建立双人源化TK-NOG小鼠模型用于研究HIV相关性肝病发病机制

本方案的总体目标是利用人类造血干细胞和肝组织，构建具有功能性人类免疫系统和肝脏的人源化小鼠模型。该方法有助于解答遗传性肝脏人源化小鼠研究中的关键问题。该方法为研究人类中观察到的由HIV引起的免疫病理学提供了强有力的工具。

演示该过程的人员包括病理科和微生物学部门的主管孙一敏（Yimin Sun），以及研究技术员王卫民（Weimin Wang）和爱德华·马卡罗夫（Edwrd Makarov）。首先，将采集在肝素化试管中的脐带血转移至无菌超净工作台。加入 PBS，使体积增加至 35 毫升。

将样品加在淋巴细胞分离液上层，在4°C条件下以400 × g离心35分钟，无刹车。随后，小心移除上层血浆层，并使用移液管将白色的血沉棕黄层界面转移至新试管中。用30至40毫升冰浴缓冲液重悬血沉棕黄层。

用移液器将20微升细胞悬液与20微升0.4%台盼蓝混合。取10微升该混合液加入细胞计数板两个计数室中任意一个的外侧加样口，将计数板插入自动细胞计数仪中进行细胞计数。在4摄氏度条件下，以300 × g离心10分钟。

小心吸除上清液，加入 300 微升预冷缓冲液。每 1 亿个细胞加入 100 微升人 FC 受体阻断试剂和 100 微升与 MicroBeads 偶联的单克隆小鼠抗人 CD34 抗体。在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。

加入 10 毫升预冷缓冲液洗涤细胞，于 4°C 以 300 × g 离心 10 分钟。小心吸去上清液，将沉淀重悬于 500 微升预冷缓冲液中。随后，将 LS 正向选择柱置于磁性激活细胞分选装置中，用 3 毫升预冷缓冲液冲洗柱子。

将样本加入LS柱中，该柱可截留样本中与人CD34阳性细胞结合的MicroBeads，让样本在重力作用下流入收集管。用冰浴缓冲液洗涤柱子三次，并将流出液收集至同一收集管中。随后，用5毫升冰浴缓冲液冲洗柱子，将CD34阳性细胞洗脱至新的收集管中。

重复该步骤，直至纯度超过90%。接下来，使用台盼蓝染色液和血细胞计数板对分离出的CD34阳性细胞进行计数。计数后，以300 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于125 µL PBS中，立即用于移植注射。

为检测 CD34 阳性洗脱液的纯度，取 50 µL 悬液，加入 10 µL PE 标记的抗人 CD34 抗体，在 4°C 下孵育 30 分钟。随后，用 PBS 洗涤细胞并重悬，进行流式细胞术检测。数据采集后，按照文本方案中所述步骤进行分析。

首先，按照文本方案取出并解冻冷冻保存的肝细胞。然后，取下生物盖，将解冻后的肝细胞倒入含有预温解冻培养基的50毫升锥形管中。用手轻轻晃动管子数秒钟，使细胞悬浮均匀。

在室温下以100 × g离心8分钟，沉淀细胞。用含0.1% BSA的PBS洗涤细胞沉淀，并将细胞重悬于PBS中，与新鲜或冻存复苏的HSPCs混合，每只小鼠终体积为80 µL。首先，将一根无菌延长管的一端连接至30号针头，另一端连接至1 mL注射器。

用含有混合HEPs和HSPCs的悬液填充注射器。将注射器安装至重复分配移液器的卡槽中，并调节分配器，使每次按压分配10 µL。按照文本方案所述剃除每只小鼠的毛发，并用10%聚维酮碘擦拭每只小鼠身体左侧，随后用70%异丙醇擦拭。

使用Vannas型剪刀，在腹壁左侧的皮肤、肌肉和腹膜上做一个小切口，切口位置位于肋骨下缘约5毫米处，以进入腹腔。找到脾脏后，用镊子将其轻轻拉至操作区域以便于操作，并将30号针头插入脾脏下极。接着，松开移液器的推杆，每次注入10微升液体，每只脾脏注射总量限制在60至80微升之间。

缓慢撤出针头，使用结扎器以结扎夹夹闭脾脏。然后用浸有无菌PBS的棉签将脾脏推回体腔内。采用间断缝合方式缝合腹壁的肌肉层。

使用不可吸收缝线，采用间断缝合方式完成皮肤闭合。将所有所需材料转移至指定的生物安全二级以上设施。在操作病毒期间，始终穿戴个人防护装备，包括一次性全身防护服、鞋套、口罩和双层手套（含防切割手套）。

选择人源CD45阳性细胞重建率超过15%且血清中存在人白蛋白的小鼠用于HIV-1感染。每只小鼠腹腔注射1,000至10,000个组织培养感染剂量的50型HIV-1 ADA病毒，注射体积为100至200 µL。安乐死后，按照文本方案所述步骤取出每只小鼠的肝脏。

收集肝脏并在4%多聚甲醛中固定过夜。可通过非常简单的ELIZA和流式细胞术分别在每一步轻松监测人源化肝细胞与免疫细胞双人源化小鼠模型的建立情况。通常采用流式细胞术评估功能性免疫系统的发育情况，并观察HIV感染对免疫细胞的影响。

在双人源化小鼠中，功能性免疫细胞的发育水平可占淋巴细胞门控的15%至90%。为评估人肝细胞的移植效果，每月对小鼠血清进行人特异性白蛋白水平的ELIZA检测。同时移植了HSPCs和HEPs的小鼠，在移植一个月时，其人特异性白蛋白水平约为每毫升7微克至每毫升377微克，并在观察期间持续升高。

通过流式细胞术监测HIV感染对双人源化小鼠血液中人免疫细胞的影响，并通过人特异性白蛋白ELISA检测肝脏中HEPs的变化。感染五周后，HIV-1导致双人源化小鼠血清中人白蛋白水平下降，且肝脏组织切片中人CK18阳性肝细胞减少。与感染前同一小鼠的水平相比，HIV感染小鼠的血液和肝脏中CD4与CD8的比值通常降低。

分离血沉棕黄层时，应小心地将血液叠加于淋巴细胞分离液上方。手术过程中，应轻柔地握住脾脏，并将针头插入脾脏下极。在分离造血干细胞后，必须检测CD34阳性造血干细胞的纯度，以避免混入CD3阳性细胞以及不同供体肝细胞的急性注射。

由于人源化小鼠表现出人类免疫系统和肝脏的生理特征，因此所开发的小鼠模型可用于研究艾滋病病毒（HIV）及生理感染和肝硬化的发病机制。