Name: 味觉信号蛋白废除对炎症性肠病小鼠肠道炎症的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-09T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 了解味觉信号蛋白废除对DSS诱导的炎症性肠病小鼠模型中肠道炎症的影响。该方法利用基因敲除技术评估免疫反应变化，为研究基因对肠道健康的影响提供框架。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作得到中国国家自然科学基金（81671016、31471008 和 31661143030）、美国国立卫生研究院（DC010012、DC015819）以及思源基金会的资助。

所有涉及小鼠的实验均经过浙江大学机构动物护理和使用委员会的审查和批准。建议在执行本方案前佩戴适当的个人防护装备。
1. 小鼠和DSS的准备
<ol>
	<li>将基因敲除小鼠（α-gustducin-/-）与年龄、性别和体重相匹配的野生型对照小鼠（α-gustducin+/+）C57BL/6 小鼠分别饲养于清洁的笼具中。 
	注：基因敲除小鼠已与 C57BL/6 小鼠回交超过 20 代，具有接近 100% 的 C57BL/6 遗传背景。</li>
	<li>将 30 g 右旋糖酐硫酸钠（DSS）粉末溶于 1 L 经高压灭菌的水中，搅拌至溶液澄清，确保终工作浓度为 3%（w/v）。 
	注：DSS 溶液可在室温下保存最多 1 周，或置于 4 °C 保存至使用。</li>
</ol>
2. 小鼠DSS结肠炎的诱导与评估
<ol>
	<li>称重并记录每只小鼠的初始体重。将小鼠分别放入标准塑料笼中，并对笼子进行标记。</li>
	<li>将普通饮用水替换为3% DSS溶液，持续7天，两组小鼠均可自由饮用（ad libitum）。</li>
	<li>在DSS处理期间，每天测量小鼠体重，记录DSS溶液消耗量，并收集和检查每只小鼠的粪便。观察腹泻和直肠出血的严重程度，并将其转换为DSS诱导的疾病指数12。</li>
	<li>实验过程中，通过计算相对于初始体重的体重下降百分比和疾病指数，评估结肠炎症状。 
	注：疾病指数根据腹泻和直肠出血的观察结果综合评分，定义如下：0分（粪便正常，无出血），1分（软便，无出血），2分（软便，少量出血），3分（极软便，中度出血），4分（水样便，明显出血）12。每天对每只小鼠进行疾病指数分析。</li>
	<li>完成7天DSS处理后，通过颈椎脱臼法处死小鼠，并继续进行后续实验。</li>
</ol>
3. 组织样本的制备
<ol>
	<li>将小鼠置于仰卧位，用70%乙醇清洁腹部皮肤。用一把小剪刀在腹部做一条3 cm长的正中切口，以暴露腹腔。</li>
	<li>使用镊子小心地将脾脏与其他组织分离，然后取出脾脏并测量其大小。</li>
	<li>用镊子识别并提起结肠，将其从周围肠系膜中分离。拉出整个结肠，直至盲肠和直肠可见。</li>
	<li>在结肠-盲肠交界处和盆腔深部切断结肠，分别游离近端和远端结肠，从而分离结肠。然后测量并记录分离后结肠的长度。在解剖过程中注意不要损伤结肠组织。</li>
	<li>用配备灌胃针头的10 mL注射器，以10 mL冰冻磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗结肠，去除粪便和血液，直至流出液完全澄清。</li>
	<li>为进行组织学鉴定，将组织样本均分为三部分：近端、中段和远端。然后用4%多聚甲醛（PFA）在4 °C下固定过夜。</li>
	<li>为分析细胞因子表达，用液氮迅速冷冻整个结肠，并在-80 °C下保存至使用前。</li>
</ol>
4. DSS诱导性结肠炎严重程度的组织学评估
<ol>
	<li>苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色
	<ol>
		<li>固定后，将组织置于含有30%蔗糖的1×PBS溶液中，于15 mL离心管中4°C过夜浸泡，以实现组织的冷冻保护。</li>
		<li>将组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并置于-20 °C环境中，直至OCT完全凝固。</li>
		<li>将含有组织的OCT包埋块转移至冷冻切片机中，设定切片厚度为12 µm，切取并收集厚度为12 µm的冷冻切片。</li>
		<li>将冷冻切片机收集的组织切片置于65 °C加热板上加热20分钟。</li>
		<li>用蒸馏水短暂清洗切片，随后使用苏木精染色液染色5分钟，再用流动自来水冲洗5分钟。</li>
		<li>使用0.5%盐酸-乙醇溶液分化30秒，再用流动自来水冲洗1分钟。然后用1×PBS洗涤1分钟，再用流动自来水冲洗5分钟。</li>
		<li>依次使用70%、75%、80%和95%乙醇对组织切片进行洗涤，每次10秒。随后使用伊红染色液复染2分钟。</li>
		<li>通过95%乙醇及两次更换的无水乙醇进行脱水，每次5分钟。再用两次更换的二甲苯透明，每次5分钟。</li>
		<li>根据上述H&amp;#38;E染色结果，对基因敲除组和野生型组每只小鼠的近端、中段和远端结肠组织损伤程度进行评分。 
		&#8203;注：疾病指数为黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层区域上皮损伤与炎症的综合评分，定义如下：0分（无组织损伤和炎症），1分（局灶性组织损伤和炎症），2分（片状组织损伤和炎症），3分（弥漫性组织损伤和炎症）12,13。每只小鼠分别对结肠近端、中段和远端三个部位进行评分，总分为三项之和。最后计算各组的平均评分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫组织化学14
	<ol>
		<li>将冷冻切片机收集的组织切片置于65 °C加热板上加热20分钟。用1×PBS洗涤切片3次，每次10分钟。加入3%过氧化氢溶液，室温孵育10分钟以灭活内源性过氧化物酶。再用1×PBS洗涤3次。</li>
		<li>弃去PBS，加入含以下免疫细胞类型特异性一抗的溶液：CD45（白细胞）、CD3（T细胞）、B220（B细胞）、CD11b（巨噬细胞）和Ly6G（中性粒细胞）。4 °C孵育过夜。</li>
		<li>吸除组织切片上的一抗溶液，用1×PBS洗涤3次，每次10分钟。加入生物素标记的二抗，室温孵育，随后加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶（streptavidin-HRP）复合物，室温孵育。</li>
		<li>加入3,3'-二氨基联苯胺（DAB）显色液，孵育至出现浅棕色或深棕色显色，以显示免疫反应阳性细胞。</li>
		<li>使用苏木精和0.3%（v/v）稀释氨水对切片进行复染。在显微镜下以10倍物镜采集明场图像。</li>
		<li>使用图像处理软件，通过设置两个掩膜来识别并定量上皮层及固有层（上皮下方）中标记的免疫细胞数量：第一个掩膜基于颜色立方体特征设定颜色检测阈值，用于测量DAB显色阳性区域面积；第二个掩膜用于确定待分析切片中上皮层和固有层的总面积。免疫反应阳性细胞数量以浸润细胞染色面积占待分析组织总面积的比值表示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. DSS诱导结肠炎的基因表达评估
<ol>
	<li>从-80 °C冰箱中取出DSS处理的基因敲除小鼠和野生型小鼠的结肠组织，向25 mg组织中加入0.6 mL裂解缓冲液，然后在匀浆器中进行匀浆。</li>
	<li>按照RNA提取试剂盒的说明书提取总RNA，并使用DNase I去除可能存在的基因组DNA污染。</li>
	<li>使用琼脂糖凝胶电泳检测提取的RNA质量。若28S RNA条带亮度高于18S条带，则RNA可使用。取1 µL RNA样品，用微量分光光度计测定RNA浓度。</li>
	<li>将1 µg总RNA与2.5 µL 20 mM寡核苷酸(dT)混合12,13,14,15,16,17,18 引物和1 µL莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶。在42 °C孵育60分钟以制备cDNA。</li>
	<li>将1 µL cDNA与0.5 µL针对TNF、IFN-γ、IL-5、IL-13、IL-10、TGF-β1以及作为对照的β-Actin的正向和反向qPCR引物混合，并加入2x荧光绿色染料，配制实时PCR反应体系。</li>
	<li>以以下参数进行qPCR扩增：95 °C 预变性10 min，随后进行45个循环，每个循环为95 °C 变性10 s、50 °C 退火25 s、72 °C 延伸20 s。</li>
	<li>使用2−ΔΔCt法计算基因表达的相对定量-ΔΔCt 方法15. 比较分析敲除样本中的基因表达水平 与野生型小鼠</li>
</ol>

<ol><li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Bowel Disease.</a> Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).</li>
<li>Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24510619">Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).</li>
<li>Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Commensal+Microbiota+and+Enteropathogens+in+the+Pathogenesis+of+Inflammatory+Bowel+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases.</a> Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).</li>
<li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li>
<li>Gilbertson, T. A., Khan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+mechanisms+of+oro-gustatory+detection+of+dietary+fat%3A+Advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges.</a> Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%CE%B313+colocalizes+with+gustducin+in+taste+receptor+cells+and+mediates+IP3+responses+to+bitter+denatonium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gγ13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium.</a> Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).</li>
<li>Perez, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).</li>
<li>Shigemura, N., Ninomiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+Molecular+Mechanisms+of+Taste+Signaling+and+Modifying%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).</li>
<li>Bezençon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+intestinal+cells+expressing+Trpm5+are+mostly+brush+cells+and+express+markers+of+neuronal+and+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells.</a> Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).</li>
<li>Lu, P., Zhang, C. -H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraoral+bitter+taste+receptors+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extraoral bitter taste receptors in health and disease.</a> The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).</li>
<li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28569761">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).</li>
<li>Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24510619">Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (25), Unit 15 (2014).</li>
<li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggravated+gut+inflammation+in+mice+lacking+the+taste+signaling+protein+%CE%B1-gustducin%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein α-gustducin.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).</li>
<li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cells+of+the+human+peripheral+taste+system%3A+Dominant+dendritic+cells+and+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), 3678(2012).</li>
<li>Axelsson, L. -G., Landström, E., Goldschmidt, T. J., Grönberg, A., Bylund-Fellenius, A. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran+sulfate+sodium+%28DSS%29+induced+experimental+colitis+in+immunodeficient+mice%3A+Effects+in+CD4%2B-cell+depleted%2C+athymic+and+NK-cell+depleted+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice.</a> Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).</li>
<li>Egger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+Acute+Murine+Dextran+Sodium+Sulphate+Colitis%3A+Cytokine+Profile+and+Dose+Dependency%5BTitle%5D)+AND+%22Digestion%22%5BJournal%5D)">Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency.</a> Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).</li>
<li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Colitis+Modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+%28DSS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> Journal of Visualized Experiments. (35), 1652(2010).</li>
<li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft+cells%2C+taste-chemosensory+cells%2C+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), New York, N.Y. 1329-1333 (2016).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

该方法可用于定量评估特定味觉基因突变在DSS诱导的IBD小鼠模型中对炎症的影响。为充分发挥该方法的优势，IBD的优化诱导是关键步骤。结肠炎的发展受到多种因素影响，包括小鼠品系、饲养环境、肠道微生物群以及目标基因。建议使用少量小鼠进行预实验，以测试不同剂量和持续时间的DSS处理方案。在预实验过程中，应分析并比较实验组与饮用不含DSS水的对照组之间的大体症状，如体重减轻、腹泻、肠道出血，以及一些微观变化，如组织损伤、伴随免疫细胞浸润的炎症反应，以及细胞因子表达水平的变化16,17,18,19。在DSS处理期间，可通过监测小鼠每日体重变化及粪便评分来评估诱导性结肠炎的严重程度。DSS处理结束后，可通过结肠冷冻切片的H&amp;#38;E染色评估组织损伤情况，而免疫细胞浸润和细胞因子表达水平则可通过免疫组织化学和qPCR进行鉴定与定量。可通过调整DSS剂量、给药持续时间及饮食，以揭示味觉基因...

炎症性肠病（IBD）主要有两种形式：克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC），其特征是肠道出现慢性缓解性或进行性炎症，病因具有多因素性1,2。IBD的发生取决于遗传因素以及某些环境因素，如饮食、抗生素使用，尤其是病原体感染。然而，IBD的病因及其调控的分子机制仍不明确。因此，已构建并应用了多种化学诱导的IBD动物模型，用于阐明其发病机制和调控机制，并评估人类治疗手段的有效性3。
味觉受体属于G蛋白偶联受体（GPCRs），可分为两大类：I型（T1Rs）和II型（T2Rs），分别感知甜味、鲜味和苦味物质。味觉信号级联反应由味觉刺激物与T1Rs或T2Rs结合而启动，进而激活由α-味导素（α-gustducin）和Gβγ二聚体组成的异源三聚体G蛋白，导致Gβγ亚基的释放。释放的Gβγ组分继而激活下游效应酶磷脂酶C-β2（PLC-β2）。活化的PLC-β2将磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸水解为两种细胞内第二信使——肌醇-1,4,5-三磷酸（IP3）和二酰甘油，其中IP3与通道型受体IP3R3结合并使其开放，促使钙离子从内质网中释放。最终导致瞬时受体电位离子通道Trpm5的开放，并将神经递质ATP释放至味觉神经上4,5,6,7。然而，咸味和酸味的信号通路与甜味、鲜味及苦味不同，且相互独立8。此外，味觉GPCR及其下游蛋白组分存在于多种口腔外组织中。近期研究表明，作为味觉信号通路主要组分的α-味导素在肠黏膜中亦有表达。尚需进一步研究以明确这些味觉信号组分在口腔外组织中的功能9,10。
本文所述方法用于表征在肠外组织中表达的味觉信号蛋白的功能。我们将一种为解析味蕾中信号级联通路而开发的转基因小鼠品系与化学诱导的结肠炎模型相结合。由于其操作简便且病理特征与人类溃疡性结肠炎高度相似，右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导的炎症性肠病（IBD）模型在多种化学诱导结肠炎模型中应用最为广泛11。在本研究中，我们采用α-味转导蛋白缺陷型小鼠作为代表性小鼠品系，通过以下两种方式揭示α-味转导蛋白在肠道黏膜免疫和炎症中的新功能：1）分析组织形态学变化；2）检测结肠中与炎症相关的细胞因子表达差异。当存在目标基因的基因修饰小鼠品系时，该方法可用于定性和定量评估味觉信号蛋白（以及其他在肠道中表达的蛋白）对组织损伤和肠道炎症的贡献。该方法的优势在于可使研究者获得由化学物质DSS处理与目标基因缺失共同作用所产生的整合数据。该方法还可进一步优化，以提高其灵敏度，并揭示细胞和分子水平上细微的肠道变化。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>550539</td><td></td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>555273</td><td></td></tr><tr><td>B220</td><td>BD Biosciences</td><td>550286</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>BD Biosciences</td><td>550282</td><td></td></tr><tr><td>Ly6G</td><td>BD Biosciences</td><td>551459</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸葡聚糖钠盐（DSS）</td><td>MP Biomedicals</td><td>2160110</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素-HRP 复合物</td><td>BD Pharmingen</td><td>551011</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;E 染色试剂盒</td><td>BBI Life Sciences</td><td>E607318</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sangon Biotech</td><td>B548117</td><td></td></tr><tr><td>FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)</td><td>Roche</td><td>4913850001</td><td></td></tr><tr><td>MMLV 逆转录酶，GPR</td><td>Clontech,TaKaRa</td><td>639574</td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa MiniBEST Universal RNA 提取试剂盒&amp;nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>9767</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 mL 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器与设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>天平</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>剪刀&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR 仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>染色缸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imag-Pro Plus&amp;nbsp;</td><td>Media Cybernetics, Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

味觉信号蛋白缺失对炎症性肠病小鼠模型肠道炎症的影响

Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model

炎症性肠病（IBD）是一类与免疫相关的胃肠道疾病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，影响着全球数百万人的生活质量。IBD 的症状包括腹痛、腹泻和直肠出血，这些症状可能是肠道微生物群、食物成分、肠上皮细胞和免疫细胞之间相互作用的结果。评估在肠上皮细胞和免疫细胞中表达的各个关键基因如何影响结肠炎症具有重要意义。G 蛋白偶联味觉受体，包括 G 蛋白 α 亚基 gustducin 及其他信号蛋白，已在肠道中被发现。本文以 α-gustducin 为代表，描述了一种葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的 IBD 模型，用于评估味觉相关基因突变对肠道黏膜免疫和炎症的影响。该方法结合了基因敲除技术与化学诱导的 IBD 模型，因此可用于评估味觉基因缺失以及其他可能增强或抑制 DSS 诱导结肠免疫反应的基因所产生的效应。将 DSS 给予突变小鼠一定时间，在此期间监测并记录其体重、粪便状况和直肠出血情况。在给药过程中的不同时间点，处死部分小鼠，测量其脾脏和结肠的大小与重量，并采集肠道组织进行组织学和基因表达分析。结果显示，与野生型小鼠相比，α-gustducin 基因敲除小鼠表现出更严重的体重下降、腹泻、肠道出血、组织损伤和炎症。vs. 由于诱导炎症的严重程度受小鼠品系、饲养环境和饮食的影响，在预实验中优化 DSS 浓度和给药持续时间尤为重要。通过调整这些因素，该方法可用于评估抗炎和促炎效应。

通过向α-gustducin基因敲除（KO）小鼠和野生型（WT）小鼠的饮用水中添加3%的DSS，建立DSS诱导的炎症性肠病（IBD）模型。与WT小鼠相比，基因敲除小鼠表现出更严重的结肠炎症状，包括显著的体重下降、腹泻和肠道出血（图1）。在连续7天给予DSS后，采用H&amp;E染色作为组织学方法分析组织完整性，结果显示，与WT小鼠相比，基因敲除小鼠的近端、中段和远端结肠组织损伤更为严重（图2）。此外，过度的免疫激活导致结肠炎，并伴有多种炎性细胞（如巨噬细胞和中性粒细胞）的浸润。通过使用多种免疫细胞标志物进行免疫组织化学分析，以确定α-gustducin缺失是否影响免疫细胞的浸润。比较分析显示，与WT对照组小鼠相比，基因敲除小鼠中白细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的浸润显著增加（图3）。最后，采用特异性基因引物通过qPCR检测DSS诱导结肠炎小鼠结肠组织中部分细胞因子的表达水平。结果表明，与WT小鼠相比...

本文介绍了一种研究味觉相关基因缺失对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的炎症性肠病（IBD）小鼠模型免疫反应影响的实验方案。

炎症性肠病（IBD）是一类免疫相关的胃肠道疾病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，可影响……

该方法有助于解答炎症性肠病领域中关于溃疡性结肠炎和克罗恩病的关键问题。该技术的主要优势在于可用于评估信号蛋白的抗炎和促炎作用。该技术的应用意义在于推动了气体在炎症新进展研究中的探索。尽管该方法可为基因对肠道炎症的影响提供见解，但也可应用于其他因素，如饮食和微生物组。通常，初次接触本学期实验的人员会遇到困难，因为处理疾病瘢痕组织较为复杂。该方法的可视化演示至关重要，因为解剖和组织制备步骤较难掌握，且唾腺及细胞组织结构可能发生改变。为诱导右旋糖酐硫酸钠（DSS）结肠炎，需将普通饮用水替换为3% DSS溶液，并自由饮用，持续7天。每天测量每只小鼠的体重、DSS溶液消耗量以及粪便产生情况。七天治疗结束后，将小鼠置于仰卧位，用小剪刀在腹部做一条三厘米长的正中切口。取出脾脏并测量其大小。然后用镊子提起结肠，使其与周围肠系膜分离。一直分离至盲肠和直肠可见，完整取出整个结肠。在结肠-盲肠交界处横断组织，深入盆腔，分别游离近端和远端结肠。测量并记录分离出的结肠长度。使用装有灌胃针的10毫升注射器，以10毫升冰冻PBS冲洗结肠，去除粪便和血液，直至冲洗液变澄清。为进行组织学鉴定，将组织样本均分为大小相等的近端、中段和远端三部分。将组织在4%多聚甲醛中4摄氏度下固定过夜。对于分离的结肠组织的苏木精和伊红染色，次日早晨将组织块分别放入含有30%蔗糖和PBS的15毫升离心管中，4摄氏度下浸泡过夜，以对样本进行冷冻保护。第二天，将组织包埋于最佳切削温度（OCT）包埋剂中。将组织置于零下20摄氏度冷却，直至OCT包埋剂硬化。将OCT包埋块放入冷冻切片机中，设置切片厚度为12微米。然后切取12微米厚的冷冻切片，并将其收集到玻璃载玻片上。当所有组织切片完成后，在载玻片上于65摄氏度的加热板上孵育20分钟。然后将加热后的切片用蒸馏水短暂清洗，再用苏木精染色液染色5分钟。除去多余的苏木精染色液后，用自来水冲洗5分钟。用含0.5%盐酸的乙醇溶液对切片进行分化，持续30秒，随后用流动的自来水冲洗1分钟。接着，将样品在PBS中洗涤1分钟，再用流动的自来水洗涤5分钟。洗涤结束后，将组织浸入梯度递增的乙醇溶液中，每次浸入持续10秒。随后用伊红复染两分钟。样品脱水时，将载玻片依次浸入95%乙醇以及两次100%乙醇中，每次浸入持续五分钟。随后用二甲苯更换两次，每次五分钟进行透明处理。然后对每组实验动物近端、中段和远端结肠的组织损伤进行评分。进行免疫组织化学分析时，将切片在加热板上温育20分钟，然后在PBS中洗涤三次，每次10分钟。使用3%过氧化氢孵育10分钟以消除内源性过氧化物酶活性。孵育结束后，用PBS如上所示洗涤样本三次，并在室温下用封闭缓冲液封闭非特异性结合位点，封闭时间至少为1小时。随后，将封闭缓冲液替换为感兴趣的初级抗体混合液。在 4 摄氏度下孵育过夜。次日早晨，吸去多余的初级抗体溶液，并用 PBS

effects-taste-signaling-protein-abolishment-on-gut-inflammation-an

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

味觉信号蛋白废除对炎症性肠病小鼠肠道炎症的影响

炎症性肠病的实验模型使我们能够研究与发病机制相关的复杂先天性和适应性免疫反应。通过组织学评分、促炎细胞因子的定量分析以及髓过氧化物酶活性的检测，可以开始评估炎症性肠病中所见的这些免疫反应。...

研究DSS诱导的IBD模型中的肠道炎症

本视频展示了一种通过化学诱导建立小鼠结肠炎模型的技术——结肠炎是一种炎症性肠病。让小鼠饮用右旋糖酐硫酸钠（DSS）溶液足够时间。摄入后，DSS会破坏结肠中的黏液层和上皮屏障，使肠道微生物进入下方组织，被局部免疫细胞识别，从而引发过度的免疫反应，导致炎症发生。...

一种建立右旋糖酐硫酸钠诱导小鼠结肠炎模型的技术

本视频展示了化学诱导性结肠炎的评估方法 通过...

通过结肠组织切片的免疫组织化学分析评估化学诱导性结肠炎

DNBS/TNBS 诱导的结肠炎为研究炎症性肠病的发病机制提供了一种替代且经济的方法。本文讨论的实验方案概述了成功应用 DNBS...

DNBS/TNBS 结肠炎模型：揭示炎症性肠病及膳食脂肪影响

本文介绍了一种通过将同基因型CD4+CD45RBhigh...

通过将效应性CD4+CD45RBhigh T细胞过继转移至免疫缺陷小鼠诱导小鼠肠道炎症

本文详细描述了在小鼠中进行结肠镜引导下钳取活检并实时追踪伤口闭合过程的操作步骤。此外，还提供了用于对伤口床进行组织学、免疫组织化学及分子学分析的组织制备方法。...

在小鼠中进行结肠镜引导下的钳取活检及后续组织变化评估

使用免费的计算机辅助系统对肠道炎症进行系统性评分，是定量比较以溃疡和炎症性改变为特征的结肠炎模型中组织病理学变化的有力工具。组织学结肠炎评分评估可加强临床观察结果，并有助于数据解读。...

小鼠葡聚糖硫酸钠诱导结肠炎模型中肠道炎症的系统性评分分析

本方案描述了一种针对肠道微生物群抗原特异性T细胞的过继转移结肠炎模型。从CBir1 TCR转基因小鼠中分离CD4+...

通过将CBir1 TCR转基因CD4+ T细胞过继转移至免疫缺陷小鼠诱导肠道炎症

炎症性肠病（IBD）的发病机制涉及遗传易感性、黏膜免疫和肠道微生态环境之间的相互作用。在本研究中，我们将粪菌移植应用于IL-10缺陷小鼠，并探讨其对结肠炎症和心脏功能的影响。...

白细胞介素10缺陷小鼠模型中粪菌移植的治疗效果评估

本方案描述了建立 pouchitis 大鼠模型的方法。通过采用显微外科技术进行回肠储袋-肛管吻合术（IPAA）手术，构建回肠储袋模型。术后，大鼠接受 4% 硫酸葡聚糖钠（DSS）处理，持续 4...

使用硫酸葡聚糖建立大鼠直肠结肠切除及回肠储袋-肛管吻合术后储袋炎模型

了解味觉信号蛋白废除对DSS诱导的炎症性肠病小鼠模型中肠道炎症的影响。该方法利用基因敲除技术评估免疫反应变化，为研究基因对肠道健康的影响提供框架。

味觉信号蛋白缺失对炎症性肠病小鼠模型肠道炎症的影响

探索更多视频