体内 靶向表达光遗传学蛋白的丝素蛋白/腺相关病毒薄膜应用

该方法有助于解答系统神经科学领域中的关键问题，例如神经元群体的活动如何支持大脑中的感觉和认知信息处理。该技术的主要优势在于，无需额外的病毒注射步骤，即可实现光遗传学蛋白（如ChR光敏通道蛋白和GCaMP）对目标脑区的精确定位。

该方法的可视化演示至关重要，因为将丝素蛋白和病毒沉积到小型光学植入物上的操作需要一定练习，才能获得可重复的结果。首先，在200微升PCR管中，按1:1的比例混合解冻的AAV与5%至7.5%的水溶性丝素蛋白。轻轻吹打溶液数次，以充分混匀AAV与丝素蛋白。

为了沉积丝素蛋白/腺相关病毒（AAV），使用注射移液管吸取所需溶液量，该体积应满足拟植入纤维的数量需求，并额外增加约30%以补偿因移液管堵塞造成的损耗。接下来，将套管固定器安装至配备有微量注射仪的立体定位仪上。将套管固定器置于微量注射仪上方，并从下方施加丝素蛋白/AAV混合物。

移动注射移液管，使其接触或接近光纤表面的中心位置，并推出10至20纳升的丝素蛋白/AAV溶液。然后撤回移液管。接着，观察平面上的丝素蛋白/AAV液滴，其呈现为液态穹顶状，在约一分钟内干燥形成平整的薄膜。

重复上述步骤，直至沉积出所需量的丝素蛋白/AAV。制备多个植入物时，先将丝素蛋白/AAV溶液涂覆在一个植入物上，然后继续涂覆其他植入物，最后再返回至第一个植入物。干燥一小时后，将整个套管架放入真空室中，在约125托、4摄氏度条件下真空干燥过夜。

次日，在高倍显微镜下评估所得丝素蛋白膜的形态和位置。确保薄膜局限于光纤表面尖端，厚度较薄且对称。对于锥形光纤的涂覆，将丝素蛋白/AAV注射移液管置于锥形起始处光纤的一侧，并确保移液管与光纤表面接触。

推出20纳升的丝素蛋白/腺相关病毒（silk/AAV）溶液以启动包被过程，确保液滴附着在光纤表面，并保持在光纤与移液尖端的界面处。随着丝素蛋白/AAV溶液干燥，轻柔地将液滴沿光纤尖端方向引向末端，并保持注射移液管与正在干燥的液滴接触，以防止移液尖端堵塞。当第一份液滴几乎完全干燥时，再推出20纳升溶液，并继续沿锥形光纤部分引吸液滴。

重复上一步骤，通过挤出少量丝素蛋白/腺相关病毒（silk/AAV）溶液，并逐渐将溶液沿锥形端向上干燥。干燥后，在高倍显微镜下评估所形成的丝素蛋白薄膜的形状和位置。对于GRIN透镜植入物的包被，将丝素蛋白/腺相关病毒（silk/AAV）溶液单次注射沉积在GRIN透镜植入物表面。

干燥后，在高倍显微镜下评估所得丝素膜的形状和位置，以确保膜完全覆盖透镜表面。对于玻璃颅窗的包被，使用手动移液器将5微升丝素/AAV液滴加到直径3毫米的圆形盖玻片表面，使液滴铺展并覆盖整个玻璃表面。干燥后，将包被有丝素/AAV的光纤在植入前置于125托、4摄氏度的冷却真空干燥器中保存。

荧光标记的光遗传蛋白的荧光图像可用来评估丝素蛋白/腺相关病毒（AAV）薄膜表达程度，典型的光学纤维可轻松容纳 200 纳升的丝素蛋白/AAV。经过练习，实验人员可在植入光纤尖端周围实现高度可靠的表达。包被颅窗可能存在的两个问题是表达不足，以及丝素蛋白薄膜未能溶解而遮挡视野。

为了增强表达，可在植入窗口前进行硬脑膜切除术，和/或增加薄膜中的病毒量。最佳表达效果是通过使用丝素蛋白与原液滴度AAV按1:4比例混合实现的。包被窗口上的丝素蛋白含量比纤维植入物高出10至100倍，且薄膜在组织中的嵌入程度较低，因此可能不会暴露于可溶解丝素蛋白薄膜的相同水平的蛋白水解活性中。

然而，某些丝素蛋白的存在对于在窗下实现目标表达至关重要，这可能是因为仅由病毒构成的薄膜在手术过程中会被组织间液冲走。在尝试该操作时，必须按照我们所述的方法制备并储存涂有丝素蛋白的植入物。不适当的储存条件可能会改变丝素蛋白膜的性质，或降低病毒表达载体的转导效率。

该技术对于系统神经科学领域的研究人员具有重要价值，可用于探索神经活动如何驱动小鼠、大鼠甚至非人灵长类等哺乳动物大脑中的感觉和认知处理过程。请注意，操作病毒表达载体可能存在生物安全风险，在使用腺相关病毒时，务必佩戴手套、护目镜和实验服等个人防护装备。