Name: qkat: 杀手细胞免疫球蛋白样受体基因的定量半自动分型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 了解qKAT高通量KIR基因分型技术，用于免疫遗传学研究。该方法通过实时PCR和自动化流程实现基因拷贝数定量分析，单次可处理近千份样本，为疾病关联研究提供可靠工具。

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该项目获得了医学研究理事会（MRC）、欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划（资助协议编号：695551）以及美国国立卫生研究院（NIH）剑桥生物医学研究中心和NIH研究血液与移植研究单位（NIHR BTRU）在器官捐献与移植领域，由剑桥大学与英国国家医疗服务系统血液与移植中心（NHSBT）合作开展的支持。文中观点仅代表作者立场，并不代表英国国家医疗服务系统（NHS）、NIHR、卫生部或NHSBT的官方意见。

1. DNA 的制备与涂布
<ol>
	<li>使用分光光度法或荧光法仪器准确测定基因组DNA（gDNA）浓度。</li>
	<li>将DNA稀释至96孔深孔板中，浓度为4 ng/µL。至少包含一个已知拷贝数的gDNA对照样本和一个无模板对照样本。</li>
	<li>将96孔板在450 × g 条件下离心2分钟。</li>
	<li>使用液体处理仪器，将每个样本以四复孔形式分装至384孔qPCR板中，使每孔含有10 ng DNA（2.5 µL/孔）。至少准备十块384孔板，每块用于一个qKAT反应。</li>
	<li>若gDNA来自多个96孔板，每次更换96孔板时，需使用2%次氯酸钠溶液和超纯水对液体处理系统的针头进行全体积清洗。</li>
	<li>将384孔板置于洁净环境中室温孵育至少24小时，使DNA自然风干。</li>
</ol>
2. 引物和探针的制备
注意：qKAT 包含十个多重反应。每个反应包括三对引物和三个荧光标记的探针，可特异性扩增两个 KIR 基因和一个参考基因。Jiang 等人27发表的探针已进行修改，现使用 ATTO 染料标记寡核苷酸，因其具有更高的光稳定性和更长的信号寿命。预分装的引物组合可从商业途径获得（见材料表）。
<ol>
	<li>根据表1中给出的稀释比例，为每个反应配制引物组合。</li>
	<li>根据表1配制每个反应的探针组合。在混合探针前，需先对每种探针单独进行测试。</li>
</ol>
3. 预混液的制备
注意&#160;以下提及的体积适用于在一组10个384孔板上进行一次qKAT反应。 
<ol>
	<li>确保 384 孔板上的基因组 DNA 样品已完全干燥。所有操作均需在冰上进行，并尽可能避免试剂暴露于光照，因为荧光标记的探针对光和热敏感。</li>
	<li>在 4 °C 条件下解冻 qPCR 缓冲液、引物和探针分装样品。</li>
	<li>在冰上配制可满足 10 块 384 孔板使用的预混液，加入 18.86 mL 超纯水、20 mL qPCR 缓冲液、1,000 µL 预先配制的引物混合液以及 180 µL 预先配制的探针混合液（表 2）。</li>
	<li>使用多通道移液器将预混液均匀分配至 96 孔深孔板中，每孔加入 415 µL。将该板置于避光的冰盒中保存。</li>
	<li>使用液体处理仪器，向含有干燥基因组 DNA 的 384 孔板的每个孔中加入 9.5 µL 预混液。用铝箔密封板后立即置于 4 °C 保存。对剩余的板重复此操作，并确保液体处理系统的针头在处理每块板之间用水清洗。</li>
	<li>将 384 孔板在 450 × g 离心 3 分钟，随后在 4 °C 下孵育过夜或 6–12 小时，以充分重悬 DNA 并消除任何气泡。</li>
</ol>
4. qPCR 检测
<ol>
	<li>过夜孵育后，在 450 × g 条件下离心 3 分钟，以消除任何残留的气泡。</li>
	<li>为实现自动化，将 qPCR 仪（例如 LightCycler 480）连接至微孔板处理器（参见材料表）。编程微孔板处理器，使其从避光的低温储存位中取出微孔板并放入 qPCR 仪中。 
	注意&#160;理论上，该检测可在其他具有兼容光学设置的 qPCR 仪上运行。</li>
	<li>使用以下扩增程序：95 °C 预变性 5 分钟，随后进行 40 个循环，每个循环为 95 °C 变性 15 秒，66 °C 退火延伸 50 秒，并在 66 °C 时收集荧光数据。</li>
	<li>运行结束后，让机器人从 qPCR 仪中取出微孔板，并将其放置到废弃位。</li>
</ol>
5. 运行后分析
<ol>
	<li>扩增后，使用qPCR仪器的软件（参见材料表）中的二阶导数最大值法或拟合点法（Fit Points method），按照以下步骤计算定量循环（Cq）值。</li>
	<li>打开qPCR软件，在导航器选项卡中，打开一个反应板的已保存实验文件。</li>
	<li>若使用二阶导数最大值法进行分析，请选择“分析”选项卡，并使用“绝对定量/二阶导数最大值法”创建新分析。
	<ol>
		<li>在创建新分析窗口中，选择分析类型：绝对定量/二阶导数最大值法，子集：所有样本，程序：扩增，名称：Rx-DFO（其中x为反应编号）。</li>
		<li>选择滤光片组合，并选择VIC/HEX/Yellow555 (533-580)，以确保选中STAT6的检测数据。</li>
		<li>对VIC/HEX/Yellow555(533-580)选择颜色补偿，点击计算。对Fam (465-510) 和 Cy5/Cy5.5(618-660) 重复此操作。点击保存文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若使用拟合点法进行分析，请在“分析”选项卡中选择“绝对定量/拟合点法”。
	<ol>
		<li>在创建新分析窗口中，选择分析类型：绝对定量/拟合点法，子集：所有样本，程序：扩增，名称：RxF-DFO（其中x为反应编号）。</li>
		<li>为STAT6及各个KIR基因（Fam/Cy5）选择正确的滤光片和颜色补偿。在噪声带选项卡中，设置噪声带以排除背景噪声。</li>
		<li>在分析选项卡中，将拟合点数设为3，并选择显示拟合点。点击计算，然后点击保存文件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 结果导出
<ol>
	<li>在qPCR软件中，打开Navigator选项卡，选择Results Batch Export。</li>
	<li>打开保存实验文件的文件夹，将文件移至窗口右侧区域，点击Next，选择导出文件的名称和保存位置。</li>
	<li>选择分析类型为Abs Quant/Second Derivative Max method或Abs Quant/Fit Points，点击Next。确认文件名、导出文件夹和分析类型无误后，点击Next以开始导出过程。</li>
	<li>等待直至Export Status显示为Ok，屏幕将自动跳转至下一步。检查所有选定文件均已成功导出，确保失败文件数 = 0，然后点击Done。</li>
	<li>使用脚本split_file.pl和roche2sds.pl将导出的板文件拆分为每块板的单个反应。 
	注意&#160;脚本可通过申请/GitHub获取。</li>
</ol>
7. 拷贝数计算
<ol>
	<li>打开拷贝数分析软件（例如 CopyCaller）。选择导入实时 PCR 结果文件，并加载由roche2sds.pl生成的文本文件。</li>
	<li>选择分析，然后通过选择具有已知拷贝数的校准样本或选择最常见拷贝数来进行分析。有关欧洲血统&#160;人群中通常观察到的KIR基因的最常见拷贝数，请参见表5。</li>
</ol>
8. 数据质量检查
<ol>
	<li>使用 R 脚本 KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215.R 将所有板的拷贝数数据合并到一个电子表格中。 
	注意&#160;脚本可通过申请/GitHub 获取。</li>
	<li>对于不符合已知 KIR 基因连锁不平衡（LD）模式的样本（表 6），需在拷贝数分析软件中重新核查原始数据。</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variation+leads+to+considerable+diversity+for+B+but+not+A+haplotypes+of+the+human+KIR+genes+encoding+NK+cell+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors.</a> Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).</li>
<li>Nemat-Gorgani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+Selected+Mechanisms+Attenuated+the+Inhibitory+Interaction+of+KIR2DL1+with+C2+%2B+HLA-C+in+Two+Indigenous+Human+Populations+in+Southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa.</a> The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).</li>
<li>Norman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-evolution+of+human+leukocyte+antigen+%28HLA%29+class+I+ligands+with+killer-cell+immunoglobulin-like+receptors+%28KIR%29+in+a+genetically+diverse+population+of+sub-Saharan+Africans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans.</a> PLoS Genetics. 9, e1003938(2013).</li>
<li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+%28KIR%29+genes+and+their+HLA-C+ligands+in+a+Ugandan+population%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population.</a> Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).</li>
<li>Bontadini, A., et al. <a target="_blank" href="https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/1479-5876-4-44">Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).</li>
<li>Graef, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR2DS4+is+a+product+of+gene+conversion+with+KIR3DL2+that+introduced+specificity+for+HLA-A%2A11+while+diminishing+avidity+for+HLA-C%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).</li>
<li>Béziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+killer-cell+immunoglobulin-like+receptor+system+at+super-resolution+for+natural+killer+and+T-cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology.</a> Immunology. 150, 248-264 (2017).</li>
<li>Blokhuis, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR2DS5+allotypes+that+recognize+the+C2+epitope+of+HLA-C+are+common+among+Africans+and+absent+from+Europeans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%2C+Inflammation+and+Disease%22%5BJournal%5D)">KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).</li>
<li>Martin, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epistatic+interaction+between+KIR3DS1+and+HLA-B+delays+the+progression+to+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS.</a> Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).</li>
<li>Khakoo, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+and+NK+cell+inhibitory+receptor+genes+in+resolving+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection.</a> Science. 305, 872-874 (2004).</li>
<li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR-ligand+mismatches+are+associated+with+reduced+long-term+graft+survival+in+HLA-compatible+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).</li>
<li>Hiby, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+maternal+killer+-+cell+immunoglobulin-like+receptors+and+parental+HLA+-+C+genotypes+with+recurrent+miscarriage%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).</li>
<li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+KIR+B+centromeric+region+present+in+Africans+but+not+Europeans+protects+pregnant+women+from+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).</li>
<li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+reduces+killer+cell+Ig-like+receptor+expression+level+and+frequency+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model.</a> The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).</li>
<li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+KIR+B+Genotype+Improves+Progression-Free+Survival+of+Non-Hodgkin+Lymphoma+Patients+Receiving+Unrelated+Donor+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).</li>
<li>Cooley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+selection+for+natural+killer+cell+receptor+genes+leads+to+superior+survival+after+unrelated+transplantation+for+acute+myelogenous+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia.</a> Blood. 116, 2411-2419 (2010).</li>
<li>Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR2DS1%2C+2DS5%2C+3DS1+and+KIR2DL5+are+associated+with+the+risk+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+in+Iranians%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Immunology%22%5BJournal%5D)">KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians.</a> Human Immunology. 79, 218-223 (2018).</li>
<li>Vilches, C., Castaño, J., Gómez-Lozano, N., Estefanía, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+KIR+genotyping+by+a+PCR-SSP+method+that+amplifies+short+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments.</a> Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).</li>
<li>Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+duplex+SSP-PCR+typing+method+for+KIR+gene+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling.</a> Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).</li>
<li>Martin, M. P., Carrington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR+locus+polymorphisms%3A+genotyping+and+disease+association+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).</li>
<li>Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+PCR-SSOP+approach+capable+of+defining+the+natural+killer+cell+inhibitory+receptor+%28KIR%29+gene+sequence+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires.</a> Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).</li>
<li>Houtchens, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+genotyping+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry+with+discovery+of+novel+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles.</a> Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1046202301912629">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
<li>Traherne, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR+haplotypes+are+associated+with+late-onset+type+1+diabetes+in+European-American+families%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families.</a> Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).</li>
<li>Hydes, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+genetic+determinants+in+the+outcome+of+HCV+infection%3A+Evidence+for+discrete+immunological+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways.</a> Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).</li>
<li>Dunphy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2DL1%2C+2DL2+and+2DL3+all+contribute+to+KIR+phenotype+variability+on+human+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells.</a> Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qKAT%3A+A+high-throughput+qPCR+method+for+KIR+gene+copy+number+and+haplotype+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination.</a> Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们描述了一种名为qKAT的新型半自动化高通量方法，该方法可实现拷贝数分型 KIR 基因. 该方法是对SSP-PCR等传统方法的改进，后者通量较低，仅能检测这些高度多态性基因的存在或缺失。
所获得拷贝数数据的准确性取决于多个因素，包括基因组DNA（gDNA）样本的质量和浓度均一性以及试剂的质量。整块板上gDNA样本的质量和准确性极为重要，因为板上各孔间浓度的差异可能导致拷贝数计算出现误差。由于这些检测方法是使用源自欧洲的样本集进行验证的，因此来自世界其他地区人群队列的数据需要进行更全面的核查，以确保等位基因扩增失败或引物/探针非特异性结合等情况不会被误判为拷贝数变异。
尽管这些检测方法的设计和优化旨在实现高通量运行，但也可进行调整以检测较少的样本。当分析的样本数量较少时，拷贝数分析软件中的置信度指标会受到影响，但如果在反应板中加入已知KIR基因拷贝数的对照基因组DNA样本，并增加样本的重复次数，则可改善这一情况。
对于没有液体/板处理机器人的实验室，可以使用多通道移液器分配预混液，并手动将板加载到qPCR仪器中。
开发qKAT的主要目的是创建一种简单、高通量、高分辨率且成本效益高的方法，用于进行疾病关联研究中的KIRs基因分型。这一目标已成功实现，因为qKAT已被应用于多项大规模疾病关联研究中，以探讨KIR在多种传染病、自身免疫性疾病以及妊娠相关疾病中的作用4,24,25,26。

在人类中，杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因座位于19号染色体长臂上的白细胞受体复合体（LRC）内。该基因座长度约为150 kb，包含15个头尾相连排列的KIR基因。目前已知的KIR基因座包括KIR2DL1、KIR2DL2/KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1-5、KIR3DL1/KIR3DS1、KIR3DL2-3，以及两个假基因KIR2DP1和KIR3DP1。KIR基因编码具有短（S；激活性）或长（L；抑制性）胞质尾区的二维（2D）和三维（3D）免疫球蛋白样结构域受体，这些受体由自然杀伤（NK）细胞和T细胞亚群表达。KIR基因座内存在的拷贝数变异&#160;形成了基因组成各异的多种单倍型1。非等位基因同源重组（NAHR）被认为是导致单倍型多样性的机制，这种重组由基因紧密的头尾排列方式和高度的序列同源性所促进。全球人群中已报道有超过100种不同的单倍型1,2,3,4。所有这些单倍型可分为两大类：A类和B类单倍型。A类单倍型包含7个KIR基因：KIR3DL3、KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL1和KIR3DL2，这些均为抑制性KIR基因，以及一个激活性KIR基因KIR2DS4。然而，高达70%的欧洲血统个体若为KIR A单倍型纯合子，则仅携带一种无功能的&#34;缺失&#34;形式的KIR2DS45,6。所有其他KIR基因组合构成B类单倍型，其中包括至少一个特定的KIR基因，如KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS5、KIR3DS1、KIR2DL2或KIR2DL5，并且通常包含两个或更多个激活性KIR基因。
HLA I类分子已被确认为某些抑制性受体（KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3和KIR3DL1）、激活性受体（KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS4、KIR2DS5和KIR3DS1）的配体，以及KIR2DL4的配体。其中KIR2DL4是一种独特的KIR，其胞质尾区较长，类似于其他抑制性KIR受体，但在胞外区附近含有一个带正电荷的残基，这是其他激活性KIR受体的共同特征。KIR基因与HLA基因的变异组合影响受体与配体的相互作用，从而在个体水平上塑造自然杀伤（NK）细胞的潜在应答能力7,8。遗传关联研究的证据表明，KIR在抗病毒免疫（例如，人类免疫缺陷病毒[HIV]9和丙型肝炎病毒[HCV]10）、移植成功率11、妊娠障碍风险与生殖成功率12,13、异基因造血干细胞移植（HSCT）后复发的保护作用14,15,16以及癌症风险17中均发挥重要作用。
高度的序列同源性以及等位基因和单倍型的多样性，为准确分型KIR基因带来了挑战。传统的KIR基因分型方法包括序列特异性引物（SSP）聚合酶链式反应（PCR）18,19,20、序列特异性寡核苷酸探针（SSOP）PCR21以及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）22。这些技术的局限性在于，它们仅能提供个体基因型的部分信息，且操作繁琐耗时。近年来，新一代测序（NGS）技术已被专门应用于KIR基因座的分型。尽管该方法功能强大，但运行成本较高，且进行深入分析和数据核查的过程较为耗时。
qKAT 是一种高通量定量 PCR 方法。与传统方法相比，该方法耗时长且操作繁琐，而 qKAT 可在五天内完成近 1,000 个基因组 DNA（gDNA）样本的检测，同时获得 KIR 基因型及基因拷贝数。qKAT 包含十个多重反应，每个反应靶向两个 KIR 位点以及一个基因组中固定拷贝数的参考基因（STAT6），用于 KIR 基因拷贝数的相对定量23。该检测方法已成功应用于涉及大规模人群队列和疾病群体的研究，包括丙型肝炎病毒（HCV）等传染病、1 型糖尿病等自身免疫性疾病以及子痫前期等妊娠相关疾病，同时也为探索自然杀伤细胞（NK 细胞）功能的研究提供了遗传学基础1,4,24,25,26。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸</td><td>Sigma</td><td>定制订购</td><td>序列：见表4</td></tr><tr><td>ATTO染料标记的探针</td><td>Sigma</td><td>定制订购</td><td>序列：见表3</td></tr><tr><td>SensiFAST Probe No-ROX试剂盒</td><td>Bioline</td><td>BIO-86020</td><td>&amp;minus;</td></tr><tr><td>MilliQ水</td><td>&amp;minus;</td><td>&amp;minus;</td><td>&amp;minus;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备摆动转子的离心机</td><td>Eppendorf（或同等产品）</td><td>Eppendorf 5810R 或同等系统</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;或&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit荧光仪</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Matrix Hydra</td><td>Thermo Scientific</td><td>109611</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 II 384孔仪器</td><td>Roche</td><td>05015243001</td><td></td></tr><tr><td>Twister II 微孔板操作仪，配备 M&amp;eacute;Cour 热板堆叠器（M&amp;eacute;Cour）</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>204135</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Biosan</td><td>BS-010201-AAA</td><td></td></tr><tr><td>单通道移液器（体积范围：0.5&amp;ndash;10 &amp;micro;L, 2&amp;ndash;20 &amp;micro;L, 20&amp;ndash;200 &amp;micro;L, 200&amp;ndash;1,000 &amp;micro;L; 1–10 mL）</td><td>Gilson（或同等产品）</td><td>F144801, F123600, F123615, F123602, F161201</td><td></td></tr><tr><td>无RNase和DNase的带滤芯移液器吸头（10 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 1,000 &amp;micro;L, 10 mL）</td><td>Starlab（或同等产品）</td><td>S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001</td><td></td></tr><tr><td>StarTub PS 55 mL 试剂储液槽</td><td>STARLAB</td><td>E2310-1010</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>STARLAB</td><td>E1450-0200</td><td></td></tr><tr><td>96孔深孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>12194162</td><td></td></tr><tr><td>LC480 384孔多孔板</td><td>Roche</td><td>04729749001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 密封箔</td><td>Roche</td><td>04729757001</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roche LightCycler 480 软件 v1.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems CopyCaller 软件 v2.1</td><td></td><td></td><td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html</td></tr><tr><td>KIR 单倍型识别工具</td><td></td><td></td><td>http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/</td></tr></tbody></table>

qkat：杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因的定量半自动分型

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIRs）是一类表达于自然杀伤（NK）细胞和T细胞表面的抑制性和激活性免疫受体，由19号染色体上的一个多态性基因簇编码。其特征最明确的配体是人类白细胞抗原（HLA）分子，后者由6号染色体上的主要组织相容性复合体（MHC）基因座编码。已有大量证据表明，KIRs在免疫、生殖和移植过程中发挥重要作用，因此建立能够准确进行基因分型的技术至关重要。然而，由于KIR基因之间存在高度的序列同源性，以及等位基因多样性和拷贝数变异，设计出能够准确且高效地对所有KIR基因进行基因分型的方法具有较大挑战。传统方法通常在数据分辨率、通量、成本效益以及实验建立和运行所需时间方面存在局限。本文介绍一种称为定量KIR半自动分型（qKAT）的方法，这是一种高通量多重实时聚合酶链式反应技术，可测定KIR基因座中所有基因的拷贝数。qKAT是一种操作简便的高通量方法，能够提供高分辨率的KIR拷贝数数据，进而可用于推断包含这些基因的结构多态性单倍型的变异情况。这些拷贝数和单倍型数据对于大规模疾病关联研究、群体遗传学研究，以及KIR与HLA之间表达和功能相互作用的探索均具有重要价值。

定量杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）半自动分型（qKAT）是一种简单、高通量且经济高效的方法，可用于对KIR基因进行拷贝数分型，从而应用于群体和疾病关联研究。

qKAT：杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因的定量半自动分型

杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIRs）是一类由自然杀伤（NK）细胞和T细胞表达的抑制性和激活性免疫受体，其编码基因为……

该方法可解答有关自然杀伤细胞受体遗传学的关键问题，例如单倍型多样性及其与疾病的关系。对该方法的可视化演示将有助于在您实验室建立该实验方案，包括自动化流程和数据分析。该技术的主要优势在于，与传统方法不同，qKAT（即定量KIR自动化分型）具有高通量特性，并可提供基因拷贝数信息。qKAT 可为疾病关联性提供深入见解。该技术的应用在诸如 HIV 和丙型肝炎等病毒感染的治疗、癌症、干细胞移植以及妊娠相关疾病中具有重要意义。qKAT 还可用于群体遗传学研究，并探索 KIR 与 HLA 分子之间的表达及功能相互作用。qKAT 包含10个多重反应，可特异性靶向两个 KIR 基因和一个参考基因的外显子。在本方案中，设计了特异性引物以检测给定基因的等位基因，PCR 扩增产生短的扩增子。随后，使用双标记的特异性水解探针实时监测 PCR 扩增过程。拷贝数分析采用目标KIR基因相对于参考基因的相对定量。qKAT被设计并设置为一种高通量技术，因此每个反应可处理近1,000个样本。以下步骤展示了每个96孔DNA板的制备和铺板过程。首先，在对DNA进行定量后，将DNA稀释至96孔深孔板中。应至少包含一个已知拷贝数的对照样本和一个无模板对照样本。将培养板在450 ×g下离心2分钟。然后，将每个样本以四复孔形式分装至384孔qPCR板中。之后，在室温下的洁净区域将DNA风干24小时。为10块384孔板设置一个qKAT反应时，首先在4摄氏度下解冻qPCR缓冲液、引物和探针分装样品。然后按照文本方案在冰上配制主混合液。接着使用多通道移液器将主混合液均匀分配至一块96孔深孔板中。将9.5微升的主混合液加入含有干燥gDNA样本的每个孔中。操作完成后，用铝箔密封板，并立即在4°C下保存。若在多个384孔DNA板上进行主混合液的加样，切记对液体处理系统的针头进行短暂的水洗清洁。将含有基因组DNA样品的板在450 ×g下离心3分钟。然后，将板置于4摄氏度孵育，以重悬DNA并消除任何气泡。孵育过夜后，重复离心步骤以消除任何气泡。然后，将微孔板放入冷却的储存区。将qPCR仪连接至微孔板处理仪。接着，根据文本方案对微孔板处理仪进行编程。运行完成后，让机器人从qPCR仪中取出反应板并放入废弃托架中。扩增完成后，打开qPCR软件。在“导航器”选项卡下，打开该反应板对应的已保存的反应实验文件。接下来，打开“创建新分析”窗口，为二阶导数最大值法选择适当的设置。然后选择滤光片组合，并确保已选中为 STAT6 收集的数据。选择适当的颜色补偿。单击“计算”，然后单击“保存文件”。要使用拟合点法（Fit Points method）分析数据，请打开“创建新分析”窗口，并为拟合点法选择适当的设置。然后，为 STAT6 选择正确的滤光片和颜色补偿。设置噪声带以排除背景噪声。然后，打开分析选项卡，将拟合点设置为三个，并选择显示拟合点。保存更改后，针对 KIR 基因使用适当的拟合点和二阶导数分析设置，重复上述步骤。在qPCR软件中打开Navigator选项卡，选择“结果批量导出”。然后，打开包含实验文件的文件夹，并将其移至窗口右侧。单击“下一步”，选择导出文件的名称和保存位置。此后，选择感兴趣的分析类型，然后单击“下一步”。在单击“下一步”以启动导出过程之前，请确保文件名称、导出文件夹以及分析类型均正确无误。当导出状态变为“OK”时，屏幕将自动进入下一步。确保所有选定的文件均已成功导出，然后单击“完成”。接着，使用文本方案中的脚本将导出的板文件拆分为单个反应，并将文件转换为拷贝数分析软件可读的格式。随后，打开拷贝数分析软件，选择“导入实时 PCR 结果文件”以加载脚本生成的文本文件。最后，选择“分析”，然后通过选择“最常见样本拷贝数”来执行分析。在本实验方案中，采用半自动分型方法（即qKAT）对KIR基因进行拷贝数分型。KIR2DL4最常见的拷贝数为2个拷贝，而KIR3DS1最常见的拷贝数为0个拷贝。在进行该实验操作时，必须准确测定DNA的浓度，所有步骤均需在冰上进行，并确保试剂避光。对于不符合已知KIR基因连锁不平衡规律的样本，应对原始数据进行彻底核查。在完成本实验步骤后，可进一步采用其他方法（如测序）来回答更多问题，例如融合基因的存在与否，或新等位基因的鉴定。该方法建立后，为免疫遗传学领域的研究人员探索KIR在NK细胞生物学、疾病抵抗以及人类生殖中的作用铺平了道路。

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科研

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遗传学

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快速 体外 使用荧光成像法评估表达嵌合抗原受体的Jurkat细胞的细胞毒性

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qKAT：杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因的定量半自动分型

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