种凋亡刺激因素。由于经历凋亡逆转的细胞已通过凋亡过程并需快速分选，其回收率通常较低。起始细胞数量较大有助于提高最终产量。首先，根据文本方案培养 MCF-7、MDA-MB-231 和 T47D 细胞。随后，用 PBS 洗涤细胞两次，然后向 MCF-7 和 MDA-MB-231 细胞中加入 2 毫升 0.05% 的胰蛋白酶-EDTA，向 T47D 细胞中加入 2 毫升 0.25% 的胰蛋白酶-EDTA。加入T47D细胞中，在含5%二氧化碳的细胞培养箱中，37摄氏度培养5分钟。细胞孵育期间，用显微镜检查细胞脱落情况，以防止胰蛋白酶-EDTA消化过度。当超过90%的细胞脱落时，向培养皿中加入5毫升完全RPMI培养基，用移液器在细胞层表面反复吹打数次。然后将细胞转移至15毫升锥形管中，离心。弃去上清液，用FACS缓冲液在1.5毫升微量离心管中重悬沉淀。然后，将细胞分装到多个离心管中。再次离心各管，并弃去上清液。接着，向样品中加入稀释的Fc阻断剂。将样品置于冰上避光孵育20分钟，然后再次离心样品。之后，弃去上清液。接下来，向双染色组分别加入针对人CD44和CD24的荧光素偶联单克隆抗体，其稀释比例分别为1:40和1:10。对于阳性对照，将 CD44 抗体以 1:40 的稀释比例加入 MDA-MB-231 细胞，将 CD24 抗体以 1:10 的稀释比例加入 MCF-7 细胞。加入 PerCP-Cy5.5 标记的小鼠 IgG2b κ 同型对照抗体，按 1:40 的稀释比例加入细胞，作为 CD44 抗体的同型对照。然后，加入 PE 标记的小鼠 IgG2a κ 同型对照抗体，按 1:10 的稀释比例加入细胞，作为 CD24 抗体的同型对照。将样品置于4°C避光孵育30分钟。然后在4°C条件下以300 ×g离心5分钟。弃去上清液，并用500 µL PBS将沉淀洗涤两次。然后，按照先前所述的方法重复离心步骤。将沉淀重悬于 0.5 毫升 PBS 中，并通过 40 微米尼龙滤网过滤悬液。随后，将悬液上样至荧光激活细胞分选仪进行分选。收集具有 CD44 阴性、CD24 阳性标记的细胞至含有 1 毫升收集培养基的圆底管中。随后离心管内样品，并弃去上清液。接着，将分选后的乳腺非干细胞样癌细胞接种至含有新鲜收集培养基的培养皿中，进行后续培养。首先，使用溶于DMSO的1毫摩尔佛波酯（staurosporine），根据文本方案配制含2.5微摩尔佛波酯的培养基。然后，从细胞中移除培养液。用2毫升PBS洗涤细胞一次，随后向70%融合度的MSF-7细胞中加入10毫升含佛波酯的培养基，诱导细胞凋亡，作用时间为6小时。接下来，用DMSO配制1毫摩尔的紫杉醇溶液。然后，取12.5微升1毫摩尔的紫杉醇加入至T47D细胞的完全培养基中，在15毫升锥形管中定容至最终体积10毫升。移除细胞的培养基，并用2毫升PBS洗涤细胞。然后，当细胞汇合度达到70%时，加入含紫杉醇的培养基处理细胞10小时，以诱导细胞凋亡。随后，移除溶剂处理的MCF-7组中的培养基，并用2毫升PBS洗涤细胞。接着，加入10毫升含0.25% DMSO的培养基，处理6小时，作为星形孢素的溶剂对照。移除经溶剂处理的 T47D 组中的培养基，并用 2 毫升 PBS 洗涤细胞。然后加入 10 毫升含 0.05% DMSO 的培养基，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳培养箱中孵育 10 小时，作为紫杉醇实验的溶剂对照。接着对细胞进行染色，并在 37 摄氏度、5% 二氧化碳培养箱中孵育 20 分钟。使用60倍共聚焦激光扫描显微镜观察处理后细胞的形态学变化。在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中避光孵育30分钟，对凋亡诱导剂处理及溶剂处理的MCF-7和T47D细胞，以及仅溶剂处理的MCF-7和T47D细胞进行染色。使用荧光激活细胞分选仪，从诱导剂处理组中收集阳性细胞至含有1毫升收集培养基的圆底管中。然后，按照先前所述方法离心试管，并弃去上清液。用一毫升收集培养基将溶剂处理组中的阴性细胞收集到圆底试管中。离心试管，弃去上清液。此后，将分选后的细胞重新悬浮于新鲜收集培养基中。将细胞接种至12孔组织培养板中，在含诱导剂和溶剂处理的两组中均培养七天以实现凋亡逆转。使用0.05%的胰蛋白酶-EDTA分别收集两组中发生凋亡逆转的MCF-7细胞。用0.05%的胰蛋白酶-EDTA处理。然后，用0.25%的胰蛋白酶-EDTA分别收集诱导剂处理组和溶剂处理组的T47D细胞。使用荧光染料标记的抗人CD44和CD24单克隆抗体对细胞进行染色。在细胞染色的同时，按照之前的方法制备同型对照。最后，将细胞上流式细胞仪，检测 CD44 阳性且 CD24 阴性标记细胞的百分比。在本实验方案中，观察到了乳腺非干细胞样癌细胞向乳腺肿瘤干细胞样细胞的转变过程。首先在 MCF-7 细胞中进行了非干细胞癌细胞的分离。加入凋亡诱导剂后观察到典型的形态学变化，撤除药物后细胞从凋亡中恢复，并呈现相似的形态。根据荧光强度高于未发生caspase激活的细胞，对caspase激活的细胞进行标记并分选。在诱导凋亡过程中，使用溶剂以排除操作过程或溶剂本身导致细胞转变的可能性。在凋亡诱导剂处理组中，发现半胱天冬酶（caspase）激活的细胞表现为膜联蛋白V（annexin V）阳性而碘化丙啶（PI）阴性，提示这些细胞为凋亡细胞。将这些凋亡细胞收集并进行培养以观察其恢复情况；与溶剂处理组相比，流式细胞术分析显示，在原本为乳腺非干细胞癌细胞群体中，出现了一部分位于CD44阳性、CD24阴性象限的细胞。在流式分析和细胞分选中，控制条件的充分准备至关重要。由于该体外凋亡逆转程序能够分离出纯度较高的凋亡癌细胞，因此可开展诸如体内致瘤性评估等实验，以研究细胞真正逆转后的后果。该技术有助于揭示癌症复发的成因，因而可进一步研究用于潜在预防癌症患者复发的可能性。请务必根据您所在机构的生物安全等级规定，在进行细胞培养实验时做好适当的个人防护。

flow-cytometric-detection-newly-formed-breast-cancer-stem-cell-like

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

细胞凋亡逆转后新形成乳腺癌干细胞样细胞的流式细胞仪检测

在本视频中，我们介绍了使用荧光激活细胞分选仪（FACS）从头颈部鳞状细胞癌细胞系中分离出一群具有癌干细胞样特性的亚群细胞。分离得到的侧群细胞可用于后续的下游分析。...

肿瘤侧群细胞鉴别实验：利用Hoechst染料外排实验分离肿瘤干细胞样细胞的方法

悬浮乳腺球实验可用于研究在悬浮条件下存活并在植入小鼠后表现出增强致瘤能力的具有干细胞特性的乳腺癌细胞亚群。本方案提供了一种便捷的方法 体外 球体形成能力的检测，作为替代指标 体内...

人乳腺癌组织和细胞系的乳腺球形成实验

在过去的十年中，了解癌干细胞样细胞在肿瘤复发和治疗耐药性中的作用已成为备受关注的研究课题。本文描述了从头颈部鳞状细胞癌细胞系（HNSCC）中分离和鉴定癌干细胞样细胞亚群的方法。...

分离与鉴定具有干细胞特性的头颈部鳞状细胞癌亚群

本实验将展示我们如何合成并表征阿司匹林-富马酸前药的抗NFκB及抗肿瘤干细胞活性。...

合成与表征一种抑制NF-κB活性及乳腺癌干细胞的阿司匹林-富马酸前药

用于表征和分离生物样本中干细胞群体的方法，对于推动靶向干细胞的癌症治疗及其他疾病治疗至关重要。本文中，我们提供了一种利用染料触发的侧群表型分离癌干细胞的详细实验方案。...

利用DNA染料诱导的侧群表型从生物样本中检测和纯化肿瘤干细胞

本方案描述了患者来源类球体的生成及后续分析，包括增殖定量、细胞毒性检测、流式细胞术、免疫荧光染色和共聚焦成像，以评估候选药物作为抗肿瘤治疗剂的潜力。该方案有助于精准医疗，可为每位患者及疾病阶段确定特定药物。...

用于靶向肿瘤干细胞的抗肿瘤药物筛选的生理性患者来源三维球体

本方法的目的是通过成球实验，结合功能分析以及流式细胞术和蛋白质印迹法进行表型鉴定，以可靠地鉴定癌细胞系和原代人肿瘤样本中的肿瘤干细胞（CSC）。...

从妇科及乳腺癌肿瘤中获取肿瘤干细胞球

本实验方案描述了从乳腺癌细胞和组织样本中分离乳腺癌干细胞（BCSCs）的方法以及相关步骤 体外 和 体内...

从细胞和组织样本中分离与功能评估人乳腺癌干细胞

细胞凋亡可通过流式细胞术分析早期和晚期凋亡生物标志物来表征。本研究使用台式流式细胞仪，检测经放线菌素D处理后宫颈癌细胞系SiHa的凋亡相关生物标志物。...

放线菌素D处理的SiHa宫颈癌细胞中凋亡生物标志物的流式细胞术分析

我们采用细胞增殖染色法来鉴定斑马鱼T细胞急性淋巴母细胞白血病模型中的静息细胞。该染料在不分裂的细胞中得以保留，而在细胞增殖过程中信号减弱，从而能够筛选出处于静止状态的细胞以进行后续分析。本方案提供了一种功能性工具，用于在细胞静息背景下研究自我更新能力。...

利用细胞增殖染色鉴定斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病模型中的静息细胞

本方案描述了建立乳腺球形成实验的方法，用于研究凋亡抑制因子5（Api5）在非致瘤性乳腺上皮细胞中诱导的癌症干性。收集第一代乳腺球的裂解液，分析多种干性标志物，以评估干细胞样特性的获得情况。...

乳腺球形成实验揭示Api5在非致瘤性乳腺上皮细胞系中诱导的干性特征

学习使用荧光激活细胞分选技术分离凋亡逆转乳腺癌细胞，通过流式细胞术检测非干细胞向肿瘤干细胞样细胞的转化过程。该方法有助于深入理解癌症复发机制。

流式细胞术检测乳腺癌干细胞样细胞在凋亡逆转后的新形成

探索更多视频