Name: 由小圆形 DNA 分子构建的稳定 DNA 分子、一维和二维纳米结构 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 学习利用T4连接酶和变性PAGE纯化技术构建稳定的小环形DNA分子，并通过原子力显微镜成像分析一维和二维DNA纳米结构。该方法简单、稳健且成本低廉，适用于大多数实验室开展DNA纳米技术研究。

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感谢国家自然科学基金（项目编号：91753134 和 21571100）以及东南大学生物电子学国家重点实验室提供的经费支持。

1. 环状DNA的制备
<ol>
	<li>直接使用商业公司提供的所有线性DNA，无需进一步纯化。</li>
	<li>将DNA样品在5,000 × g离心5分钟，使所有DNA沉淀聚集于管底。加入适量TE缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 8.0）溶解DNA。</li>
	<li>使用微量紫外分光光度计在260 nm处测定每种ss-DNA溶液的浓度为&#34;a&#34; ng/µL。根据公式 b = a × 103 /（DNA链的分子量），将&#34;a&#34; ng/µL转换为&#34;b&#34; µM。调节TE溶液的用量，配制10 µM的DNA储备液。</li>
	<li>直接使用T4 DNA连接酶连接商业公司提供的c64nt、c74nt和c84nt的5'-磷酸化线性DNA模板的3'和5'末端（图1）。</li>
	<li>在200 µL PCR管中，将5'-磷酸化线性DNA链（3.5 µM）与其对应的splint DNA链（4.5 µM）混合于80 µL TE缓冲液中15。将该管置于装有95 °C热水的敞口保温瓶中，让热水在实验室环境下自然冷却至室温（25 °C），耗时约2–3小时。</li>
	<li>向混合物中加入10 µL 10× T4缓冲液（660 mM Tris-HCl，66 mM MgCl2，100 mM DTT，1 mM ATP）和10 µL T4连接酶（300 U/µL），终体积为100 µL。将混合物置于PCR仪中，在16 °C孵育16小时。 
	注意：上述DNA浓度和约100 µL的反应体积已优化，以实现高效的连接反应和高产率的正确寡聚单体环化。&#160;根据实验设计，同时进行两管或更多管连接反应。替代步骤1.6的连接孵育程序为在25 °C孵育4小时。</li>
	<li>孵育结束后，将反应管置于95 °C水中5分钟以灭活T4连接酶。随后将管转移至冰水浴中，继续孵育5分钟以冷却。</li>
	<li>向淬灭后的混合物中加入10 µL 10×外切酶I缓冲液和10 µL外切酶I（5 U/µL），在37 °C水浴中孵育30分钟，以选择性消化残留的线性DNA，保留环状DNA完整。</li>
	<li>制备10%变性PAGE凝胶。
	<ol>
		<li>在通风橱中配制PAGE凝胶时佩戴橡胶手套和护目镜。在40 mL离心管中加入6.67 mL 30%（w/v）丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（19:1）、2 mL 10× TAE·Mg缓冲液（40 mM Tris，40 mM HAc，1 mM EDTA，pH 8.0，12.5 mM Mg(Ac)2）、8.4 g尿素（7 M），并用去离子水定容至20 mL。 
		&#8203;注意：30%（w/v）丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（19:1）具有毒性。</li>
		<li>在将凝胶溶液立即转移至电泳系统前，向40 mL管中加入20 µL四甲基乙二胺（TEMED）和100 µL过硫酸铵（APS，10% w/v）。插入1.5 mm厚、10孔梳子。静置至少20分钟，直至凝胶完全凝固。</li>
		<li>对尺寸为85 × 80 × 1.5 mm3（宽×高×厚）的凝胶设置恒定电压80 V。向电泳系统中加入1× TAE·Mg缓冲液，并以10 V/cm预电泳20分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将步骤1.8中的PCR管置于95 °C水中5分钟，以灭活外切酶I。随后将管转移至冰水浴中，再孵育5分钟。</li>
	<li>向管中加入20 µL甲酰胺，终体积为140 µL，并混匀。将溶液等量分配至7–9个变性PAGE凝胶孔中，每孔16–20 µL。取8 µL对应的前体线性DNA（10 µM）与2 µL上样染料（0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯蓝FF，60%甘油，10 mM Tris-HCl，60 mM EDTA，pH 7.6）混合，注入单独一孔作为参照。 
	注意：加入甲酰胺可增加上样溶液的密度，使其沉入PAGE凝胶孔底部，同时有助于解离部分双链DNA残留物。</li>
	<li>以10 V/cm电压电泳约2小时，当肉眼观察到二甲苯蓝FF迁移至玻璃板2/3位置时停止电泳。</li>
	<li>佩戴橡胶手套和护目镜以保护皮肤和眼睛。将凝胶从玻璃板中取出，置于荧光薄层色谱（TLC）板上。在紫外照射下，用剃刀精确切割目标条带（图2）。 
	注意：紫外光对眼睛和皮肤有害。 
	注意：在254 nm紫外照射下，DNA吸收光线并在TLC板上投下阴影。环状DNA的迁移速度略慢于其对应的前体线性DNA。若收集时包含目标条带周围少量未消化的线性DNA或非目标环状DNA，将污染目标环状DNA。</li>
	<li>将凝胶条带转移至2.0 mL微量离心管中。风干或吹干凝胶条带，然后用刮刀或压平的玻璃棒将其研磨成糊状。确保凝胶完全粉碎成糊状，这对获得高产量环状DNA至关重要。向管中加入相当于凝胶体积两倍的去离子水，室温下震荡过夜。</li>
	<li>过滤混合物，将上清液收集至2.0 mL微量离心管中。用少量去离子水冲洗残留DNA，再次过滤并将上清液合并。&#160;</li>
	<li>用等体积正丁醇萃取洗脱液。重复此步骤，直至水相体积减少至约200 µL。</li>
	<li>向混合物中加入500 µL无水乙醇（−20 °C）和20 µL 3 M NaOAc（pH 5.1）以沉淀DNA。将管置于−20 °C保存30分钟。</li>
	<li>在4 °C、12,000 × g离心10分钟，弃去上清液。管中剩余的DNA沉淀约为100 µL。</li>
	<li>向管中加入600 µL 75%乙醇（−20 °C），在−20 °C保存30分钟。然后在4 °C、12,000 × g离心10分钟，弃去上清液。管中再次剩余约100 µL溶液。重复该步骤两次。</li>
	<li>最后一次离心后，尽可能弃尽上清液，用真空浓缩仪干燥残留物。</li>
	<li>将纯化的环状DNA储存于−20 °C。</li>
	<li>根据步骤1.3，按需将环状DNA重悬于TE缓冲液中，配制成10 µM的环状DNA储备液。</li>
</ol>
2. 连接反应体系的退火
<ol>
	<li>使用设计好的线性和环状DNA组合，为c64bp、c84bp、HJ-c64nt、aHJ-c64nt、HJ-c84nt、tHJ-c84nt、cDAO-c64nt、acDAO-c64nt、cDAO-c84nt、c64nt、c84nt和acDAO-c64nt-E的每种瓦片或纳米结构组装溶液进行一锅退火制备。
	<ol>
		<li>对于每种组装溶液，取2 µL 10x TAE·Mg缓冲液，等摩尔比例的线性与环状DNA各1 µL，加入TE缓冲液，在200 µL PCR管中混合，使每条链的终浓度为0.5 µM，终体积为20 µL。将组装溶液置于恒温瓶中，于48小时内从95 °C退火至25 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为两步退火设计并制备每种由线性与环状DNA组成的cDAO-c64nt-E、cDAO-c64nt-O、cDAO-c84nt-E和cDAO-c84nt-O二维无限晶格的组装溶液。
	<ol>
		<li>通过在200 µL PCR管中混合2 µL 10x TAE·Mg缓冲液、每种线性和环状DNA链的储备液各1 µL（各链摩尔比相等），并加入额外的TE缓冲液，配制每种前体亚单元组装溶液，使每条链的终浓度为0.5 µM，终体积为20 µL。在第一阶段亚单元退火步骤中，使用PCR仪以快速线性降温程序，将每种前体亚单元溶液从95 °C在2.5小时内逐步降温至25 °C进行退火。</li>
		<li>通过混合制备上述四种无限晶格的每种组装溶液&#160;将两种对应的子图块溶液各取10 µL混合，使每条链的终浓度为0.25 µM。在第二步晶格退火中，将20 µL混合液置于PCR仪中，采用缓慢冷却程序：于50 °C保持2小时，随后以每5分钟降低0.1 °C的速率降温至20 °C，全程约24小时。 
		注意：对于每个二维无限晶格，在第二次退火步骤中可同时或依次进行两个平行实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备两种有限矩形组装体的组装溶液：5 × 6 cDAO-c64nt-O 和 5 × 6 cDAO-c74&amp;#38;c84nt-O，用于两步退火。
	<ol>
		<li>通过在200 µL PCR管中混合1 µL 10x TAE·Mg缓冲液、每种线性和环状DNA链的储备溶液各0.5 µL（按等摩尔比例），并加入TE缓冲液，配制每种前体亚砖组装溶液，使每条链的终浓度为0.5 µM，终体积为10 µL。在第一退火步骤中，使用PCR仪以快速线性降温法将每种前体亚砖溶液从95 °C降温至25 °C，耗时2.5 h进行退火。</li>
		<li>通过将32份（每份2 µL的亚单元溶液）混合于一个200 µL的PCR管中，配制每种有限矩形晶格组装溶液，使每种亚单元的终浓度约为15 nM，终体积为64 µL。在第二步退火过程中，将64 µL混合液置于PCR仪中，采用缓慢降温程序：在50 °C保持2小时，随后以每5分钟降低0.1 °C的速率降温至20 °C，全程约需24小时。 
		注意：在每个有限矩形组装的第二次退火步骤中，可同时或依次进行五组平行实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 天然PAGE分析
<ol>
	<li>按照步骤1.9制备10%非变性PAGE胶，但不添加尿素组分。</li>
	<li>对于c64bp和c84bp的对照样品，分别将2 µL的每种组装溶液与1 µL上样染料加入3 µL TE缓冲液中作为对照。对于图3中列出的其他每种组装体系，将1 µL的每种组装溶液与1 µL上慢染料加入4 µL TE缓冲液中。</li>
	<li>将上述每种溶液注入凝胶加样孔中，并在另一独立加样孔中加入5 µL DNA Marker（25-500 bp）作为参照。</li>
	<li>在冰水浴中以10 V/cm的电压电泳约4小时。二甲苯青FF将迁移出玻璃板。</li>
	<li>佩戴橡胶手套和护目镜以保护皮肤和眼睛。将凝胶从玻璃板中取出，浸入含10 µL核酸凝胶染料的100 mL去离子水中染色30分钟。 
	注意：核酸凝胶染料溶液具有毒性。</li>
	<li>在紫外成像系统下观察凝胶，并拍摄染色后的凝胶图像（图3）。</li>
</ol>
4. 有限晶格的纯化
<ol>
	<li>制备2%的天然琼脂糖凝胶，用于有限晶格的电泳纯化。
	<ol>
		<li>在250 mL三角瓶中混合1 g琼脂糖粉末、5 mL 10× TBE·Mg缓冲液（89 mM Tris，89 mM 硼酸，2 mM EDTA，pH 8.0，12.5 mM Mg(Ac)2）、2 µL核酸凝胶染料和47.5 mL去离子水。加热煮沸至气泡变小且密集。向瓶中加入热水，使总体积达到50 mL，琼脂糖终浓度为2%。</li>
		<li>佩戴厚手套。将凝胶溶液倒入尺寸为7 × 10 × 1 cm3（宽×长×厚）的塑料凝胶槽中。插入1.5 mm厚、12孔的梳子。等待凝胶冷却至室温。如有需要，可将凝胶置于4 °C冰箱中。 
		注意：溶液温度很高，谨防烫伤。</li>
		<li>在电泳系统中加入0.5× TBE·Mg缓冲液。在冰水浴中以5 V/cm的电压预电泳20分钟，保持恒定电压50 V。</li>
		<li>在每个琼脂糖凝胶孔中加入20 µL步骤2.3制备的有限晶格溶液，并在另一孔中加入5 µL DNA Marker（100–3,000 bp）。在冰水浴中以5 V/cm的电压电泳2小时。</li>
		<li>佩戴橡胶手套和护目镜以保护皮肤和眼睛。在紫外光下切取位置与1,000 bp Marker相近的目标凝胶条带，将其切成细小碎片，并将破碎的凝胶放入过滤柱中8。</li>
		<li>在4 °C下以2,000 × g离心5分钟。通过过滤柱收集样品溶液。收集洗脱液用于原子力显微镜（AFM）成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过PEG沉淀法纯化有限晶格。
	<ol>
		<li>将50 µL步骤2.3制备的有限晶格溶液与等体积的15% PEG8000（w/v）缓冲液（20 mM Mg(Ac)2，5 mM Tris，1 mM EDTA和505 mM NaCl）22混合。在4 °C下以18,000 × g离心30分钟。</li>
		<li>弃去上清液，加入100 µL PEG缓冲液。重复离心操作。</li>
		<li>弃去上清液后，将沉淀溶解于1× TAE·Mg缓冲液中，用于AFM成像。 
		注意：对于5 × 6 cDAO-c64nt-O和5 × 6 cDAO-c74&amp;#38;c84nt-O有限晶格，AFM成像及其他应用前必须进行纯化。若产量过低，可提高离心速度；若产物纯度不足，需重复步骤4.2.2。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 原子力显微镜成像
<ol>
	<li>对于 c64nt 纳米线、c84nt 纳米线、acDAO-c64nt-E 以及无限二维晶格 cDAO-c64nt-E(O) 和 cDAO-c84nt-E(O)，取 2 μL 退火后的样品滴加至新解理的云母表面。静置 2 分钟，使 DNA 晶格吸附到云母表面。用 100 µL 去离子水清洗表面两次，并用压缩空气吹干。</li>
	<li>在空气中获取无限 DNA 晶格的原子力显微镜（AFM）图像：使用三角形 AFM 探针在轻敲模式下扫描云母表面。设定以下扫描参数：扫描尺寸为 0.5~5 µm，扫描分辨率为 512 行，扫描速率为 3.5 Hz（图 4）。</li>
	<li>对于 5 × 6 的有限 DNA 晶格 cDAO-c64nt-O 和 5 × 6 的 cDAO-c74&amp;#38;c84nt-O，&#160;在新解理的云母表面滴加 80 µL 的 1× TAE·Mg 缓冲液，然后向其中加入 5 µL 有限样品。静置 2 分钟，使 DNA 晶格吸附到云母表面。再向 AFM 探针上加入 50 µL 的 1× TAE·Mg 缓冲液。</li>
	<li>在液体环境中获取有限 DNA 晶格的 AFM 图像：使用三角形 AFM 探针在轻敲模式下扫描云母表面。设定以下扫描参数：扫描尺寸为 0.5-1 µm，扫描分辨率为 256 行，扫描速率为 1.5 Hz（图 5）。</li>
</ol>

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<li>Slater, G. W., Noolandi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+biased+reptation+model+for+charged+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">New biased reptation model for charged polymers.</a> Physical Review Letters. 55 (15), 1579(1985).</li>
<li>Lilley, D. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+branched+nucleic+acid+structure+using+comparative+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Analysis of branched nucleic acid structure using comparative gel electrophoresis.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 41 (1), 1-39 (2008).</li>
<li>Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+high-resolution+imaging+of+native+proteins+by+force-distance+curve-based+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve-based AFM.</a> Nature Protocols. 9 (5), 1113-1130 (2014).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文介绍的实验方案主要聚焦于小环状DNA分子的合成以及DNA纳米结构的组装。大多数随机测序得到的DNA设计均可用于本方案。环状DNA的纯度对于DNA组装的成功至关重要。通过降低5'-磷酸化线性DNA的浓度，可以提高环化反应的产率；然而，这将增加获得相同数量环状DNA所需的工作量。连接引导DNA链（splint DNA）的长度也会影响连接反应的准确性，针对c64nt和c84nt，其长度优化为约20个核苷酸。
适量的镁离子（例如在组装过程中及组装完成后，溶液中镁离子浓度（12.5 mM）对于DNA纳米结构的形成与维持至关重要。因此，在退火、天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）、琼脂糖凝胶电泳以及聚乙二醇缓冲液离心纯化、原子力显微镜（AFM）成像等各个环节中，始终维持12.5 mM的镁离子浓度。 等等. 
对于5 × 6 cDAO-c64nt-O和5 × 6 cDAO-c74&amp;84nt-O的有限矩形组装体，琼脂糖凝胶纯化不会影响其结构细节，而聚乙二醇缓冲液离心纯化则会破坏高分辨...

几十年来，DNA分子已被用于构建多种纳米结构。典型的结构基元包括DAE（双交叉、反平行、偶数半圈）和DAO瓦片1,2,3、星形瓦片4,5,6,7、单链（ss）瓦片8,9,10以及DNA折纸结构11,12,13。这些DNA基元和晶格由线性单链DNA组装而成。最近，我们及其他研究者报道了使用环状单链寡核苷酸作为支架来构建基元、一维纳米管和二维晶格的方法14,15,16,17。通过在c64nt中心插入一个Holliday连接体（HJ）18,19,20,21，可形成一对耦合的DAO瓦片17。这种新型cDAO基元及其衍生物具有足够的稳定性和刚性，能够组装出最大达3 × 5 µm2的二维DNA晶格。本文中，我们使用术语&#34;环形瓦片&#34;，定义为由一条环状支架链和若干线性订书钉链（单链寡核苷酸）构成的稳定DNA复合分子；同时使用另一术语&#34;线性瓦片&#34;，指完全由一组线性单链寡核苷酸构建而成的结构。
本实验方案展示了如何利用小环状DNA分子作为支架构建五种DNA纳米结构：1）无限一维c64nt和c84nt纳米线，2）无限二维cDAO-c64nt-O和cDAO-c64nt-E晶格（-O表示5个半螺旋的奇数&#160;，-E表示4个半螺旋的偶数&#160;），3）无限二维cDAO-c84nt-O和cDAO-c84nt-E晶格，4）有限二维5 × 6 cDAO-c64nt-O和5 × 6 cDAO-c74&amp;#38;84nt-O矩形晶格，5）无限一维acDAO-c64nt-E纳米环和纳米螺旋（上述五种DNA纳米结构的示意图和图像请参见图&#160;3-5）。一维c64nt和c84nt纳米线分别由c64nt和c84nt支架与两条线性订书钉链组装而成。cDAO-c64nt、acDAO-c64nt、cDAO-c74nt或&#160;cDAO-c84nt的每个环状单元均由对应的c64nt、c74nt或c84nt支架与四条线性订书钉链分别退火形成。无限二维晶格由两种序列不同的相同类型环状单元组装而成。两种有限二维矩形晶格分别由两&#160;组各32个环状子单元组装而成。为节约成本，在第一轮子单元退火步骤中，仅使用一种序列的c64nt、c74nt和c84nt作为各自的支架，通过不同的突出端分别退火生成32个cDAO-c64nt、12个cDAO-c74nt和20个cDAO-c84nt环状子单元；随后将相应的32个环状子单元混合，并进行第二轮晶格退火步骤，分别组装成有限的5 × 6 cDAO-c64nt-O和5 × 6 cDAO-c74&amp;#38;84nt-O晶格。当然，也可采用不同序列的环状支架来组装多种有限尺寸的纳米结构，但这将增加成本和实验工作量。无限一维acDAO-c64nt-E纳米环和纳米螺旋由一种序列的非对称acDAO-c64nt单元通过偶数个（4个）半螺旋的线性连接退火形成。从cDAO-c64nt和cDAO-c84nt环状单元组装无限二维晶格有两种方法，其区别在于单元间连接分别为偶数个（4个）和奇数个（5个）半螺旋。前者要求所有单元以相同方向排列；后者则要求沿螺旋轴方向相邻两个单元的朝向交替排列。若单元刚性且呈平面结构（如cDAO-c64nt），两种方法均生成平面纳米带；若单元向单一方向弯曲（如cDAO-c84nt），则偶数个（4个）半螺旋的单元间连接将形成纳米管，而奇数个（5个）半螺旋的单元间连接由于弯曲单元的交替&#160;排列消除了曲率偏向生长，因而生成平面纳米带。由环状单元成功组装一维和二维DNA纳米结构表明该新方法具有若干优势：环状单元相比线性单元具有更高的稳定性和刚性，可提供手性单元用于组装非对称纳米结构（如纳米环和纳米带），为理解DNA力学性质和分子结构提供了新的视角，等等。

<table><tbody><tr><td>T4 连接酶</td><td>TaKaRa</td><td>2011A</td><td></td></tr><tr><td>T4 缓冲液</td><td>TaKaRa</td><td>2011A</td><td></td></tr><tr><td>TE 缓冲液</td><td>Sangon</td><td>B548106</td><td></td></tr><tr><td>保温瓶</td><td>Thermos</td><td>SK-3000</td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Bio Gener</td><td>GE4852T</td><td></td></tr><tr><td>外切酶 I</td><td>TaKaRa</td><td>2650A</td><td></td></tr><tr><td>外切酶 I 缓冲液</td><td>TaKaRa</td><td>2650A</td><td></td></tr><tr><td>30% (w/v) 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 (19:1)</td><td>Sangon</td><td>B546016</td><td></td></tr><tr><td>TAE 预混粉末</td><td>Sangon</td><td>B540023</td><td></td></tr><tr><td>Mg(Ac)2&amp;middot;4H2O</td><td>南京化学试剂</td><td>C0190550223</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sangon</td><td>A510907</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BBI</td><td>A100761</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>南京化学试剂</td><td>13041920295</td><td></td></tr><tr><td>电源</td><td>北京六一</td><td>DYY-8C</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Sumsung</td><td>DK-S12</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>BBI</td><td>A100314</td><td></td></tr><tr><td>DNA Marker (25~500 bp)</td><td>Sangon</td><td>B600303</td><td></td></tr><tr><td>DNA Marker (100~3000 bp)</td><td>Sangon</td><td>B500347</td><td></td></tr><tr><td>上样缓冲液</td><td>Sangon</td><td>B548313</td><td></td></tr><tr><td>PAGE 电泳系统</td><td>北京六一</td><td>24DN</td><td></td></tr><tr><td>滤膜</td><td>ASD</td><td>5010-2225</td><td>0.22 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>紫外成像系统</td><td>Tanon</td><td>2500R</td><td></td></tr><tr><td>正丁醇</td><td>Sangon</td><td>A501800</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>SCR</td><td>10009257</td><td></td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>南京化学试剂</td><td>12032610459</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>eppendorf</td><td>Centrifuge 5424R</td><td></td></tr><tr><td>真空浓缩仪</td><td>CHRIST</td><td>RVC 2-18</td><td></td></tr><tr><td>紫外分光光度计</td><td>Allsheng</td><td>Nano-100</td><td></td></tr><tr><td>核酸染料</td><td>Biotium</td><td>16G1010</td><td>GelRed</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Biowest</td><td>G-10</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖电泳系统</td><td>北京六一</td><td>DYCP-31CN</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>江苏金坛</td><td>DB-1</td><td></td></tr><tr><td>TBE 预混粉末&amp;nbsp;</td><td>Sangon</td><td>B540024</td><td></td></tr><tr><td>过滤柱</td><td>Bio-Rad</td><td>7326165</td><td>Freeze 'N Squeeze 柱</td></tr><tr><td>AFM</td><td>Bruker</td><td>Dimension FastScan</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>BBI</td><td>A100159</td><td></td></tr><tr><td>云母片</td><td>Ted Pella</td><td>BP50</td><td></td></tr><tr><td>空气中使用的三角形 AFM 探针</td><td>Bruker</td><td>FastScan-C</td><td></td></tr><tr><td>液体中使用的三角形 AFM 探针</td><td>Bruker</td><td>ScanAsyst-fluid+</td><td></td></tr><tr><td>DNA 单链</td><td>Sangon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

由小型环状dna分子构建的稳定dna序列基序、一维和二维纳米结构

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

本文介绍了一种合成小型环状DNA分子、退火环状DNA结构单元以及构建一维和二维DNA纳米结构的详细实验方案。数十年来，DNA纳米技术的快速发展主要得益于线性DNA作为起始材料的应用。例如，DAO（双交叉、反平行、奇数半转）瓦片是构建二维DNA晶格的知名结构单元；DAO的核心结构由两条线性单链寡核苷酸组成，类似于两条绳索打成一个右旋 granny 结&#160;结。本文介绍一种新型DNA瓦片，称为cDAO（耦合DAO），其以长度为c64nt或c84nt（即64或84个核苷酸的环状单链DNA）的小型环状单链DNA作为支架链，以多条线性单链DNA作为订书链构建而成。利用cDAO瓦片可组装出完美的1D和2D纳米结构，包括无限延伸的纳米线、纳米螺旋、纳米管、纳米带以及有限尺寸的纳米矩形。文中详细描述了实验方案：1）通过T4连接酶制备小型环状寡核苷酸，并采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行纯化；2）退火形成稳定的环状瓦片，随后进行非变性PAGE分析；3）组装无限延伸的1D结构（纳米线、纳米环、纳米螺旋）、无限延伸的2D结构（纳米管和纳米带的晶格）以及有限尺寸的2D纳米矩形，随后通过原子力显微镜（AFM）成像进行表征。该方法简便、稳健且成本较低，适用于大多数实验室。

关键词：cDAO，环状DNA，DNA纳米技术，纳米结构，T4连接酶，PAGE，原子力显微镜，AFM，纳米线，纳米螺旋，纳米管，纳米带，纳米矩形

环状DNA在变性PAGE中的迁移速度略慢于其前体线性DNA图2因为环状DNA内部的孔洞被凝胶纤维穿透并阻碍23,24,25寡聚单体环化的正确连接反应效率取决于底物序列和浓度、反应温度、时间， 等等. 当前体线性DNA的浓度足够高，大约在 3.5 µM在本方案中，c64nt（或c84nt）的环化产物以及前体参照物可在紫外光下直接于TLC板上以条带形式显现，无需染色。若环状DNA条带模糊或不可见，表明连接反应失败或产物得率极低。有时在前体线性条带上方会出现两条条带，提示除正确的寡聚单体环外还存在寡聚二聚体环。此时应忽略上方条带，仅收集下方条带。经真空干燥后，纯化后的环状DNA产物在离心管中呈白色粉末状。除变性PAGE外，DNA纯度也可通过紫外分光光度计测定。DNA的吸收峰位于260 nm。DNA纯度的两个标准指标为...

本文介绍了一种小环状DNA分子的T4连接与变性聚丙烯酰胺凝胶纯化、环状瓦片的退火与非变性聚丙烯酰胺凝胶分析、一维和二维DNA纳米结构的组装与原子力显微镜成像，以及有限DNA纳米结构的琼脂糖凝胶电泳与离心纯化等详细实验方案。

由小型环状DNA分子构建的稳定DNA序列基序、一维和二维纳米结构

本文介绍了一种合成小环状DNA分子、环状DNA结构退火以及构建一维和二维DNA纳米结构的详细实验方案。

该方法将DNA纳米技术的原料从线性寡核苷酸DAS扩展至一些更稳定的环状DAS。该技术的主要优势在于操作简便、稳健且大多数实验室均可负担。对于环状DNA的纯化，向 freshly prepared的完整环状DNA溶液中加入20微升甲酰胺，并用混合液定容至终体积140微升。将16至20微升环状DNA溶液加入七到九个变性PAGE凝胶孔中。取2微升上样染料与8微升相应的前体线性DNA混合，将混合物注入一个独立的参考孔中。然后以每厘米10伏的电压电泳约2小时，当观察到二甲苯青FF迁移至凝胶约三分之二位置时停止电泳。佩戴橡胶手套和护目镜，将凝胶转移至荧光薄层色谱板上，使用剃刀刀片根据紫外照射显示的阴影切下目标凝胶条带。将凝胶条带放入一个2毫升微量离心管中进行干燥，随后将干燥后的凝胶研磨成糊状，加入相当于凝胶体积两倍的去离子水，在室温下振荡过夜。次日早晨，将混合物过滤至另一个2毫升微量离心管中，用少量去离子水冲洗第一个离心管内壁以回收残留的DNA，并再次过滤以合并上清液。然后通过乙醇沉淀纯化环状 DNA，并将 DNA 在 -20 摄氏度下保存。对于单管退火，取 2 微升 10 倍浓度的 Tris 乙酸盐 EDTA 镁缓冲液，每种线性与环状链的 10 微摩尔 DNA 储存液各 1 微升（按等摩尔比），并加入 Tris EDTA 缓冲液，在 200 微升 PCR 试管中混合至终体积为 20 微升。然后将组装溶液置于恒温装置中，从 95 摄氏度缓慢降温至 25 摄氏度，历时 48 小时进行退火。对于无限晶格的两步退火，取2微升10倍浓度的Tris乙酸盐EDTA镁缓冲液，每种等摩尔比例的线性和环状DNA储备溶液（10微摩尔/升）各1微升，加入Tris EDTA缓冲液，在200微升PCR试管中混合，最终体积为20微升。在第一步亚单元退火过程中，将各前体亚单元溶液置于PCR仪中，采用快速线性降温法，从95摄氏度降至25摄氏度，耗时两个半小时。为制备组装溶液，针对四种无限晶格中的每一种，将相应两种亚单元溶液各取10微升混合，使每条链的最终浓度为0.25微摩尔/升。在第二次晶格退火步骤中，使用PCR仪通过缓慢冷却方法对20微升混合物进行退火。对于两个有限矩形晶格的两步退火，取1微升10倍浓度的Tris乙酸盐EDTA镁缓冲液，0.5微升每种10微摩尔的DNA储备溶液（线性链与环状链按等摩尔比例组成的一组），并加入额外的Tris EDTA缓冲液，在200微升PCR试管中混合，最终体积为10微升。在第一次退火步骤中，使用快速线性冷却方法，在PCR仪中对每种前体亚单元溶液进行退火，如示例所示，从95°C降至25°C，耗时两个半小时，然后将退火后的32种亚单元溶液（每种2微升）混合于一个200微升PCR试管中，最终体积为64微升。然后，在第二次退火步骤中，使用热循环仪采用慢速降温法对64微升混合物进行退火，操作如示。为了对有限晶格进行电泳纯化，制备一块天然2%琼脂糖凝胶，将20微升有限晶格溶液加入每一加样孔中，并在另一独立加样孔中加入5微升100至3000碱基对的DNA分子量标记物。在冰水浴中以每厘米5伏电压电泳运行两小时后，在紫外光下根据1000碱基对标记物的位置切下目标凝胶条带（操作如示），并将凝胶条带切成细小碎片。将破碎的凝胶放入过滤柱中，离心柱子以提取晶格。然后收集溶液用于原子力显微镜成像。对于通过聚乙二醇（PEG）进行的有限晶格纯化，取50微升有限晶格溶液与等体积的15% PEG 8000缓冲液混合，离心溶液，再将沉淀重悬于100微升PEG缓冲液中，进行额外一次离心。第二次离心后，将沉淀重悬于Tris乙酸盐EDTA镁缓冲液中，用于原子力显微镜成像。对于无限二维晶格的原子力显微镜成像，需剥离出一层新鲜的云母表面，并将2微升退火后的样品滴加到洁净的云母表面上。让DNA晶格在云母表面吸附2分钟，然后用去离子水洗涤表面两次，每次洗涤使用100微升，第二次洗涤后用压缩空气吹干表面。为了在空气中获得无限DNA晶格的原子力显微镜图像，请在成像软件中开启轻敲模式，将扫描尺寸设置为0.5至5微米，扫描分辨率为512线，扫描速率设置在1至3.5赫兹之间。然后，使用三角形原子力显微镜探针扫描云母表面。对于有限DNA晶格的成像，如示例所示，需剥离一层新鲜的云母，并将80微升一倍浓度的Tris乙酸盐EDTA镁缓冲液滴加到洁净的云母表面上。接下来，将五微升的有限样品加入缓冲液中，使DNA晶格在云母表面吸附两分钟，然后向探针中再加入50微升Tris乙酸盐EDTA镁缓冲液。随后，将扫描尺寸设置为0.5至1微米，扫描分辨率为256行，扫描速率为1.5赫兹，然后使用三角形探针扫描表面，如图所示。在变性PAGE中，环状DNA的迁移速度略慢于其前体线性DNA，因为凝胶纤维会穿透并阻碍环状DNA内部的孔洞。64个核苷酸的环状组装家族每种组装仅有一条清晰而单一的条带，证实了其单体结构单元的稳定性。然而，由84个核苷酸组成的环状组装家族则在主条带周围出现弥散信号，表明存在少量副产物。尽管存在这些错误结合产生的副产物，仍可利用目标单体结构单元高效组装出产量高且质量优良的晶格结构。每种组装结构在微米尺度下都具有独特的形态特征，例如纳米线、纳米管、纳米螺旋、纳米带和纳米矩形。在进行该操作时，需特别注意避免在步骤中或步骤间引入碎屑污染。该技术发展后，为DNA纳米技术领域的研究开辟了新途径，使研究人员能够探索更多新型环状DNA纳米结构家族成员。

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