qKAT：杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因的定量半自动分型

该方法可解答有关自然杀伤细胞受体遗传学的关键问题，例如单倍型多样性及其与疾病的关系。对该方法的可视化演示将有助于在您实验室建立该实验方案，包括自动化流程和数据分析。该技术的主要优势在于，与传统方法不同，qKAT（即定量KIR自动化分型）具有高通量特性，并可提供基因拷贝数信息。

qKAT 可为疾病关联性提供深入见解。该技术的应用在诸如 HIV 和丙型肝炎等病毒感染的治疗、癌症、干细胞移植以及妊娠相关疾病中具有重要意义。qKAT 还可用于群体遗传学研究，并探索 KIR 与 HLA 分子之间的表达及功能相互作用。

qKAT 包含10个多重反应，可特异性靶向两个 KIR 基因和一个参考基因的外显子。在本方案中，设计了特异性引物以检测给定基因的等位基因，PCR 扩增产生短的扩增子。随后，使用双标记的特异性水解探针实时监测 PCR 扩增过程。

拷贝数分析采用目标KIR基因相对于参考基因的相对定量。qKAT被设计并设置为一种高通量技术，因此每个反应可处理近1,000个样本。

以下步骤展示了每个96孔DNA板的制备和铺板过程。首先，在对DNA进行定量后，将DNA稀释至96孔深孔板中。应至少包含一个已知拷贝数的对照样本和一个无模板对照样本。

将培养板在450 ×g下离心2分钟。然后，将每个样本以四复孔形式分装至384孔qPCR板中。之后，在室温下的洁净区域将DNA风干24小时。

为10块384孔板设置一个qKAT反应时，首先在4摄氏度下解冻qPCR缓冲液、引物和探针分装样品。然后按照文本方案在冰上配制主混合液。接着使用多通道移液器将主混合液均匀分配至一块96孔深孔板中。

将9.5微升的主混合液加入含有干燥gDNA样本的每个孔中。操作完成后，用铝箔密封板，并立即在4°C下保存。若在多个384孔DNA板上进行主混合液的加样，切记对液体处理系统的针头进行短暂的水洗清洁。

将含有基因组DNA样品的板在450 ×g下离心3分钟。然后，将板置于4摄氏度孵育，以重悬DNA并消除任何气泡。孵育过夜后，重复离心步骤以消除任何气泡。

然后，将微孔板放入冷却的储存区。将qPCR仪连接至微孔板处理仪。接着，根据文本方案对微孔板处理仪进行编程。

运行完成后，让机器人从qPCR仪中取出反应板并放入废弃托架中。扩增完成后，打开qPCR软件。在“导航器”选项卡下，打开该反应板对应的已保存的反应实验文件。

接下来，打开“创建新分析”窗口，为二阶导数最大值法选择适当的设置。然后选择滤光片组合，并确保已选中为 STAT6 收集的数据。选择适当的颜色补偿。

单击“计算”，然后单击“保存文件”。要使用拟合点法（Fit Points method）分析数据，请打开“创建新分析”窗口，并为拟合点法选择适当的设置。然后，为 STAT6 选择正确的滤光片和颜色补偿。

设置噪声带以排除背景噪声。然后，打开分析选项卡，将拟合点设置为三个，并选择显示拟合点。保存更改后，针对 KIR 基因使用适当的拟合点和二阶导数分析设置，重复上述步骤。

在qPCR软件中打开Navigator选项卡，选择“结果批量导出”。然后，打开包含实验文件的文件夹，并将其移至窗口右侧。单击“下一步”，选择导出文件的名称和保存位置。

此后，选择感兴趣的分析类型，然后单击“下一步”。在单击“下一步”以启动导出过程之前，请确保文件名称、导出文件夹以及分析类型均正确无误。当导出状态变为“OK”时，屏幕将自动进入下一步。

确保所有选定的文件均已成功导出，然后单击“完成”。接着，使用文本方案中的脚本将导出的板文件拆分为单个反应，并将文件转换为拷贝数分析软件可读的格式。随后，打开拷贝数分析软件，选择“导入实时 PCR 结果文件”以加载脚本生成的文本文件。

最后，选择“分析”，然后通过选择“最常见样本拷贝数”来执行分析。在本实验方案中，采用半自动分型方法（即qKAT）对KIR基因进行拷贝数分型。KIR2DL4最常见的拷贝数为2个拷贝，而KIR3DS1最常见的拷贝数为0个拷贝。

在进行该实验操作时，必须准确测定DNA的浓度，所有步骤均需在冰上进行，并确保试剂避光。对于不符合已知KIR基因连锁不平衡规律的样本，应对原始数据进行彻底核查。在完成本实验步骤后，可进一步采用其他方法（如测序）来回答更多问题，例如融合基因的存在与否，或新等位基因的鉴定。

该方法建立后，为免疫遗传学领域的研究人员探索KIR在NK细胞生物学、疾病抵抗以及人类生殖中的作用铺平了道路。