微流控法评价人诱导的多能干细胞内皮细胞 (hipsc-ec) 对白细胞粘附的评价

该分步协议提供了实验设置和数据分析的详细描述, 用于评估 hipsc-ec 中的炎症反应和分析生理流下的白细胞粘附。

该方法有助于回答人类多能干细胞生物学领域有关人类诱导多能干细胞衍生内皮细胞的功能和炎症反应的一些关键问题。该技术的主要优点是，它提供了实验设置和数据分析的详细描述，用于评估白细胞与人类诱导多能干细胞衍生内皮细胞的粘附性。对于微流体芯片涂层，将无菌生物芯片放入10厘米无菌培养皿中，并使用10微升移液器尖端将10微升新鲜准备好的纤维素工作溶液注入生物芯片的每个通道。

盖上培养皿，在摄氏四度下将放在加湿室中过夜。第二天早上，在37摄氏度的培养箱中预热生物芯片，并在一种新鲜的内皮细胞无血清培养基中，重新悬浮从80至100%的共合细胞培养物中采集的人类诱导多能干细胞衍生内皮细胞。接下来，从微流体芯片的所有通道中吸出纤维素溶液，彻底混合细胞以获得均匀细胞悬浮液，然后使用10微升移液器尖端将6微升细胞注入每个通道。

在显微镜下检查生物芯片，确认细胞均匀分布，细胞密度高。在37摄氏度下15分钟后，将40微升内皮细胞无血清介质全部加入每个通道两侧的中储层。将生物芯片返回孵化器一小时。

然后，将另外50微升内皮细胞无血清介质全部加入每个通道两侧的储液罐中。对于种子细胞的活成像，确认微流体设置已准备就绪，活成像室平衡至37摄氏度，CO2水平达到5%将生物芯片放入显微镜芯片支架，将芯片支架安装到显微镜成像阶段。要通过歧管将生物芯片连接到泵，请将八针适配器靠近芯片的排口储液罐，并在不完全连接引脚的情况下加深介质中的所有引脚。

在微流体泵软件中，选择"冲洗/连接到芯片"，然后单击"运行检测步骤"，通过每个引脚分配 30 微升 RPMI 介质。然后将八针适配器插入生物芯片的插座。使用移液器从生物芯片的所有进气罐中手动吸气介质，并选择洗涤/芯片冲洗和运行检测步骤，一次用 40 微升的内皮细胞无血清介质完全吸气一个通道，以清除任何死细胞和碎屑。

当所有通道都洗净后，用100微升的人类白细胞稀释至RPMI介质中每毫升浓度的2.5倍至6个细胞，取代感兴趣的通道进气库中的介质。单击"单元格分析/步骤描述"，将当前通道/步骤描述设置为"打开"，将感兴趣的通道设置为"关闭"，将其他七个通道设置为"关闭"。选择"单元格分析步骤"描述，然后单击"运行分析步骤"。

用 100 微升完整的 RPMI 介质更换进气储液库中剩余的白细胞。然后单击细胞检测步骤描述和运行检测步骤，使用 RPMI 介质对通道进行五分钟检测，以去除任何非吸力性白细胞。然后从通道中至少三到四个不同的位置获取图像，以可视化粘附的白细胞。

要量化粘附的白细胞，请打开 CellProfiler 图像处理软件并导入白细胞计数管道文件。在"输入"模块下，选择"图像"并拖放包含粘附白细胞原始图像的文件夹到"文件列表"窗口。在"分析"模块下，选择"识别主要对象"，并指示粘附白细胞的最小和最大直径（以像素为单位）。

在"分析"模块下，选择"筛选对象"。然后选择筛选条件，输入对象以像素为单位的最小接受区域，然后单击"分析图像"开始分析。最佳的人类诱导多能干细胞衍生内皮细胞分离应导致单细胞悬浮无细胞团块。

通常，注射后15分钟，内皮细胞将附着在通道底部并开始扩散。注射后一小时内，内皮细胞应形成一个分布良好的单层穿过通道，此时它们已准备好用于流测定。使用演示的免费开源图像处理软件，可以基于最小区域过滤已识别的对象，并排除错误识别的对象，如细胞碎片、自荧光或任何其他非特异性荧光信号。

在尝试此程序时，重要的是要记住用亲炎细胞因子优化刺激，并包括原发性人类脐静脉内皮细胞作为阳性对照。不要忘记，使用原发哺乳动物细胞和细胞系可能极其危险，执行此程序时应始终采取预防措施，如穿着实验室外套、手套和眼睛保护。