由小型环状DNA分子构建的稳定DNA序列基序、一维和二维纳米结构

该方法将DNA纳米技术的原料从线性寡核苷酸DAS扩展至一些更稳定的环状DAS。该技术的主要优势在于操作简便、稳健且大多数实验室均可负担。对于环状DNA的纯化，向 freshly prepared的完整环状DNA溶液中加入20微升甲酰胺，并用混合液定容至终体积140微升。

将16至20微升环状DNA溶液加入七到九个变性PAGE凝胶孔中。取2微升上样染料与8微升相应的前体线性DNA混合，将混合物注入一个独立的参考孔中。然后以每厘米10伏的电压电泳约2小时，当观察到二甲苯青FF迁移至凝胶约三分之二位置时停止电泳。

佩戴橡胶手套和护目镜，将凝胶转移至荧光薄层色谱板上，使用剃刀刀片根据紫外照射显示的阴影切下目标凝胶条带。将凝胶条带放入一个2毫升微量离心管中进行干燥，随后将干燥后的凝胶研磨成糊状，加入相当于凝胶体积两倍的去离子水，在室温下振荡过夜。次日早晨，将混合物过滤至另一个2毫升微量离心管中，用少量去离子水冲洗第一个离心管内壁以回收残留的DNA，并再次过滤以合并上清液。

然后通过乙醇沉淀纯化环状 DNA，并将 DNA 在 -20 摄氏度下保存。对于单管退火，取 2 微升 10 倍浓度的 Tris 乙酸盐 EDTA 镁缓冲液，每种线性与环状链的 10 微摩尔 DNA 储存液各 1 微升（按等摩尔比），并加入 Tris EDTA 缓冲液，在 200 微升 PCR 试管中混合至终体积为 20 微升。然后将组装溶液置于恒温装置中，从 95 摄氏度缓慢降温至 25 摄氏度，历时 48 小时进行退火。

对于无限晶格的两步退火，取2微升10倍浓度的Tris乙酸盐EDTA镁缓冲液，每种等摩尔比例的线性和环状DNA储备溶液（10微摩尔/升）各1微升，加入Tris EDTA缓冲液，在200微升PCR试管中混合，最终体积为20微升。在第一步亚单元退火过程中，将各前体亚单元溶液置于PCR仪中，采用快速线性降温法，从95摄氏度降至25摄氏度，耗时两个半小时。为制备组装溶液，针对四种无限晶格中的每一种，将相应两种亚单元溶液各取10微升混合，使每条链的最终浓度为0.25微摩尔/升。

在第二次晶格退火步骤中，使用PCR仪通过缓慢冷却方法对20微升混合物进行退火。对于两个有限矩形晶格的两步退火，取1微升10倍浓度的Tris乙酸盐EDTA镁缓冲液，0.5微升每种10微摩尔的DNA储备溶液（线性链与环状链按等摩尔比例组成的一组），并加入额外的Tris EDTA缓冲液，在200微升PCR试管中混合，最终体积为10微升。在第一次退火步骤中，使用快速线性冷却方法，在PCR仪中对每种前体亚单元溶液进行退火，如示例所示，从95°C降至25°C，耗时两个半小时，然后将退火后的32种亚单元溶液（每种2微升）混合于一个200微升PCR试管中，最终体积为64微升。

然后，在第二次退火步骤中，使用热循环仪采用慢速降温法对64微升混合物进行退火，操作如示。为了对有限晶格进行电泳纯化，制备一块天然2%琼脂糖凝胶，将20微升有限晶格溶液加入每一加样孔中，并在另一独立加样孔中加入5微升100至3000碱基对的DNA分子量标记物。在冰水浴中以每厘米5伏电压电泳运行两小时后，在紫外光下根据1000碱基对标记物的位置切下目标凝胶条带（操作如示），并将凝胶条带切成细小碎片。

将破碎的凝胶放入过滤柱中，离心柱子以提取晶格。然后收集溶液用于原子力显微镜成像。对于通过聚乙二醇（PEG）进行的有限晶格纯化，取50微升有限晶格溶液与等体积的15% PEG 8000缓冲液混合，离心溶液，再将沉淀重悬于100微升PEG缓冲液中，进行额外一次离心。

第二次离心后，将沉淀重悬于Tris乙酸盐EDTA镁缓冲液中，用于原子力显微镜成像。对于无限二维晶格的原子力显微镜成像，需剥离出一层新鲜的云母表面，并将2微升退火后的样品滴加到洁净的云母表面上。让DNA晶格在云母表面吸附2分钟，然后用去离子水洗涤表面两次，每次洗涤使用100微升，第二次洗涤后用压缩空气吹干表面。

为了在空气中获得无限DNA晶格的原子力显微镜图像，请在成像软件中开启轻敲模式，将扫描尺寸设置为0.5至5微米，扫描分辨率为512线，扫描速率设置在1至3.5赫兹之间。然后，使用三角形原子力显微镜探针扫描云母表面。对于有限DNA晶格的成像，如示例所示，需剥离一层新鲜的云母，并将80微升一倍浓度的Tris乙酸盐EDTA镁缓冲液滴加到洁净的云母表面上。

接下来，将五微升的有限样品加入缓冲液中，使DNA晶格在云母表面吸附两分钟，然后向探针中再加入50微升Tris乙酸盐EDTA镁缓冲液。随后，将扫描尺寸设置为0.5至1微米，扫描分辨率为256行，扫描速率为1.5赫兹，然后使用三角形探针扫描表面，如图所示。在变性PAGE中，环状DNA的迁移速度略慢于其前体线性DNA，因为凝胶纤维会穿透并阻碍环状DNA内部的孔洞。

64个核苷酸的环状组装家族每种组装仅有一条清晰而单一的条带，证实了其单体结构单元的稳定性。然而，由84个核苷酸组成的环状组装家族则在主条带周围出现弥散信号，表明存在少量副产物。尽管存在这些错误结合产生的副产物，仍可利用目标单体结构单元高效组装出产量高且质量优良的晶格结构。

每种组装结构在微米尺度下都具有独特的形态特征，例如纳米线、纳米管、纳米螺旋、纳米带和纳米矩形。在进行该操作时，需特别注意避免在步骤中或步骤间引入碎屑污染。该技术发展后，为DNA纳米技术领域的研究开辟了新途径，使研究人员能够探索更多新型环状DNA纳米结构家族成员。