利用酵母中多聚谷氨酰胺毒性检测评估荧光蛋白对融合伴侣的影响

该方法有助于解答荧光蛋白领域中的关键问题，例如荧光蛋白如何影响其融合伴侣。该技术的主要优势在于能够快速且易于扩展地评估荧光蛋白及其融合伴侣的作用。尽管该方法可用于研究荧光蛋白的行为，也可应用于其他基因编码标签的研究。

此外，来自西安大略大学的研究生 Sonja Di Gregorio 将演示该实验流程。通过此方法检测的每种荧光蛋白，首先被克隆至酵母表达载体中，该载体编码一种可由半乳糖诱导的、带有 FLAG 标签的 HTT 第一外显子，其包含非毒性 25Q 重复序列或与亨廷顿病相关的毒性 72Q 重复序列。克隆体经筛选后通过测序验证，并随后转化至酵母中。

为进行各种检测，将携带含葡萄糖作为碳源的选择性培养基琼脂平板上带有荧光蛋白目的标签的25Q或72Q酵母克隆进行划线培养。同时，将携带25Q或72Q酵母优化型单体超折叠GFP的酵母进行划线培养，作为阳性对照。将平板在30摄氏度下培养两至三天。

从每块平板中挑选最多三个单菌落，接种于5毫升合成完全培养基中，培养基中添加2%葡萄糖作为碳源。将培养物在30°C条件下过夜培养。次日，将每种过夜培养物200微升转移至微量离心管中，离心以沉淀细胞。

用无菌蒸馏水至少洗涤三次。充分洗涤细胞以彻底去除残留的葡萄糖至关重要，因为葡萄糖可能抑制GAL1启动子的诱导。按照先前所示方法制备细胞，并将其重悬于含有2%半乳糖作为碳源的合成完全培养基中，以诱导polyQ融合蛋白的表达。

作为对照，将细胞重新悬浮于含葡萄糖的培养基中。将细胞置于30°C条件下，在试管旋转仪中孵育过夜。次日早晨，使用分光光度计测定各培养物在600纳米处的光密度。

在无菌的96孔板中，用100微升合成完全培养基将细胞密度调整至600 nm处的光密度值为2。通过移液枪将前一孔中的20微升样品加入到下一孔中80微升培养基中，对每个样品进行四次五倍稀释。使用酵母点样工具将细胞点样到选择性平板上，并在30摄氏度下培养两天。

使用成像记录设备对平板进行成像。为此实验准备细胞培养物，然后使用分光光度计测量每种培养物的 OD600。将细胞用培养基稀释至 OD600 为 1，总体积为 300 微升，置于 96 孔板中。

每个样品设置三个重复。将培养板放入具有振荡功能的酶标仪孵育器中孵育。设定样品数量、温度为30摄氏度、吸光度在600纳米、实验时长为24小时，检测间隔为15分钟。

选择连续振荡模式。实验结束后，使用科学绘图软件绘制生长曲线，并量化曲线下面积。将数据粘贴到包含三个重复值的 XY 表格中。

生长曲线将显示在左侧的“图表”文件夹下。要定量计算曲线下面积，请在左上角选择“分析”，然后点击XY分析中的“曲线下面积”。开始此操作前，需将制备好的细胞用生长培养基稀释10倍。

将每个样品的200微升转移至八孔成像室中。使用标准的宽场荧光显微镜对细胞进行成像。调整成像参数以进行图像采集。

由于72Q聚集体的荧光信号远强于弥散的25Q信号，通常需要对不同质粒采用不同的成像参数设置，以避免荧光信号饱和。使用合适的图像处理软件对图像进行处理。在本方案中，采用点印迹（dot blot）方法检测蛋白质表达水平。

通过向裂解缓冲液中加入终浓度为四微摩尔的苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制剂混合物，制备用于制备蛋白裂解液的缓冲液。将每种过夜培养物各5毫升通过离心收集菌体。用200微升玻璃珠和200微升裂解缓冲液重悬细胞。

涡旋30秒，共12轮，每轮之间冰浴。在4°C、12,000 ×g条件下离心10分钟，收集上清液。使用微滤装置将等量总蛋白点样至硝酸纤维素膜上。

用 PBS 预润湿膜并组装装置。将其连接至真空源，并确保拧紧螺丝。加入样品，开启真空，使样品在重力作用下通过膜过滤。

用含0.5%吐温和5%脱脂奶粉的PBS缓冲液室温封闭膜30分钟。随后将膜与抗flag一抗在4°C下孵育过夜。次日，用含0.5%吐温的PBS缓冲液洗涤膜三次，每次10分钟。

将膜在含有0.5%吐温和5%脱脂奶粉的PBS缓冲液中，与荧光标记的二抗在室温下孵育1小时。用含0.5%吐温的PBS缓冲液洗涤膜3次，每次10分钟。随后，使用氨基黑印迹成像系统对膜进行成像。

表达25Q或72Q HTT外显子一与酵母优化的单体超折叠GFP或酵母优化的单体标签BFP2融合蛋白的酵母，在葡萄糖或半乳糖培养基中过夜培养，随后点种于琼脂平板或继续在液体培养基中孵育。尽管72Q与酵母优化的单体超折叠GFP融合会引发显著的生长缺陷，但72Q与酵母优化的单体标签BFP2融合的菌株则表现出与无毒性的25Q对照组相似的生长表型，表明荧光标签的性质可能影响细胞中多聚谷氨酰胺（polyQ）扩增的行为。

通过荧光显微镜评估荧光标记的多聚谷氨酰胺（polyQ）融合蛋白的聚集情况显示，72Q酵母优化的单体超折叠GFP表现出明显的聚集，而72Q酵母优化的单体标签BFP2则呈现弥散的胞质信号，与非毒性对照25Q类似。由于不同polyQ融合蛋白的表达水平可能影响其毒性，因此进行了点印迹实验以评估蛋白表达水平。结果显示了细胞裂解液五倍梯度稀释后的结果。

请记住，该技术可用于快速比较未表征的荧光蛋白与GFP变体，但无法直接评估寡聚化状态。在完成此操作后，可进一步采取其他方法，例如在哺乳动物细胞中进行溃疡实验，以回答有关荧光蛋白是否为单体等其他问题。