基于血小板中VASP磷酸化检测血液中一氧化氮的方法

本方案探讨了血小板作为高灵敏度一氧化氮传感器在体外及血液体内环境中的潜在应用。血小板中血管扩张剂刺激的磷酸化蛋白（P-VASP）丝氨酸239位点的磷酸化水平升高可反映一氧化氮的存在，该方法具有一些优势，包括能够检测纳摩尔浓度水平的一氧化氮。从健康供体采集30至50毫升全血后两小时内，将血液以每份5毫升分装至适量的15毫升锥形管中，用于离心处理。

使用塑料移液管小心地从上清液的上层收集富含血小板的血浆。通过第二次离心沉淀富含血小板的血浆，并用 5 毫升 CGS 缓冲液轻轻洗涤沉淀。在室温下以 400 ×g 离心 10 分钟。

离心结束后，将沉淀重悬于3毫升改良Tyrode缓冲液中。使用血细胞计数板进行计数，并用新鲜Tyrode缓冲液将血小板悬液的密度调整至3 × 10⁸ 个细胞/毫升。随后将血小板悬液在37°C孵育1小时。

同时，通过离心收集全血样本中无血小板血浆层的红细胞，并用5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤四次，每次洗涤使用5毫升PBS。最后一次洗涤后，弃去上清液，并将红细胞与富含血小板的血浆按适当的实验血细胞比容混合于带橡胶塞的聚丙烯瓶中，总体积为1毫升。将连接至氦气罐的针头插入每个隔膜中，并插入26号针头作为气体出口。

然后在室温下缓慢摇动瓶子，并使用氧电极仪测量氧分压，以监测脱氧过程。氧气下降速率取决于氦气流速和搅拌速度。因此，在开始实验前应优化脱氧时间，因为该时间高度依赖于实验装置的几何构型。

对于红细胞亚硝酸盐还原反应，使用微量注射器将亚硝酸盐通过隔膜注入去氧的PRP和红细胞样品中，使最终浓度达到10微摩尔。在37摄氏度下孵育样品至少10分钟，然后将每份样品各1毫升转移至微量离心管中进行离心。从上清液的上层部分转移300微升血小板悬液至新的微量离心管中，并以1:9的比例向每管加入酸性柠檬酸葡萄糖溶液。

再次离心血小板，并将沉淀重悬于 80 微升预冷的含有蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液中，每管加入 80 微升。接着，从每个样品中取 15 微克蛋白质，分别加入两块独立的 10% SDS-PAGE 凝胶中。以 120 伏电压电泳 1.3 小时。

电泳结束后，将凝胶转移至单独的硝酸纤维素膜上，并用适量的5%脱脂奶粉封闭非特异性结合位点。将膜在4°C条件下与相应的一抗孵育过夜，随后在室温下与适当的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育45分钟。然后使用成像仪对膜进行曝光，并利用合适的图像分析软件对条带密度进行定量分析。

健康的静脉血样本其氧分压值介于50至80毫米汞柱之间。通过氦气去氧可在10分钟内迅速将氧分压降低至25毫米汞柱。延长去氧时间可进一步降低氧分压。

脱氧程度增加导致溶血水平升高，表现为血浆颜色逐渐变红。这是脱氧本身的作用所致，并非搅拌引起，因为在未通入氦气的搅拌样本中未观察到溶血现象。在脱氧样本中，通过Western blot检测发现，随着血细胞比容的增加，血小板中血管扩张刺激磷蛋白（Vasodilator-Stimulated Phosphoprotein，VASP）及其磷酸化形式（Phosphorylated-VASP）的表达水平均下降。

使用短效一氧化氮供体处理后，10秒内即可观察到血小板中磷酸化血管扩张剂刺激的磷蛋白表达增加。此外，在一氧化氮供体与富血小板血浆孵育后，磷酸化-VASP（P-VASP）水平在10分钟内保持稳定，表明在分离红细胞与血小板的过程中有足够的时间，而不会影响现有的P-VASP水平。在脱氧红细胞存在的情况下，亚硝酸盐也可增加血小板的P-VASP水平。

此处，磷酸化VASP与总VASP的比值取决于血细胞比容水平。VASP在血小板中高表达，并且在存在一氧化氮时会迅速发生磷酸化。因此，本方案提供了一种研究不同生理刺激诱导一氧化氮产生的方法。

通过该方法，我们已成功将血小板中P-VASP水平的升高作为体内吸入亚硝酸盐引起一氧化氮刺激的标志物。请务必注意，在处理血小板等生物样本时，应始终使用适当的个人防护装备。