Name: 在 vivosilk/aav 薄膜在光基因表达中的靶向表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: 了解利用丝素蛋白薄膜递送腺相关病毒载体的方法，实现光遗传学蛋白在特定脑区的精准靶向表达。该技术简化病毒注射流程，助力系统神经科学研究。

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作者感谢 J. Vazquez 提供的插图，D. Kaplan 和 C. Preda 提供的试剂及有益指导，以及 B. Sabatini 和 C. Harvey 实验室的支持。 体内 成像。显微成像由 M. Ocana 及神经生物学成像中心完成，该中心部分由国家神经疾病与中风研究所（NINDS）P30 核心中心资助项目（NS072030）下的神经成像中心支持。本研究得到 GVR Khodadad 家族基金会、Nancy Lurie Marks 基金会以及美国国立卫生研究院（NIH）资助项目的支持，包括授予 W.G.R. 的 NINDS R21NS093498、U01NS108177 和 NINDS R35NS097284，以及授予 C.H.C. 的 NIH 博士后奖学金 F32NS101889。

所有涉及动物的实验均依照美国国立卫生研究院（US NIH）指南，经哈佛大学动物护理常设委员会批准的方案进行。 实验动物护理和使用的指南所有实验均使用任一性别的成年C57BL/6小鼠（6–15周龄）。
1. 获取水溶性丝素蛋白
<ol>
	<li>制备或购买水性丝素蛋白（5-7.5% w/v）。</li>
</ol>
2. 混合水相蚕丝与AAV表达载体
<ol>
	<li>选择一种AAV表达载体，以驱动所需的光遗传蛋白或荧光指示剂。 
	注意：为了在仍能驱动强表达的同时，尽量减少应用于植入物的丝素蛋白/AAV混合物的体积，建议使用高滴度的AAV原液（通常从载体核心机构获得的原液滴度约为 ~1013 gc/mL）。</li>
	<li>在涂覆植入物前立即解冻一份AAV，并与5–7.5%的水溶性丝素蛋白混合（该混合物称为丝素蛋白/AAV）。在200 µL PCR管中，于使用前立即按1:1比例（用于颅窗时为1:4）混合水溶性丝素蛋白与AAV。轻柔地反复吹打溶液数次，以充分混匀丝素蛋白与AAV。</li>
	<li>在使用前，将丝素蛋白/AAV混合物置于冰上保存。</li>
</ol>
3. 准备丝素蛋白/AAV包被装置的制备与储存设备
<ol>
	<li>准备用于涂覆光纤和梯度折射率（GRIN）透镜的设备（图1，图2）。
	<ol>
		<li>构建一个稳定的插芯夹具。为固定陶瓷插芯，在一块¼英寸厚的丙烯酸板上钻出直径1.25 mm的孔，并在侧面攻螺纹以安装紧定螺钉，从而将插芯固定到位。 
		&#8203;注意：也可使用任何类型的夹具来实现此目的。</li>
		<li>使用具有亚毫米精度的操纵器来移动光纤（如立体定位仪或其他精密微操纵器）。</li>
		<li>组装一个稳定的支架以固定微注射器。</li>
		<li>使用体视显微镜观察光纤和丝素蛋白液滴。</li>
		<li>设置光源以照亮光纤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于涂覆颅窗的设备（图3）。
	<ol>
		<li>选用任意一种P10移液器。</li>
		<li>准备一个带盖容器。 
		注意：建议使用底部为硅胶材质的容器——柔软的底部有助于取出颅窗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于储存成品植入物的设备（图4）。
	<ol>
		<li>准备一个小型（1–5 L）真空腔室。</li>
		<li>确保在4 °C冰箱中有足够的空间用于储存植入物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 将丝素蛋白/AAV 薄膜应用于器械
<ol>
	<li>包被光纤以在光纤尖端驱动局灶性表达
	<ol>
		<li>按照先前所述方法制备慢性光纤植入物4。</li>
		<li>使用前，先用乙醇冲洗植入物，再用超纯水冲洗，以确保光纤表面清洁。 
		注意：丝素膜在洁净的玻璃表面附着更可靠。</li>
		<li>准备一个用于固定光纤插芯的装置。对于典型的直径为1.25 mm的插芯，可使用一块¼英寸透明丙烯酸块，钻出约1.3 mm的孔，并从侧面安装带螺纹的紧定螺钉，以牢固固定插芯（图1A）。</li>
		<li>将插芯固定装置安装到立体定位仪（或任何具有亚毫米精度的操作装置）上，并配备微量注射器。将插芯固定装置置于注射器上方，从下方施加丝素/AAV混合液。 
		注意：从上方施加大体积液体时，会导致丝素/AAV无法局限于光纤尖端。然而，从上方或下方连续施加多个小体积液体，可使AAV/丝素沉积物局限于尖端（尽管我们更倾向于从下方施加）。</li>
		<li>用硼硅酸盐玻璃毛细管拉制标准颅内注射移液管。
		<ol>
			<li>为便于操作</li>
			<li>为获得所需直径且端面平整的注射尖端，双手各持一根移液管，用其中一根移液管锥形较粗的部分在另一根移液管上所需断裂位置处划痕。</li>
			<li>轻轻前后往复摩擦（即玻璃对玻璃划痕法）。</li>
			<li>划痕后，用另一根移液管的管体对划痕处的尖端施加轻柔压力，使其整齐断裂。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>调整体视显微镜位置，以清晰观察光纤端面。 
		注意：放大倍数应足以准确将注射移液管定位在光纤端面上方。</li>
		<li>将光纤植入物插入固定装置，使光纤朝向脑组织的一侧朝下。</li>
		<li>像进行常规颅内注射一样，用丝素/AAV溶液填充注射移液管5。根据所需制备的植入物数量，加载相应体积的溶液，并额外多取约30%，以补偿因移液管堵塞造成的损失。例如，若制备10个植入物，则每个沉积100 nL，共吸取约1.3 µL。 
		注意：丝素/AAV可能在两次喷射之间于移液管尖端干燥，导致堵塞。大直径移液管（50–100 µm）较不易堵塞。可通过湿润的纸巾或酒精棉签轻轻擦拭移液管尖端来清除堵塞物。</li>
		<li>移动注射移液管，使其接触或接近光纤表面中心。喷射10–20 nL丝素/AAV溶液，然后撤回移液管。 
		注意：输送速率并非关键，通常速率为5–20 nL/s。</li>
		<li>观察光纤平面上形成的丝素/AAV液滴，其呈液态圆顶状，并在约1分钟内干燥成平整薄膜（图1B）。</li>
		<li>重复步骤4.1.9–4.1.10，直至沉积所需量的丝素/AAV（大多数应用中总量为20–200 nL）。当制备多个植入物时，先在一个植入物上施加丝素/AAV，然后继续处理其他植入物，之后再返回第一个。</li>
		<li>干燥1小时后再移动植入物。</li>
		<li>在约125 Torr（-25 in. Hg）、4 °C条件下真空干燥过夜。可将整个插芯固定装置放入真空室中完成此步骤。</li>
		<li>在高倍显微镜下评估所得丝素膜的形状和位置。确保膜仅局限于光纤端面，厚度较薄（&#62;100 µm），且对称（图1C）。 
		注意：过大或不对称的丝素/AAV膜可能在植入过程中从光纤上脱落（图1D）。最常见的问题源于一次性施加大体积液体，而非分次施加多个小体积液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>包被锥形光纤以沿光纤轴向驱动表达
	<ol>
		<li>获取锥形光纤植入物，并执行步骤4.1.2–4.1.8，但将锥形光纤横向放置，使其垂直于注射器（图2A）。将注射器置于锥形光纤上方。 
		注意：在锥形光纤上加载液滴更具挑战性，因为表面张力倾向于使液滴跳回注射移液管或沿锥形光纤向上迁移。较小的注射移液管（30–50 µm直径）有助于克服此问题，但会增加堵塞风险。由于表面张力作用，液滴倾向于附着在表面积最大的区域，因此最佳移液管尺寸取决于锥形光纤的大小以及对偶尔堵塞的容忍度。</li>
		<li>将丝素/AAV注射移液管抵住锥形光纤起始处的侧面。确保移液管与光纤接触。</li>
		<li>喷射20 nL丝素/AAV以开始包被过程。确保液滴附着在光纤上，并保持在光纤与移液管的界面处。在丝素/AAV干燥过程中（约45秒），轻轻将液滴沿光纤尖端方向牵引。保持注射移液管与正在干燥的液滴接触，以避免移液管尖端堵塞。 
		注意：每次沉积应覆盖约400 µm长的锥形光纤（图2B）。</li>
		<li>当第一个液滴几乎完全干燥后，再喷射20 nL，并继续沿锥形部分牵引液滴。 
		注意：液态丝素会附着在已干燥的丝素上，当移液管沿锥形移动时，固定液滴的一端。</li>
		<li>重复步骤4.2.4，喷射少量丝素/AAV，并逐渐将溶液沿锥形侧面牵引。5–6次喷射足以覆盖2.5 mm长的锥形表面。</li>
		<li>为在光纤所有侧面实现更均匀的表达，旋转光纤并重复步骤4.2.2–4.2.5，直至沉积所需量的丝素/AAV。</li>
		<li>若干燥的丝素/AAV细丝延伸超出光纤尖端，可用剪刀小心剪断，或使用喷射移液管将细丝弯回并粘附至光纤锥形部分。</li>
		<li>干燥1小时后再移动植入物。</li>
		<li>在4 °C条件下真空干燥过夜。可将整个插芯固定装置放入真空室中。</li>
		<li>在高倍显微镜下评估所得丝素膜的形状和位置。 
		注意：膜不必完全均匀，但凸起部分不应超出光纤表面超过100 µm，以尽量减少植入时对周围组织的损伤（图3C）。为减小膜尺寸，关键在于每次后续沉积前必须确保前一个液滴已完全干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>包被GRIN透镜植入物
	<ol>
		<li>获取GRIN透镜6,7，并重复步骤4.1.2–4.1.8。注射器可安装在上方。</li>
		<li>单次喷射沉积丝素/AAV（1.0 mm直径透镜使用1 µL）。 
		注意：这将形成附着在透镜端面的液态圆顶，并干燥成均匀薄膜（厚度100–200 µm）。然而，若单次大体积喷射干燥不均，导致GRIN透镜边缘处膜较厚，可尝试在透镜表面中心多次沉积较小液滴（100–200 nL）（每次液滴干燥后再沉积下一个），以确保膜在视野中心驱动表达。</li>
		<li>干燥1小时后再移动植入物。</li>
		<li>在高倍显微镜下评估所得丝素膜的形状和位置，确保膜覆盖整个透镜表面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>包被玻璃颅窗
	<ol>
		<li>通过使用光学胶将两个直径3 mm的圆形盖玻片（No. 1厚度）粘接到一个直径5 mm的窗口上，制备玻璃颅窗（具体方法见Goldey et al. 20148）。</li>
		<li>将丝素与病毒按1:4比例混合，以减少膜中丝素总量。过量丝素在植入后无法在颅窗下溶解。可能需要进行滴定实验，以确定获得理想表达模式所需的混合比例和体积。</li>
		<li>用手持移液器将5 µL液滴加到3 mm（朝向脑组织一侧）盖玻片表面。液滴应铺展以覆盖整个玻璃表面（图3）。</li>
		<li>干燥2–3小时后再移动颅窗。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 保存丝素蛋白/AAV 包被的植入物
<ol>
	<li>使用前将丝素蛋白/AAV包被的光纤存放在冷却的真空干燥器中（约125 Torr，4 °C）（图4A）。</li>
	<li>颅窗和梯度折射率（GRIN）透镜不得在真空条件下储存，因为大尺寸的丝素蛋白薄膜在真空储存后植入体内时无法完全溶解。颅窗和GRIN透镜应在干燥后立即植入，或在常压及4 °C条件下储存时于制造后一天内使用。</li>
</ol>
6. 植入设备
<ol>
	<li>按照先前所述方法准备动物以进行植入手术4。
	<ol>
		<li>简言之，通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪（100/10 mg/kg）对小鼠进行麻醉，并通过轻捏脚趾检查麻醉深度。剃除植入区域颅骨上的毛发，并用碘伏和酒精清洁头皮。</li>
		<li>将动物固定于立体定位仪中，并通过氧气与异氟烷混合气体（1-2%）补充麻醉。在目标区域头皮上做切口，实施足够大的颅骨开窗以容纳植入物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据先前发表的方案植入光纤9和微型内窥镜透镜10。操作植入物时需格外小心，因为不完善的颅骨开窗或植入物刮碰到颅骨边缘可能导致丝素蛋白/AAV沉积物脱落。将植入物缓慢置入脑组织（约2 mm/min）。</li>
	<li>按照先前描述的方法植入颅窗8。请勿触碰颅窗的涂层面，若进行灌胃操作时应避免用液体冲洗颅窗，以免冲走病毒。为实现最大表达效果，可进行硬脑膜切开术。</li>
</ol>
7. 表达分析与故障排除
<ol>
	<li>为评估病毒表达蛋白的表达情况，需给予约2-3周时间使病毒充分驱动表达，随后使用含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液进行心脏灌注11，并对脑组织进行荧光显微镜检测的处理12。</li>
	<li>通过荧光显微镜观察荧光标记的光遗传学蛋白的表达模式，以评估其表达水平。</li>
	<li>若表达水平不足，可通过增加丝素/AAV包被的总体积，或更优地，使用更高滴度的病毒，来提高包被中病毒的用量。</li>
</ol>

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<li>Tervo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Designer+AAV+Variant+Permits+Efficient+Retrograde+Access+to+Projection+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li>
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<li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li>
<li>Sparta, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2011).</li>
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<li>Park, J. J., Cunningham, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+sectioning+of+slice+preparations+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Thin sectioning of slice preparations for immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. (3), 194(2007).</li>
<li>Cao, Y., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradation+of+silk+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biodegradation of silk biomaterials.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (4), 1514-1524 (2009).</li>
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<li>Yucel, T., Cebe, P., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vortex-induced+injectable+silk+fibroin+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels.</a> Biophysical Journal. 97 (7), 2044-2050 (2009).</li>
<li>Wang, X., Kluge, J. A., Leisk, G. G., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonication-induced+gelation+of+silk+fibroin+for+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Sonication-induced gelation of silk fibroin for cell encapsulation.</a> Biomaterials. 29 (8), 1054-1064 (2008).</li>
<li>Lee, J., Park, S. H., Seo, I. H., Lee, K. J., Ryu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+repeatable+fabrication+of+high+A%2FR+silk+fibroin+microneedles+using+thermally-drawn+micromolds%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Rapid and repeatable fabrication of high A/R silk fibroin microneedles using thermally-drawn micromolds.</a> European Journal of Biopharmaceutics. 94, 11-19 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

使用丝素蛋白/腺相关病毒（AAV）靶向表达光遗传学蛋白，克服了当前常用方法的局限性。尽管许多研究已成功通过AAV注射实现光遗传学蛋白的表达，但要使表达区域精确对准光纤尖端、锥形光纤周围区域或GRIN透镜的观察区域仍具挑战性。由于光学元件与光遗传学表达区域之间的错位，立体定位注射可能不可靠，导致大量实验失败。本文所述的丝素蛋白/AAV标记方法解决了这一问题。该方法还通过省去第二次手术步骤，简化了操作流程，在某些情况下甚至完全避免了二次手术的需要。此外，使用病毒在颅窗下方实现广泛表达也较为困难，实验人员通常需要进行耗时较长的手术，以在多个位点注射病毒。而通过简单地将丝素蛋白/AAV涂覆于颅窗表面，即可在大范围皮层区域实现广泛表达，这一简化策略避免了多次侵入性注射的需要。
丝素蛋白/AAV 方法的另一个潜在优势是，与病毒注射相比，它可能在神经组织中引发更少的炎症反应。将高滴度 AAV 注射入脑内可能引起诸如反应性星形胶质细胞增生等炎症反应，这些反应有可能改变细胞和神经环路的特性14,...

过去十年中，用于监测和操控神经活动的工程化光敏感蛋白得到了迅猛发展1。病毒为在脑内表达这些光遗传学工具提供了无与伦比的灵活性。与转基因动物相比，病毒更易于制备、运输和保存，能够快速应用最新的光遗传学工具。通过遗传学手段可将表达特异性地靶向不同的神经元群体，而设计用于逆向运输的病毒甚至可根据神经元的连接性来实现表达的靶向定位2。
病毒通常通过立体定位注射引入，该方法可能耗时且操作困难。精确靶向小区域具有挑战性，而要在大范围内驱动基因表达则通常需要多次注射。此外，当后续需在脑内植入光学器件以递送光刺激时 体内，植入物必须与病毒注射位置准确对齐。本文中，我们介绍一种易于实施的方法，利用丝素蛋白薄膜将病毒载体递送至植入装置周围的组织3丝素蛋白可商业化获取，对神经组织具有良好的生物相容性，可用于制备具有不同特性的材料。丝素蛋白薄膜可使用常见的实验室设备（如微量注射移液器或手动移液器）涂覆于植入物表面。丝素蛋白/腺相关病毒（AAV）薄膜可避免两次手术操作，确保病毒介导的表达与光学植入物精确对齐。所获得的表达局限于光纤尖端，相较于立体定位注射，可显著减少沿光纤路径的非靶向表达。
除了在细小纤维尖端实现靶向表达外，丝素蛋白/AAV薄膜还可用于在颅窗下方驱动广泛（&#62;3 mm直径）的皮层表达。体内双光子荧光活性传感器成像已成为评估神经元活动在驱动感觉和认知处理中作用的不可或缺的工具。然而，为了在大范围皮层区域实现均匀表达，实验人员通常需要进行多次注射。这些注射极为耗时，且可能导致视野范围内表达不一致。相比之下，涂覆有丝素蛋白/AAV的颅窗极易制备，可显著缩短手术时间，更显著的是，能够在皮层表面下数百微米深度驱动表达。

<table><tbody><tr><td>水性丝素蛋白</td><td>Sigma</td><td>5154-20ML</td><td>用于制备薄膜的水性丝素蛋白（5% w/v）</td></tr><tr><td>用于沉积丝素蛋白/AAV的显微注射器</td><td>Drummond</td><td>3-000-207</td><td>Nanoject III 纳升注射仪</td></tr><tr><td>用于固定植入物的操纵器</td><td>Narashige</td><td>MM-33</td><td>显微操纵器</td></tr><tr><td>用于观察丝素蛋白沉积的体视显微镜</td><td>AmScope</td><td>SM-6TX-FRL</td><td>3.5X-45X 三目变焦显微镜，带环形光源</td></tr><tr><td>用于储存植入物的真空室</td><td>Ablaze</td><td>N/A</td><td>3.5 夸脱真空脱气室</td></tr><tr><td>可选，用于储存的植入物支架</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>为储存预制的光纤，可在塑料块上钻出一系列深度约 4 mm、直径略大于陶瓷插芯直径的孔。</td></tr><tr><td>光学光纤</td><td>Thorlabs</td><td>FT200EMT</td><td>&amp;Oslash;200 &amp;micro;m 芯径多模光纤，用于光纤植入</td></tr><tr><td>陶瓷插芯</td><td>Kientec</td><td>FZI-LC-230</td><td>用于光纤植入的 LC 氧化锆陶瓷插芯</td></tr><tr><td>制造慢性光纤植入物所需的各种材料</td><td>Various</td><td>N/A</td><td>详细操作步骤请参见：Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68)。</td></tr><tr><td>锥形光纤植入物</td><td>Optogenix</td><td>Lambda-B</td><td>锥形光纤植入物</td></tr><tr><td>梯度折射率透镜（GRIN透镜）</td><td>GoFoton</td><td>CLH-100-WD002-002-SSI-GF3</td><td>GRIN透镜</td></tr><tr><td>小型玻璃颅窗</td><td>Warner</td><td>64-0726 (CS-3R-0)</td><td>小型圆形盖玻片，#0 厚度</td></tr><tr><td>大型玻璃颅窗</td><td>Warner</td><td>64-0731 (CS-5R-0)</td><td>小型圆形盖玻片，#0 厚度</td></tr><tr><td>制造颅窗所需的各种材料</td><td>Various</td><td>N/A</td><td>详细操作步骤请参见：Goldey GJ 等. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 年 11 月；9(11):2515。</td></tr></tbody></table>

体内 靶向表达光遗传学蛋白的丝素蛋白/腺相关病毒薄膜应用

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

阐明神经环路如何处理信息以驱动行为输出的研究，已因近期开发的用于操控和监测神经元活动的光学方法而得到极大推动 体内这些类型的实验依赖于两个主要组成部分：1）可植入设备，用于提供对大脑的光学通路；2）光敏感蛋白，可改变神经元的兴奋性或提供神经元活动的读出信号。表达光敏感蛋白的方法有多种，但目前最灵活的方法是通过立体定位注射病毒载体，因为该方法可在遗传、解剖和时间上精确控制蛋白表达。尽管病毒载体具有显著优势，但将病毒递送至光学植入部位仍面临诸多挑战。立体定位病毒注射属于高难度手术操作，会延长手术时间、增加研究成本，并对动物健康造成风险。注射针头可能对周围组织造成物理损伤，同时高滴度病毒的快速团注还可能引发免疫性炎症反应。当靶向脑深部较小区域时，使注射位置与光学植入物精确对齐尤为困难。为克服这些挑战，我们介绍一种方法，即将丝素蛋白与腺相关病毒（AAV）载体构成的薄膜涂覆于多种类型的光学植入物表面。丝素蛋白是一种来源于蚕茧的聚合物， 家蚕， 可包封并保护生物分子，并可加工成从可溶性薄膜到陶瓷等多种形态。当植入大脑时，丝素蛋白/腺相关病毒（AAV）涂层在光学元件与周围脑组织的界面处释放病毒，从而在所需位置精确驱动基因表达。该方法易于实施，有望显著促进 体内 神经环路功能研究

为了评估丝素蛋白/腺相关病毒（AAV）薄膜在驱动基因表达方面的效果，我们在植入后2-3周对动物进行灌注，并制备了目标脑区的脑切片。荧光标记的光遗传学蛋白（ChR2-YFP）的荧光图像可用来衡量表达的范围（图1D）。典型的光纤（直径230 µm）可轻松容纳200 nL的丝素蛋白/AAV溶液。经过练习，实验人员可在植入光纤的尖端周围实现高度可靠的基因表达（图5）。
为评估由丝素蛋白/AAV包被的颅窗所驱动的表达，建议在植入后7-10天开始成像。我们已采用双光子成像进行观察，但也可使用其他方法，例如配备CCD的荧光成像。包被式颅窗可能出现两个问题：表达不足，以及丝素膜未能溶解从而遮挡视野。为增强表达，建议在植入窗口前进行硬脑膜切除术，和/或增加膜中病毒的用量。我们发现，使用丝素蛋白与原液滴度AAV按1:4比例混合时表达效果最佳。尽管该方案所...

本文介绍了一种利用丝素蛋白薄膜将病毒表达载体递送至大脑的方法。该方法可利用涂有丝素蛋白/腺相关病毒（AAV）的光纤、锥形光纤以及颅窗实现表达载体的靶向递送。

理解神经回路如何处理信息以驱动行为输出的研究，近年来得益于新开发的光学技术而取得了显著进展。

该方法有助于解答系统神经科学领域中的关键问题，例如神经元群体的活动如何支持大脑中的感觉和认知信息处理。该技术的主要优势在于，无需额外的病毒注射步骤，即可实现光遗传学蛋白（如ChR光敏通道蛋白和GCaMP）对目标脑区的精确定位。该方法的可视化演示至关重要，因为将丝素蛋白和病毒沉积到小型光学植入物上的操作需要一定练习，才能获得可重复的结果。首先，在200微升PCR管中，按1:1的比例混合解冻的AAV与5%至7.5%的水溶性丝素蛋白。轻轻吹打溶液数次，以充分混匀AAV与丝素蛋白。为了沉积丝素蛋白/腺相关病毒（AAV），使用注射移液管吸取所需溶液量，该体积应满足拟植入纤维的数量需求，并额外增加约30%以补偿因移液管堵塞造成的损耗。接下来，将套管固定器安装至配备有微量注射仪的立体定位仪上。将套管固定器置于微量注射仪上方，并从下方施加丝素蛋白/AAV混合物。移动注射移液管，使其接触或接近光纤表面的中心位置，并推出10至20纳升的丝素蛋白/AAV溶液。然后撤回移液管。接着，观察平面上的丝素蛋白/AAV液滴，其呈现为液态穹顶状，在约一分钟内干燥形成平整的薄膜。重复上述步骤，直至沉积出所需量的丝素蛋白/AAV。制备多个植入物时，先将丝素蛋白/AAV溶液涂覆在一个植入物上，然后继续涂覆其他植入物，最后再返回至第一个植入物。干燥一小时后，将整个套管架放入真空室中，在约125托、4摄氏度条件下真空干燥过夜。次日，在高倍显微镜下评估所得丝素蛋白膜的形态和位置。确保薄膜局限于光纤表面尖端，厚度较薄且对称。对于锥形光纤的涂覆，将丝素蛋白/AAV注射移液管置于锥形起始处光纤的一侧，并确保移液管与光纤表面接触。推出20纳升的丝素蛋白/腺相关病毒（silk/AAV）溶液以启动包被过程，确保液滴附着在光纤表面，并保持在光纤与移液尖端的界面处。随着丝素蛋白/AAV溶液干燥，轻柔地将液滴沿光纤尖端方向引向末端，并保持注射移液管与正在干燥的液滴接触，以防止移液尖端堵塞。当第一份液滴几乎完全干燥时，再推出20纳升溶液，并继续沿锥形光纤部分引吸液滴。重复上一步骤，通过挤出少量丝素蛋白/腺相关病毒（silk/AAV）溶液，并逐渐将溶液沿锥形端向上干燥。干燥后，在高倍显微镜下评估所形成的丝素蛋白薄膜的形状和位置。对于GRIN透镜植入物的包被，将丝素蛋白/腺相关病毒（silk/AAV）溶液单次注射沉积在GRIN透镜植入物表面。干燥后，在高倍显微镜下评估所得丝素膜的形状和位置，以确保膜完全覆盖透镜表面。对于玻璃颅窗的包被，使用手动移液器将5微升丝素/AAV液滴加到直径3毫米的圆形盖玻片表面，使液滴铺展并覆盖整个玻璃表面。干燥后，将包被有丝素/AAV的光纤在植入前置于125托、4摄氏度的冷却真空干燥器中保存。荧光标记的光遗传蛋白的荧光图像可用来评估丝素蛋白/腺相关病毒（AAV）薄膜表达程度，典型的光学纤维可轻松容纳 200 纳升的丝素蛋白/AAV。经过练习，实验人员可在植入光纤尖端周围实现高度可靠的表达。包被颅窗可能存在的两个问题是表达不足，以及丝素蛋白薄膜未能溶解而遮挡视野。为了增强表达，可在植入窗口前进行硬脑膜切除术，和/或增加薄膜中的病毒量。最佳表达效果是通过使用丝素蛋白与原液滴度AAV按1:4比例混合实现的。包被窗口上的丝素蛋白含量比纤维植入物高出10至100倍，且薄膜在组织中的嵌入程度较低，因此可能不会暴露于可溶解丝素蛋白薄膜的相同水平的蛋白水解活性中。然而，某些丝素蛋白的存在对于在窗下实现目标表达至关重要，这可能是因为仅由病毒构成的薄膜在手术过程中会被组织间液冲走。在尝试该操作时，必须按照我们所述的方法制备并储存涂有丝素蛋白的植入物。不适当的储存条件可能会改变丝素蛋白膜的性质，或降低病毒表达载体的转导效率。该技术对于系统神经科学领域的研究人员具有重要价值，可用于探索神经活动如何驱动小鼠、大鼠甚至非人灵长类等哺乳动物大脑中的感觉和认知处理过程。请注意，操作病毒表达载体可能存在生物安全风险，在使用腺相关病毒时，务必佩戴手套、护目镜和实验服等个人防护装备。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

在 vivosilk/aav 薄膜在光基因表达中的靶向表达

神经科学领域近期发展出了一种结合遗传学与光学技术的工具，称为“光遗传学”，该技术能够以前所未有的空间和时间分辨率调控神经环路的活动。本文提供了一种整合光遗传学 体内...

一种用于活体中高保真光遗传学控制单个锥体神经元的方法 in vivo

本方案描述了成功实施光遗传功能磁共振成像（ofMRI）所需的步骤及数据分析方法。ofMRI 是一种新型技术，结合了高场强 fMRI...

光遗传功能磁共振成像

本文展示了一种利用磁共振（MR）引导对流增强递送（CED）将病毒载体注入猕猴大脑皮层的方法，该方法可高效、简便地实现光遗传学表达在大脑皮层大范围区域的分布。...

在在线磁共振成像引导下向恒河猴大脑皮层进行对流增强递送光遗传学腺相关病毒载体

本方案展示了一种追踪腹侧被盖区（VTA）谷氨酸能投射至海马体的简单方法。通过光刺激VTA谷氨酸能神经元并结合CA1区记录，以展示VTA谷氨酸能末梢如何在体内调节CA1区假定锥体神经元的放电频率。...

腹侧被盖区谷氨酸能神经末梢在海马中的体内解剖与功能联合示踪

本文介绍了一种利用延时共聚焦显微镜研究出生后小鼠视网膜外植体中神经突形态发生的方法。我们描述了一种稀疏标记和获取视网膜细胞类型及其细微突起的技术，该技术采用表达膜定位荧光蛋白的重组腺相关病毒载体，并以Cre依赖的方式实现特异性标记。...

利用稀疏腺相关病毒标记遗传靶向的视网膜细胞群体进行神经元分支的延时成像

目前在非人灵长类动物中实施的光遗传学技术需要向大脑内注射病毒载体。理想的注射方法应具有可靠性，并且对于许多应用而言，能够靶向任意深度的单个位点，且这些位点可在死后组织学分析中被清晰、明确地识别。本文介绍了一种具备上述特性的注射方法。...

在麻醉及清醒非人灵长类动物脑内进行光遗传学AAV载体注射

本方案描述了一种基于重组腺相关病毒（rAAV）的瞬时增强子报告基因检测方法。该检测可用于诱导由增强子驱动的基因表达 体内...

基于增强子的表达载体的AAV递送 在体 小鼠脑中

生物发光是指荧光素酶氧化小分子底物（荧光素）所发出的光，可用于激活光感应蛋白，从而为光刺激增加一个新的维度，并能够在时间和空间尺度上调控细胞中多种由光介导的功能。...

生物发光光遗传学2.0：利用生物发光激活光感受蛋白 体外 和 体内

本文介绍了一种通过光遗传学工具对特定脑区进行病毒转导的实验方案，以实现对急性啮齿类动物脑切片中特定突触的电生理特性进行表征。...

离体 光遗传学探究内侧前额叶皮层至外侧内嗅皮层的长程突触传递与可塑性

视网膜下注射是光感受器和视网膜色素上皮（RPE）疾病治疗药物临床前研发中不可或缺的技术。本文介绍一种优化的小鼠经巩膜视网膜下注射技术，可提高术中操作成功率并最大限度减少视网膜损伤。...

优化的小鼠经巩膜微创视网膜下注射技术

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体内靶向表达光遗传学蛋白的丝素蛋白/腺相关病毒薄膜应用

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