Name: 微流控法评价人诱导的多能干细胞内皮细胞 (hipsc-ec) 对白细胞粘附的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 学习使用微流控技术评估人诱导多能干细胞来源内皮细胞（hiPSC-ECs）的炎症反应及白细胞粘附特性。该方法结合活细胞成像与CellProfiler软件定量分析，为血管生物学研究提供可靠的实时检测手段。

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作者谨此致谢以下资助项目：欧洲研究理事会（ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC）；荷兰器官芯片倡议项目，该计划为荷兰科学研究组织（NWO）引力计划，由荷兰政府教育、文化与科学部资助（024.003.001）。

1. 溶液与试剂的配制
<ol>
	<li>向人内皮细胞-SFM基础培养基中加入无血小板血浆来源血清（1%）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，20 ng/mL）和血管内皮生长因子（VEGF，50 ng/mL），配制完全人内皮细胞-SFM培养基（EC-SFM FULL）（参见材料表）。用0.22 µm孔径滤器过滤培养基，于4 °C保存，最长可保存2周。</li>
	<li>向RPMI培养基中加入胎牛血清（10%）、2-巯基乙醇（0.05 nM）、L-谷氨酰胺（1%）和青霉素-链霉素溶液（25 U/mL），配制完全RPMI培养基（参见材料表）。于4 °C保存，最长可保存3周。</li>
</ol>
2. 微流控芯片的包被
<ol>
	<li>将无菌生物芯片放入一个10 cm的无菌培养皿中。</li>
	<li>用不含Ca2+/Mg2+的磷酸盐缓冲液（PBS）将储备液稀释，配制终浓度为50 µg/mL的纤连蛋白工作液。每片生物芯片预计使用80 µL工作液。</li>
	<li>向生物芯片的每个通道中注入10 µL纤连蛋白工作液。使用带有小型10 µL吸头的移液器，并确保移液器吸头与通道入口之间形成紧密接触（图1C，左图）。</li>
	<li>盖上装有生物芯片的培养皿盖子，并将其放入湿化室中（图2B）。将湿化室置于4 °C过夜。为保持湿化室湿度，可在其底部放置一张洁净的纸巾，并加入5 mL无菌H2O。</li>
	<li>次日，在进行实验前，将生物芯片置于37 °C培养箱中预热。</li>
</ol>
3. hiPSC-ECs 的制备
注意：在本方案中，hiPSC-ECs 的分化、纯化、冷冻保存和复苏均按先前所述方法进行8。
<ol>
	<li>在检测前3至4天，将hiPSC-ECs解冻并接种于一个经0.1%明胶包被的T75培养瓶中，使用完全EC-SFM FULL培养基。</li>
	<li>检测前一晚，通过向EC-SFM FULL培养基中添加10 ng/mL TNFα对hiPSC-ECs进行刺激，并于37 °C孵育过夜（约12小时），具体操作如前所述7。</li>
</ol>
4. hiPSC-ECs 的解离及接种至微流控芯片
<ol>
	<li>在检测当天，从培养箱中取出装有hiPSC-ECs的培养瓶，在显微镜下观察细胞。确保hiPSC-ECs融合度达到80–100%，并具有典型的内皮细胞样形态。</li>
	<li>将培养瓶转移至细胞培养超净台中。</li>
	<li>吸除hiPSC-ECs培养瓶中的培养基。</li>
	<li>加入10 mL不含Ca2+/Mg2+的PBS短暂洗涤细胞培养层，随后吸除PBS。</li>
	<li>每瓶加入4 mL 1×解离酶溶液，在室温（RT）下孵育5分钟（图1B）。</li>
	<li>每瓶加入8 mL人内皮细胞-SFM培养基以终止解离反应。使用5 mL移液器轻柔吹打并收集hiPSC-ECs悬液至15 mL锥形离心管中。</li>
	<li>计数悬液中的总细胞数量。</li>
	<li>在室温下以300 × g 离心3分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于EC-SFM FULL培养基中，调整终浓度为1.5 × 107 个细胞/mL。</li>
	<li>从培养箱中取出装有生物芯片的培养皿，转移至细胞培养超净台中。</li>
	<li>吸除微流控芯片各通道中的纤连蛋白溶液。</li>
	<li>使用带有小型10 µL吸头的移液器，向每个通道注入6 µL细胞悬液（图1C，中图）。注液前确保细胞悬液充分混匀，并避免细胞沉淀。</li>
	<li>在显微镜下观察生物芯片，确认细胞分布均匀且细胞密度较高（图2C）。</li>
	<li>将生物芯片在37 °C下孵育15分钟。</li>
	<li>从每个通道两侧的培养基储液池中各加入40 µL EC-SFM FULL培养基。</li>
	<li>将生物芯片在37 °C下孵育1小时（图1C，右图）。</li>
	<li>再次从每个通道两侧的储液池中各加入50 µL EC-SFM FULL培养基。</li>
</ol>
5. 人白细胞的制备
注意： 本方案中使用了一种 commercially available 单核细胞系（THP-1）。也可选用外周血单个核细胞或中性粒细胞。外周血单核细胞和中性粒细胞的分离可采用标准方法11。本段所述所有步骤均须在细胞培养生物安全柜中进行。
<ol>
	<li>将白细胞收集到一个50 mL的锥形管中。</li>
	<li>用10 mL不含Ca2+/Mg2+的PBS洗涤白细胞。在室温下以300 × g离心3分钟（图1D）。</li>
	<li>吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于1 mL含有DiOC6染料（λex = 485 nm，λem = 501 nm）的PBS中（稀释比例为1:5,000）。在室温下避光孵育10分钟。</li>
	<li>用10 mL不含Ca2+/Mg2+的PBS再次洗涤白细胞。在室温下以300 × g离心3分钟。重复洗涤步骤一次。</li>
	<li>计数悬液中细胞的总数。</li>
	<li>吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于完全RPMI培养基中，调整细胞终浓度为2.5 × 106 个细胞/mL。</li>
</ol>
6. 微流控泵的制备
<ol>
	<li>将微流控泵与8通道歧管组装。</li>
	<li>使用已安装操作软件的计算机连接泵。</li>
	<li>启动微流控软件，点击打开方案加载方案，并在计算机中导航选择微流控方案。</li>
	<li>通过选择设置文件夹并点击运行检测步骤，连接软件与泵。</li>
	<li>定义通道几何结构以实现精确的流速控制：在几何结构设置文件夹中选择更新几何结构，然后点击运行检测步骤。 
	注意：确保几何参数与所使用的注射器和通道匹配（几何ID = 1，通道数量 = 8，通道宽度 = 800.0 µm，通道深度 = 120.0 µm，注射器体积 = 250 µL），以及样品的粘度（液体粘度 = 1.0）。</li>
	<li>将进液管（橙色）放入含有80%乙醇的50 mL锥形管中，对泵进行清洗；将出液管（绿色）放入另一个50 mL空锥形管中（废液容器）。</li>
	<li>选择冲洗/泵冲洗文件夹并点击运行检测步骤（冲洗体积 = 2000 µL，冲洗步进体积 = 250 µL，冲洗方向 = 输出）。重复该清洗步骤一次。</li>
	<li>使用细胞培养级水和人内皮细胞-SFM培养基重复执行泵的清洗步骤（步骤6.6–6.7）。</li>
	<li>继续进行歧管的清洗步骤。</li>
	<li>通过将三通接头置于正确位置（指示关闭朝向左侧），手动打开注射器与歧管之间的阀门。</li>
	<li>在冲洗/歧管清洗文件夹中选择设置当前通道/打开步骤，并点击运行检测步骤，以打开歧管的所有阀门。</li>
	<li>手动清洗歧管：从注射器中推入5 mL 80%乙醇，随后推入5 mL细胞培养级水。</li>
	<li>从注射器中推入5 mL人内皮细胞-SFM培养基，清洗歧管。</li>
	<li>清除歧管中滞留的所有大气泡。为此，将8孔针适配器插入含有培养基的10 cm培养皿中，通过反复推动和抽拉注射器，直至所有大气泡消失（小气泡无影响）。</li>
	<li>在冲洗/歧管清洗文件夹中选择设置当前通道/关闭步骤，并点击运行检测步骤，以关闭歧管的所有阀门。</li>
	<li>将泵的绿色出液管连接至歧管适配器。</li>
	<li>将三通阀恢复至关闭位置，以关闭注射器。</li>
	<li>选择冲洗/管路冲洗文件夹并点击运行检测步骤，使用RPMI培养基单独清洗每个端口，确保每根管路中的气泡均被清除（分配体积 = 100 µL）。 
	注意：歧管的每个阀门依次逐个打开（1至8），每次仅一个通道开放，向该通道分配100 μL培养基，其余通道保持关闭。请确认液体从每个针孔流出；若无液体流出，表明可能存在气泡或堵塞。</li>
</ol>
7. 活体成像用微流控芯片的制备
<ol>
	<li>确保微流控装置已准备就绪，活细胞成像室已预平衡至 37 °C，且 CO2 浓度达到 5%（图 3A，B）。</li>
	<li>从培养箱中取出生物芯片，将其放置在显微镜芯片支架中，并将支架安装到显微镜成像台上（图 3C）。</li>
	<li>为通过流体控制板将生物芯片连接至泵，请将 8 针适配器靠近芯片的出口储液池，并将所有针头插入培养基中（但暂不完全连接）。</li>
	<li>选择 洗脱 | 连接至芯片 文件夹，点击 运行检测步骤，在连接芯片前先分配 30 mL RPMI 培养基。培养基分配完成后，将 8 针适配器插入生物芯片的出口。 
	注意： 此步骤期间，所有通道均设置为 开启（打开），每条通道分别分配 30 µL 培养基，随后通道设置为 关闭（关闭）。此操作可确保无气泡进入微流控芯片的通道中。</li>
	<li>使用移液器手动从生物芯片的所有入口储液池中吸出培养基。</li>
	<li>选择 洗脱 | 芯片洗脱 文件夹，点击 运行检测步骤，依次对每条通道灌注 40 μL EC-SFM FULL 培养基，以清除通道中的死细胞或碎片（洗脱体积 = 40 µL，最大洗脱剪切力 = 40 dynes/cm2）。</li>
</ol>
8. 流动黏附实验与图像采集
<ol>
	<li>使用移液器手动从目标通道的入口储液池中吸出培养基。</li>
	<li>将步骤 5.6 中获得的 100 µL 白细胞加入目标通道的入口储液池中。 
	注意： 轻柔混匀细胞，制成单细胞悬液。</li>
	<li>在 Cell Assay | Step Description 文件夹中，选择 Set Current Channel/Step Description，然后在通道列表中仅选择当前感兴趣的目标通道，并将其设置为 On（开启），其余七个通道均设置为 Off（关闭）。</li>
	<li>选择 Cell Assay | Step Description 文件夹，然后点击 Run Assay Step。 
	注意： 确保 Variable Flow Rate Dispensing 施加恒定的负压，以将白细胞悬液从入口储液池经通道抽吸 5 分钟（剪切模式 = 恒定，剪切应力 = -0.5 dyne/cm2，持续时间 = 00:05:00，扫描延迟 = 00:00:00）。剪切应力的负值可确保流动方向正确。</li>
	<li>从入口储液池中吸出残留的白细胞悬液。</li>
	<li>向入口储液池中加入 100 µL 完全 RPMI 培养基。选择 Cell Assay/Step description 文件夹并点击 Run Assay Step，以 RPMI 培养基灌注通道 5 分钟，从而洗去所有未黏附的白细胞（剪切模式 = 恒定，剪切应力 = -0.5 dyne/cm2，持续时间 = 00:05:00，扫描延迟 = 00:00:00）。</li>
	<li>从通道中至少三个至四个不同位置获取图像，以观察黏附的白细胞（确保捕获具有代表性的区域）。</li>
	<li>对剩余所有通道重复步骤 8.1–8.7&#160;，以进行功能评估。 
	注意：可同时运行多个通道。若要实现此操作，请在步骤 8.3 中打开所有感兴趣的通道，并对多个目标通道依次执行上述步骤 8.4–8.7&#160;。</li>
</ol>
9. 完成检测并清洗微流控泵
<ol>
	<li>实验完成后，以 RAW 格式导出并保存所有图像。</li>
	<li>保存结果的同时，运行微流控泵和流路清洗程序。</li>
	<li>对于微流控泵，首先运行 Washout/Pump Washout 文件夹，依次灌注 4 mL 细胞培养级水和 4 mL 80% 乙醇，操作步骤如 6.6–6.7 所述&#160;通过通入空气运行数分钟以干燥泵体。</li>
	<li>为清洗流路，使用注射器运行 Washout/Manifold Wash 步骤。按照 6.10–6.11 所述步骤打开注射器和流路阀门&#160;先用 80% 乙醇清洗，再用细胞培养级水清洗。通过注射器推动空气以干燥流路。按照步骤 6.10 和 6.15 所述关闭注射器阀门和流路阀门。</li>
</ol>
10. 贴壁白细胞计数
<ol>
	<li>从 http://cellprofiler.org 下载并安装图像处理软件14。 
	注意：本研究中的图像处理使用的是软件版本 2.1.1。若使用更新的版本，分析流程可能需要进行轻微调整。</li>
	<li>下载分析流程文件 Count_leukocytes.cpipe。 在软件中点击 文件 | 导入 | 分析流程，然后在电脑上浏览并选择文件 Count_leukocytes.cpipe。</li>
	<li>将包含已获取的黏附白细胞原始图像的文件夹拖放到 输入模块 | 图像 区域的文件列表窗口中，以进行分析。</li>
	<li>通过 分析模块 | 识别主物体 设置白细胞的典型大小。以像素为单位指定黏附白细胞的最小和最大直径。</li>
	<li>通过 分析模块 | 过滤物体 选择过滤条件。以像素为单位设定可接受物体的最小面积。</li>
	<li>点击 分析图像 按钮开始分析。 
	注意：所有原始图像将被处理，结果将保存在默认的输出文件夹中。Image.txt 输出文件包含每张处理图像中黏附白细胞的数量（每个数值对应一张图像，即每个获取的视野）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了在促炎刺激（如TNFα）作用下对hiPSC-EC进行处理的表征方法，以及通过活细胞成像和自动计数黏附白细胞，在流动实验中对白细胞黏附于hiPSC-EC的功能评估。
TNFα对hiPSC-ECs进行过夜刺激会导致细胞呈现伸长形态，这通常表明内皮细胞（ECs）处于活化的促炎表型。在优化阶段，应通过流式细胞术（FACs）7,8检测E-选择素、ICAM-1和VCAM-1的表达水平，并建议将原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）作为阳性对照纳入实验。
应达到最佳的hiPSC-ECs解离程度和接种密度，以形成融合的单层细胞，避免细胞团块和微通道堵塞。在灌注前必须立即重悬白细胞，以防止细胞沉淀，并在检测每条通道时保持浓度恒定。可使用人外周血白细胞（如单核细胞和中性粒细胞），也可使用已建立的单核细胞系（如THP-1或HL-60）作为替代。
在微流控装置的组装过程以及流式实验过程中，必须防止气泡滞留在微流控管路和通道中，因为气泡可能导致hiPSC-ECs和/或黏附的白细胞脱落。在微流控装置制备过程中采用液体与液体界面连接，或增加额外的洗涤步骤，有助于防止气泡产生。
建议由两名操作人员共同执行该方案，其中一人负责准备细胞，另一人同时准备微流控系统和流体实验。这可确保内皮细胞在处理前的固定时间窗口内接种至微流控芯片中，从而提高实验结果的准确性和可重复性。此外，这种方法还便于设置盲法实验，以避免结果出现偏差。
为了通过自动图像处理流程成功检测细胞，必须获取焦距准确、信噪比高且避免非特异性物体（如细胞团块）自发荧光的图像。至关重要的是正确设定需要识别的贴壁白细胞典型尺寸的最小值和最大值。可以使用 ImageJ 中的线性测量工具估算白细胞的典型大小。例如，在我们的分析中，我们采用的范围为 9–15 像素，对应物理尺寸为 10.3–17.1 µm（图 4C）。若使用错误的范围，例如 3–15 像素（3.4–17.1 µm），单个白细胞不会被识别为一个整体细胞，而是其部分区域被识别为多个独立对象（图 4D），从而导致被识别对象数量的错误统计。
使用所提供的自适应阈值方法，可检测到许多强度较低且表面积小于白细胞的物体。这可能是由于自发荧光或其他非特异性荧光信号所致。然而，这些非特异性物体如果其面积小于单个白细胞的典型面积，则可通过设定最小可接受表面积进行过滤（图4C）。
本文所述的流动实验可直接评估白细胞与内皮细胞单层的黏附，阐明这两种细胞类型之间的相互作用，但未考虑血管壁中存在的其他细胞类型（如周细胞），而这些细胞也可能参与调控白细胞的外渗过程15。将三维培养微环境与其他细胞类型整合，有望提高该系统的生理相关性。尽管存在这些局限性，本文描述的用于评估炎症反应的流动实验仍为hiPSC-ECs的基础表征及疾病建模应用提供了有价值的工具。

炎症在多种病理状态中发挥关键作用，包括心血管疾病、神经退行性疾病、脓毒症以及药物不良反应（ADRs）。内皮细胞（ECs）通过在其表面诱导表达促黏附受体（如E-选择素、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）），在调控炎症反应中起着至关重要的作用1,2。已知不同组织中的微血管内皮细胞在炎症反应方面表现出异质性3,4。此外，遗传背景或特定的遗传状况可能导致个体间炎症反应的差异；因此，获取来自不同个体的内皮细胞具有重要意义。近年来研究表明，人诱导性多能干细胞（hiPSCs）5几乎可从任何个体获得，并可作为内皮细胞的一种可靠且可再生的来源6,7,8,9。因此，评估hiPSC来源的内皮细胞（hiPSC-ECs）中的炎症反应及白细胞募集不仅有助于特定遗传性疾病的建模，还可揭示个体间差异，并有望成为未来实现个体化医疗的重要工具。
流式实验为研究内皮细胞与白细胞相互作用提供了有力工具。微流控装置的技术进步使得能够精确控制特定血管床的剪切应力水平，从而重现生理性的流体流动条件。活细胞成像技术可实时监测白细胞捕获、滚动、爬行、黏附及跨内皮迁移等一系列级联事件。目前已开发出多种用于研究内皮细胞-白细胞相互作用的流式实验方法，但这些方法均使用原代内皮细胞（ECs）10,11,12,13。本文将详细描述在生理性流动条件下评估人诱导性多能干细胞来源的内皮细胞（hiPSC-ECs）对人白细胞黏附能力的实验方法。本实验流程中，我们介绍了使用促炎刺激因子（如肿瘤坏死因子α（TNFα））对hiPSC-ECs进行优化刺激的条件，以及细胞解离后接种至含有八个平行通道的微流控芯片中的操作步骤。我们还提供了一步一步的实验方案，包括在微流控芯片中用荧光标记的白细胞悬液对hiPSC-ECs进行灌注、活细胞成像，以及对黏附白细胞进行自动计数。
该方案可用于药物筛选、疾病建模和个体化再生医学中对hiPSC-ECs炎症反应的评估。

<table><tbody><tr><td>Vena8 内皮+ 生物芯片</td><td>Cellix Ltd</td><td>V8EP-800-120-02P10</td><td></td></tr><tr><td>Mirus Evo 纳米泵</td><td>Cellix Ltd</td><td>MIRUS-EVO-PUMP</td><td>1 台注射泵；&lt;br/&gt; 1 × VenaFluxAssay 软件；&lt;br/&gt; 1 套管路套装；&lt;br/&gt; 电源及电缆</td></tr><tr><td>8通道多路复用器 MultiFlow8</td><td>Cellix Ltd</td><td>MIRUS-MULTIFLOW8</td><td></td></tr><tr><td>加湿盒</td><td>Cellix 公司</td><td>HUMID-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Leica AF6000 荧光成像系统</td><td>徕卡显微系统</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电子倍增电荷耦合器件相机</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜/层流罩</td><td>洁净空气</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 细胞培养箱</td><td>松下</td><td>MCO-170AICUV</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>日立</td><td>himac-CT6EL</td><td></td></tr><tr><td>手持移液器（P-10（10 mL），P-200（200 &amp;micro;L），P-1000（1,000 &amp;micro;L)</td><td>Gilson国际</td><td>4807 (10&amp;micro;l), 4810 (200&amp;micro;l), 4809 (1000&amp;micro;l)</td><td></td></tr><tr><td>无菌塑料移液管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606180（5 ml），607180（10 ml）</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>VWR/ Duran Group</td><td>391-0860</td><td></td></tr><tr><td>培养瓶（75 cm²）&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)</td><td>CELLSTAR</td><td>658,170</td><td></td></tr><tr><td>离心管（15 mL）</td><td>CELLSTAR</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>猪皮明胶，A型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白（牛血浆）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，无钙，无镁</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>人内皮细胞专用无血清培养基</td><td>Life Technologies</td><td>11111-044</td><td></td></tr><tr><td>人源 VEGF 165 IS，优级</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-386</td><td></td></tr><tr><td>人源 FGF-2，优级</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-842</td><td></td></tr><tr><td>牛源血小板贫乏血浆衍生血清</td><td>生物医学技术</td><td>BT-214</td><td></td></tr><tr><td>重组人TNF-&amp;alpha;</td><td>Tebu-bio</td><td>300-01A-A</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>Life Technologies</td><td>12563029</td><td></td></tr><tr><td>DiOC6(3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318426</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇（50 mM）</td><td>Life Technologies</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（5,000 U/mL）</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>去离子水</td><td>Life Technologies</td><td>15230-089</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>默克</td><td>1.00983.2500</td><td></td></tr><tr><td>VCAM-1</td><td>R&amp;amp;D 系统</td><td>FAB5649P</td><td></td></tr><tr><td>E-选择素</td><td>R&amp;研发系统</td><td>BBA21</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R&amp;amp;D 系统</td><td>BBA20</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;软件版本&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CellProfiler</td><td>CellProfiler</td><td>2.1.1</td><td></td></tr><tr><td>VenaFluxAssay 软件</td><td>Cellix 公司</td><td>2.3.a</td><td></td></tr></tbody></table>

用于评估白细胞黏附至人诱导多能干细胞来源的内皮细胞（hipsc-ecs）的微流控检测方法

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

内皮细胞（ECs）通过在炎症刺激下上调白细胞表面的一系列促黏附受体，调控炎症反应，从而限制或促进白细胞向受损组织的募集。人群中个体间的炎症反应存在差异，而遗传背景可能影响这些差异。人诱导性多能干细胞（hiPSCs）已被证实是内皮细胞（hiPSC-ECs）的可靠来源，可提供无限扩增的细胞，同时保留供体的遗传特征及其任何遗传变异或突变。因此，hiPSC-ECs可用于构建供体特异性的炎症反应模型。通过在生理流动条件下测定白细胞与hiPSC-ECs的黏附情况，可模拟炎症反应。本逐步实验方案详细描述了评估hiPSC-ECs炎症反应以及分析生理流动条件下白细胞黏附的实验设置与数据分析方法。

首先，应按照先前所述方法7检测hiPSC-ECs对促炎因子TNFα刺激的反应。TNFα处理12小时可诱导E-选择素上调，其表达高峰出现在处理开始后6小时。此外，ICAM-1在处理后6至12小时出现上调。尽管我们未观察到VCAM-1的预期上调，但在原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中通常可观察到该现象。我们发现，TNFα处理过夜（12小时）最适用于白细胞黏附实验。
最佳的hiPSC-ECs解离应获得无细胞团块的单细胞悬液。 图2C 展示注射后 hiPSC-EC 的最佳密度。通常在注射后 15 分钟，hiPSC-EC 会附着在通道底部并开始铺展（图 2D注射后1小时，hiPSC-ECs沿通道形成铺展良好的单层，即可开始流动实验。图2E).
用荧光示踪剂标记白细胞有助于自动图像定量中的相差图像，因为它使细胞识别步骤更加容易，尤其是白细胞会黏附在内皮细胞单层上，软件通常难以区分不同类型的细胞。
免费的开源图像处理软件对于粘附白细胞的自动定量非常有用。本方案中描述的分析流程基于对白细胞荧光图像进行自适应阈值处理，以实现初始目标物的识别（图4A）。根据最小面积对已识别目标物进行筛选，还可进一步排除误识别的目标物，例如细胞碎片、自发荧光或任何其他非特异性荧光信号（图4C、D）。
一个具有八个平行通道的微流控芯片可用于比较两个独立组，例如由不同 hiPSCs 分化而来的内皮细胞（ECs），如来自健康供体或遗传病患者的细胞。此外，还可包括其他对照组，例如未处理的 ECs，或经 ICAM-1 阻断抗体预处理的 ECs。10,11一次可同时处理两到三个微流控芯片。为确保结论的可靠性，建议在不同日期至少进行三次独立的生物学重复实验。
<img alt="hiPSC-EC 制备示意图；细胞刺激、酶洗、离心步骤、芯片孵育。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58678/58678fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：流式实验用 hiPSC-ECs 和白细胞的制备。（A）使用促炎刺激物（TNFα）对 hiPSC-ECs 进行预处理。（B）hiPSC-ECs 酶法解离、离心及重悬的示意图。（C）微流控芯片通道包被（C，左）、注入 hiPSC-EC 悬液（C，中）以及 hiPSC-ECs 黏附后加入细胞培养基（C，右）的示意图。（D）白细胞洗涤步骤、用荧光染料 DiOC6 标记及重悬的示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58678/58678fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="带有微流控装置和显微镜图像的细胞培养室设置，显示细胞生长阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58678/58678fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：含 hiPSC-ECs 的微流控芯片。（A）置于 10 cm 培养皿中的微流控芯片。（B）用于孵育的加湿培养室。（C, D, E）hiPSC-ECs 注入微流控通道后 0 min（C）、15 min（D）、1 h（E）的代表性图像。比例尺 = 200 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58678/58678fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="白细胞灌注显微镜装置；流动室、相差成像、荧光分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58678/58678fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：活细胞成像与白细胞灌注实验装置示意图。（A, B）活细胞成像与流动实验装置的照片（A）和示意图（B）：（1）倒置荧光显微镜，配备活细胞成像室（5% CO2，37 °C，湿度恒定），（2）微流控泵，（3）8通道分流装置，（4）用于显微镜控制与图像采集的计算机，（5）用于微流控泵控制的计算机。（C）微流控芯片，其中插入了8通道分流装置的管路，并固定在载物台支架中，安装于显微镜的电动载物台上。（D）流动实验主要步骤的示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58678/58678fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞分割分析；软件界面设置和数据过滤结果；对象大小调整。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58678/58678fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：贴壁白细胞的图像分析与自动检测。（A）图像处理软件的对话窗口，显示用于识别白细胞的指定设置。（B）图像处理软件的对话窗口，显示基于最小可接受表面积（SAmin = 70 px）对已识别对象设定的过滤条件。（C）正确识别白细胞并对小表面积（SA）非特异性对象进行过滤的示例（像素中的典型直径范围（最小值，最大值）=（9，15）；过滤条件 SAmin = 70 px）。被接受的对象以绿色显示，被剔除的对象以紫色显示。（D）由于典型直径范围设置不当导致白细胞识别错误的示例（像素中的典型直径范围（最小值，最大值）=（3，15）；过滤条件 SAmin = 70 px）。被接受的对象以绿色显示，被剔除的对象以紫色显示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58678/58678fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本逐步实验方案详细描述了用于评估hiPSC-ECs中炎症反应以及在生理流动条件下分析白细胞黏附的实验设置和数据分析方法。

用于评估白细胞黏附至人诱导多能干细胞来源的内皮细胞（hiPSC-ECs）的微流控检测方法

内皮细胞（ECs）通过限制或促进白细胞向受损组织的募集，在调控炎症反应中发挥关键作用……

该方法有助于解答人类多能干细胞生物学领域中的关键问题，即人类诱导性多能干细胞来源的内皮细胞的功能特性及其炎症反应。该技术的主要优势在于，它详细描述了用于评估白细胞黏附至人类诱导性多能干细胞来源内皮细胞的实验装置及数据分析流程。进行微流控芯片包被时，将无菌生物芯片置于一个10厘米无菌培养皿中，并使用10微升移液枪头向生物芯片每个通道内注入10微升 freshly prepared fibronectin工作液。将培养皿盖好，放入4摄氏度的湿化环境中过夜。次日早晨，将生物芯片置于37摄氏度的培养箱中预热，并用新鲜的无血清内皮细胞培养基将从80%至100%融合度的细胞培养物中收获的人诱导多能干细胞来源的内皮细胞重悬至所需浓度。接着，用移液器吸除微流控芯片所有通道中的纤连蛋白溶液，在使用10微升移液枪头向每个通道注入6微升细胞悬液前，充分混匀细胞以获得均一的细胞悬液。在显微镜下观察生物芯片，确认细胞分布均匀且细胞密度较高。在37摄氏度条件下孵育15分钟后，向每个通道两侧的培养基储液池中各加入40 µL内皮细胞无血清完全培养基。随后将生物芯片放回培养箱中继续孵育1小时。然后，向每个通道两侧的储液池中再加入 50 µL 内皮细胞无血清培养基 FULL。进行接种细胞的活细胞成像前，需确认微流控装置已准备就绪，活细胞成像腔室已平衡至 37 °C，且 CO₂ 浓度已达到 5%。将生物芯片放入显微镜芯片夹持器中，并将夹持器安装至显微镜成像载物台上。为通过流体分配装置将生物芯片连接至泵，需将八针适配器靠近芯片的出口储液池，并将所有针头插入培养基中，但不要完全连接。在微流控泵软件中，选择“冲洗/连接芯片”，然后点击“运行检测步骤”以通过每个针头分配 30 微升 RPMI 培养基。随后将八针适配器插入生物芯片的出口。使用移液器手动从生物芯片的所有入口储液池中吸出培养基，并选择“冲洗/芯片冲洗”和“运行检测步骤”，依次用 40 微升内皮细胞无血清完全培养基对每个通道进行灌注，以去除任何死亡细胞和碎片。当所有通道完成洗涤后，将目标通道入口储液池中的培养基更换为100微升人白细胞悬液，该悬液用RPMI培养基稀释至浓度为2.5 × 10⁶个细胞/毫升。点击“细胞检测/步骤描述”和“设置当前通道/步骤描述”，将目标通道设为“开启”，其余七个通道设为“关闭”。选择“细胞检测步骤描述”，然后点击“运行检测步骤”。用 100 微升完全 RPMI 培养基替换入口储液池中剩余的白细胞。点击“细胞检测步骤描述”和“运行检测步骤”，以 RPMI 培养基灌注通道五分钟，以去除所有非黏附性白细胞。然后在通道内至少三个至四个不同位置采集图像，以观察黏附的白细胞。为了定量黏附的白细胞，打开 CellProfiler 图像处理软件并导入“Count Leukocytes Pipeline”文件。在“输入”模块中选择“图像”，然后将含有黏附白细胞原始图像的文件夹拖放到文件列表窗口中。在“分析”模块中选择“识别主要物体”，并以像素为单位设定黏附白细胞的最小和最大直径。在“分析”模块中选择“FilterObjects”，然后选择筛选条件，输入可接受的最小对象面积（单位：像素），并点击“分析图像”以开始分析。理想的人诱导多能干细胞来源的内皮细胞解离应获得无细胞团块的单细胞悬液。通常在注射后15分钟，内皮细胞将附着在通道底部并开始铺展。注射后一小时内，内皮细胞应在通道内形成均匀铺展的单层，此时即可用于流式实验。如示例所示，使用免费的开源图像处理软件，可根据最小面积对已识别对象进行筛选，并排除被误识别的物体，如细胞碎片、自发荧光或其他非特异性荧光信号。在进行该实验操作时，重要的是要记住优化促炎性细胞因子的刺激条件，并应包含原代人脐静脉内皮细胞作为阳性对照。切勿忘记，操作原代哺乳动物细胞及细胞系可能具有极高的危险性，因此在进行该实验时，必须采取佩戴实验服、手套和护目用具等防护措施。

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