组蛋白H3和H4蛋白的纯化及细胞与脑组织中乙酰化组蛋白修饰的定量

该方法可对细胞和组织提取物中的核心组蛋白 H3 和 H4 及其翻译后修饰进行精确定量，从而获得高质量且可重复的实验结果。本方法具有三个主要优势。首先，该技术能够保持组蛋白天然的翻译后修饰状态。

其次，该方法避免了成本高昂且通量较低的实验手段。最后，它与下游的中等通量应用完全兼容。演示该实验流程的是我实验室优秀的博士研究生 Karolina Janczura，她对该实验方案进行了全面优化，并运用该技术回答了有关阿尔茨海默病中表观遗传调控的重要科学问题。

按照文本方案，使用适当的细胞培养基将细胞接种于10厘米组织培养处理过的培养皿中。让细胞生长至约90%融合度。当细胞达到所需融合度后，轻轻吸除培养基，并用预热的无血清培养基洗涤细胞两次。

此后，移除细胞中的无血清培养基，将10厘米培养皿置于冰上。向每皿中加入1毫升预冷的裂解缓冲液。用塑料细胞刮刀将细胞收集到裂解缓冲液中，并转移至已标记的1.5毫升离心管中。

然后将离心管置于冰上。如果使用的是冷冻组织，需将组织放入预冷的1.5毫升离心管中，并在冰上短暂解冻。接着，使用推荐体积的裂解缓冲液和建议的研磨次数，用手持式匀浆器对脑组织进行匀浆。

当无可见组织碎片且溶液呈现乳白色时，表明匀浆已完成。此后，使用单通道1,000微升移液器将匀浆液转移至预冷的1.5毫升离心管中，并将离心管置于冰上。将含有细胞裂解物和匀浆后脑组织的离心管置于旋转平台上，在4°C、15 RPM条件下旋转孵育。

此后，在 4 摄氏度下以最大速度离心 10 分钟。接着将上清液转移至一个新的预冷的 1.5 毫升离心管中，并弃去沉淀。然后用 1/4 体积的中和缓冲液对组蛋白进行中和，并通过移液上下吹打混匀。

使用 pH 试纸检测混合物的 pH，并在必要时用中和缓冲液进一步调节 pH。如果在此步骤中酸性组蛋白未被中和，它们将无法正确结合到柱膜上，会穿透柱膜并出现在流穿液中。将 37.5 µL 样品加入 12.5 µL 样品缓冲液中。

短暂离心后，将混合物在99摄氏度下变性10分钟。随后将离心管置于冰上，并短暂离心以收集冷凝液。将样品上样至SDS-PAGE凝胶，以100伏电压电泳运行一小时。

然后将凝胶染色过夜，并经过三次连续洗涤进行脱色。首先向每个离心柱中加入500 µL平衡缓冲液。

将离心柱离心三分钟。弃去穿流液，再重复离心一次。之后向离心柱中加入500 µL样品。

将层析柱离心三分钟并收集流出液。随后按照之前所述方法分析柱子的流出液。向层析柱中加入500 µL洗涤缓冲液。

将离心柱离心三分钟，收集穿流液。将离心柱转移至一个新的已标记的1.5毫升离心管中。向离心柱中加入50微升组蛋白洗脱缓冲液。

离心柱后，收集含有组蛋白的流穿液。在化学通风橱中，向纯化的组蛋白中加入高氯酸，使其终浓度为4%高氯酸。用移液器上下吹打六次以混匀。

如果样品中的组蛋白浓度很高，加入高氯酸后溶液会变得浑浊。随后，将离心管在4°C下孵育24小时。如果过夜的组蛋白沉淀成功，在离心步骤后可在小瓶底部观察到微小的白色沉淀物。

在连续步骤中洗涤沉淀时，确保沉淀不受扰动，因为它容易从离心管底部脱落。次日，将样品在预冷的微量离心管中离心75分钟。小心吸除上清液，并向沉淀样品中加入500 µL冰冻的高氯酸。

将样品在最大速度下离心10分钟后，吸去上清液。加入500 µL预冷的丙酮，注意不要扰动沉淀。随后去除上清液，并将离心管开盖置于冰上干燥30分钟。

然后将离心管从冰上取出，在室温下干燥样品5分钟。待沉淀干燥后，加入30 µL无菌水重悬。盖上管盖，将组蛋白在冰上复溶30至50分钟。

确认沉淀完全重悬后，盖上管盖并将离心管从冰上取出。本实验方案中，从人小胶质细胞 BV-2 细胞中纯化了组蛋白，并分析了提取物的组成。染色凝胶结果显示，提取时间在 15 分钟至 24 小时之间时，粗组蛋白提取物的整体组成未发生明显变化。

通过染色凝胶分析组蛋白与柱基质结合的效率。柱效约为100%，表现为柱流出液中未检测到组蛋白。无论提取时间长短，即

15分钟、2小时或24小时。第一列洗涤去除了提取物中大部分非组蛋白。与15分钟和2小时提取时间相比，24小时提取组的纯化组蛋白组分中含有更多的H3和H4组蛋白。

第一列洗脱的效率约为100%，第二洗脱液中无组蛋白的存在证明了这一点。随后从整只小鼠脑组织中提取了粗制组蛋白，并检测了其翻译后修饰。在广谱作用的HADC抑制剂三丁酸甘油酯处理下，提取物中H4K12乙酰化水平升高。

然而，由于粗提物中存在杂质，抗体的特异性降低。采用经I类和IIb类HDAC抑制剂M344处理的三重转基因阿尔茨海默病小鼠前额叶皮层完成组蛋白纯化流程，并对单一纯化的核心组蛋白组分中H4K12乙酰化水平的变化进行评估。检测到总组蛋白，并观察到M344处理导致H4K12乙酰化水平显著升高。

在进行该实验流程时，重要的是要牢记执行方案中描述的多个检查点，以验证整个过程中组蛋白纯化的成功。完成该流程后，可进一步探讨有关组蛋白磷酸化和甲基化状态的问题。本技术的建立为我们实验室的研究人员分析阿尔茨海默病相关的遗传机制铺平了道路。

然而，它也可用于多种染色质修饰被认为具有重要作用的疾病模型。