建立与艾滋病毒相关的肝脏发病机制的双人性化TK-NOG小鼠模型

该协议提供了一种可靠的方法，建立人类免疫系统和肝细胞的人性化小鼠。通过注射人肝细胞和CD34实现的双重组免疫缺陷小鼠^–造血干细胞易受人体免疫缺陷病毒-1感染和重述肝损伤的影响，如艾滋病毒感染者。

该协议的总体目标是利用人类造血干细胞和肝细胞位点生成具有功能性人类免疫系统和肝脏的人性化小鼠模型。这种方法可以帮助回答遗传性肝人性化小鼠的关键问题。这种方法为研究艾滋病毒在人中观察到的免疫病理学提供了有力的工具。

病理学和微生物学部的主管孙一民和研究技术专家王伟民和埃德德·马卡罗夫将展示这个过程。首先，将肝素管中收集的脐带血转移到无菌层流柜。添加 PBS，直到体积增加到 35 毫升。

将样品层对淋巴细胞分离介质顶部，将样品离心400倍G，在4摄氏度下35分钟，无间断。接下来，小心地移除顶部等离子层，并使用转移移液器将白色薄漆界面转移到新管中。将抛光衣重新悬浮在 30 到 40 毫升的冰冷缓冲液中。

使用移液器，将细胞悬浮液的20微升与20微升0.4%的蓝光混合。将这种混合物的10微升移液插入计数幻灯片的两个腔室的外开口，并将幻灯片插入自动细胞计数器以计算细胞。在300倍G和4摄氏度下将细胞离心10分钟。

小心吸上清液，加入300微升的冰冷缓冲液。加入100微升的人类FC受体阻断试剂和100微升的单克隆小鼠抗人CD34抗体结合微珠，可产生多达1亿个细胞。在4摄氏度下孵育30分钟。

加入10毫升的冰冷缓冲液清洗细胞，并将其离心300倍G和4摄氏度10分钟。小心地去除上清液，并在 500 微升的冰冷缓冲液中重新悬浮颗粒。在此之后，在磁激活细胞分拣场中放置一个正选择LS柱，然后用三毫升的冰冷缓冲液通过。

将样品加载到 LS 柱中，将微珠捕获到样品中与人类 CD34 阳性细胞绑定的微珠，并允许它在重力的影响入收集管。用冰冷缓冲液清洗柱子三次，并在同一收集管中收集洗涤液。然后，用五毫升的冰冷缓冲液将柱子插入一个新的收集管中，将CD34阳性细胞插入。

重复该过程以达到纯度超过90%Next，使用锥蓝染料和血细胞计来计数的CD34阳性细胞。计数后，将300次G的细胞离心5分钟。丢弃上一级，将PBS125微升中的细胞重新悬浮，用于移植。

要检查CD34阳性吸液的纯度，服用50微升悬浮液，并在4摄氏度下用10微升PE结合的PE结合抗人CD34抗体孵育30分钟。在此之后，清洗和重新悬浮PBS中的细胞，然后继续进行流式细胞测量。获取后，分析文本协议中概述的数据。

首先，检索和解冻文本协议中概述的冷冻保留的肝细胞。然后，取下生物帽，将解冻的肝细胞倒入含有加热解冻介质的50毫升锥形管中。用手摇动管子几秒钟，使细胞悬浮。

在100倍G和室温下将细胞取出8分钟。用 0.1% BSA 清洗 PBS 中的颗粒细胞，并在 PBS 中用新鲜或解冻的 HSPCs 将它们混合到每只小鼠 80 微升的最终体积。首先，将无菌延长管的一端连接到 30 量针上，另一端连接到一毫升注射器。

将注射器加注池状 HEP 和 HSPCs 的悬浮液。将注射器放入重复点胶移液器的槽口中，并调整分配器以在每压机中分配 10 微升。按照文本协议中概述的每只小鼠进行剃须，用 10%的 povidone 碘在 70% 异丙醇下擦洗每只小鼠身体的左侧。

使用Vannas型剪刀，在腹膜壁左侧的皮肤、肌肉和腹膜上做一个小切口，进入肋骨笼下边缘下边缘约5毫米的腹腔。找到脾脏，并使用钳子将其稍微拉到操作区域，以便于检修，并将 30 量表针插入脾脏的下极。接下来，解锁点胶移液器的柱塞，一次分配 10 微升的体积，每个脾脏限制为 60 到 80 微升。

缓慢地缩回针头，使用连接贴画夹夹住脾脏。然后，使用湿润的棉尖施用器与无菌 PBS 将脾脏推回体腔。使用中断的缝合图案关闭腹部壁的肌肉层。

使用不可吸收的缝合线，使用中断的缝合图案完成皮肤闭合。将所有所需材料转移到指定的生物安全二级加设施。在使用病毒时，请时刻佩戴个人防护设备，包括一次性防护用品、鞋套、面罩和双手套，包括防割手套。

选择重组超过15%的人类CD45阳性细胞且血清中存在人类白蛋白的小鼠，以治疗HIV-1感染。内向小鼠注射1000至10000个组织培养感染剂量50 HIV-1 ADA，每只小鼠100至200微升。对小鼠实施安乐死后，如文本协议中所述，从每只小鼠身上切除肝脏。

收集和修复肝脏在4%的半成醛过夜。建立具有人类肝脏和免疫细胞的双重人性化小鼠模型，每一步都可以通过非常简单的ELIZA和流式细胞仪来轻松监测。定期进行流细胞学，以评估功能免疫系统的发展，并查看HIV感染对免疫细胞的影响。

在双人性化小鼠中，功能免疫细胞的发育范围为淋巴细胞门的15%至90%。为了评估人类肝细胞的特异性，ELIZA每月在小鼠血清上进行人类特异性白蛋白水平评估。同时与HSPCs和 HEP一起感染的小鼠显示人类特异性白细胞素水平，从每毫升约7微克到每毫升377微克，在观察时间持续增长。

HIV感染对二人化小鼠血液中人体免疫细胞的影响通过流动细胞学和肝脏的 HEP 通过人类特异性白化素 ELIZA 监测。到五个星期，HIV-1会导致血清中人类白蛋白水平下降，双人性化小鼠肝脏部分的人类CK18阳性肝细胞被耗尽。与感染前同一小鼠的血液和肝脏相比，通常观察到CD4与CD8的比例较低。

血液应小心地分层在淋巴细胞分离介质上，以隔离布菲涂层。手术时，轻轻握住脾脏，将针头插入脾脏的下极。在分离造血干细胞后，检查CD34阳性造血干细胞的纯度，以避免CD3阳性细胞和不同供体急性注射肝细胞，这一点至关重要。

由于人类化小鼠表现出人体免疫系统和肝脏的生理方面，可以利用发育中的小鼠研究HIV和物理感染和肝硬化的物理病理发生。