Name: 近一代测序鉴定小鼠与人体抗体的分泌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 了解利用下一代测序技术分析小鼠与人体抗体库的方法。该方法通过可视化V(D)J重排模式，帮助研究人员评估疫苗效果并深入理解免疫应答机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由日本医疗研究开发机构（AMED）资助，资助编号为JP18fk0108011（KO和SI）及JP18fm0208002（TS、KO和YO），并获得日本文部科学省科研费资助（15K15159）支持（KO）。我们感谢山口沙由里和佐佐木理惠提供的宝贵技术支持。同时感谢Editage（www.editage.jp）提供英文语言编辑服务。

所有动物实验均按照机构指南进行，并获得日本国家传染病研究所动物护理和使用委员会的批准。本报告中作为代表性结果使用的健康成年志愿者外周血单个核细胞（PBMC）采样，已获得日本东京国家传染病研究所伦理委员会的批准，并使用经伦理委员会批准的表格获取了每位参与者的书面知情同意书。
1. 引物设计
<ol>
	<li>设计一种通用的cDNA正向引物，用于无偏倚地扩增免疫球蛋白mRNA，该方法类似于5'-RACE11,12 和 SMART-PCR13 技术中所采用的方法。</li>
	<li>针对免疫球蛋白VH基因的扩增，以免疫球蛋白恒定区中类别特异性的序列为反向引物8,14（图1A）。 
	注意：可根据需要在上述任一引物中添加多重标签序列，用于标记来自不同样本来源的文库分子。此外，也可根据所用试剂盒说明书添加用于巢式PCR的序列15。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>通用上游引物</td>
			<td>5'- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">小鼠免疫球蛋白的下游引物（参考文献8）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM_CH1:</td>
			<td>5'- CACCAGATTCTTATCAGACAGGGGGCTCTC -3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG1_CH1:</td>
			<td>5'- CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG -3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG2c_CH1:</td>
			<td>5'- GTACCTCCACACACAGGGGCCAGTGGATAG -3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG3_CH1:</td>
			<td>5'-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGACCAAGGGA-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgA_CH1:</td>
			<td>5'-GAATCAGGCAGCCGATTATCACGGGATCAC-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igκ_CH1:</td>
			<td>5'- GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG -3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igλ_CH1:</td>
			<td>5'- CTBGAGCTCYTCAGRGGAAGGTGGAAACA -3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">人免疫球蛋白的下游引物（参考文献14）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM_CH1:</td>
			<td>5'- GGGAATTCTCACAGGAGACG -3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG_CH1:</td>
			<td>5'- AAGACCGATGGGCCCTTG -3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgD_CH1:</td>
			<td>5'- GGGTGTCTGCACCCTGATA -3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgA_CH1:</td>
			<td>5'- GAAGACCTTGGGGCTGGT -3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgE1_CH1:</td>
			<td>5'- GAAGACGGATGGGCTCTGT -3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgE2_CH1:</td>
			<td>5'- TTGCAGCAGCGGGTCAAGGG -3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igκ_CH1:</td>
			<td>5'- TGCTCATCAGATGGCGGGAAGAT -3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igλ_CH1:</td>
			<td>5'- AGAGGAGGGCGGGAACAGAGTGA -3'</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：免疫球蛋白PCR扩增的引物序列
2. 免疫细胞和组织中的核酸分离
注意：以下步骤适用于从小鼠脾脏中提取核酸，但也可用于其他免疫组织和人类细胞，例如淋巴结或外周血单个核细胞（PBMCs）（图1B）。
<ol>
	<li>解剖组织， 例如，取8周龄C57BL/6小鼠的脾脏，通过不锈钢网筛（200至400 &#181;m) 加入 2 mL PBS 缓冲液以获得分散的细胞。将细胞悬液转移至 2.0 mL 微离心管中，在 600 × g 条件下离心 5 分钟 &#215; g 和 4 &#730;C. 弃去上清液。</li>
	<li>加入800 &#181;L ACK裂解缓冲液（150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO₃3，0.1 mM Na2将EDTA（pH 7.2）加入沉淀中，冰上孵育2分钟，以裂解组织中的红细胞。</li>
	<li>用 2 mL PBS 洗涤组织细胞 3 次，随后在 600 × g 离心 5 分钟 &#215; g 和 4 &#730;C.</li>
	<li>加入800 &#181;L 酚/硫氰酸胍试剂加入沉淀中，充分涡旋混匀，并在约 25 ℃ 下孵育 &#730;5分钟，4℃</li>
	<li>加入氯仿（200 &#181;L），手动振荡15秒，然后在约25℃下孵育2分钟 &#730;C.</li>
	<li>通过离心分离各相，12,000 × g 离心 15 分钟 &#215; g 和 25 &#730;C，并将上层水相转移至新管中。</li>
	<li>加入一倍体积的70%乙醇，短暂涡旋振荡后，将溶液加入硅胶柱中。</li>
	<li>用 30–100 μL 洗脱 RNA &#181;升水</li>
	<li>使用荧光计定量初始RNA浓度（材料表).</li>
	<li>将纯化的 RNA 储存于 -80 &#730;C.</li>
</ol>
3. cDNA 合成与 PCR 扩增
注意：下述方法基于5'-RACE11,12 和 SMART-PCR 技术13。反应的详细步骤及优化方法见试剂盒说明书15。小鼠免疫球蛋白的起始材料为步骤2.10所得样品；人免疫球蛋白的起始材料为人组织样本（例如外周血单个核细胞，PBMC），其处理方法如步骤2.3至2.10所述。
<ol>
	<li>从2到10的RNA样本中合成第一链cDNA &#181;g 总 RNA 模板，使用 5'-RACE CDS 引物（含 oligo-dT）和 SMART-PCR 寡核苷酸（材料表根据制造商的说明15.
	<ol>
		<li>对于小鼠免疫球蛋白，使用通用正向引物和免疫球蛋白类别特异性反向引物，通过高保真DNA聚合酶对cDNA进行PCR扩增（表1）。设定热循环条件为：94 &#730;C 2分钟，随后40个循环：94 &#730;C，30 秒，59 &#730;C，30 秒，72 &#730;C，持续30秒，随后在72℃进行最终延伸步骤 &#730;5 分钟，65°C 
		注意：典型的实验会扩增 IgM、IgG1、IgG2c、Igk 和 Igl 免疫球蛋白类别，以分析初始型、依赖 Th1 的和依赖 Th2 的 B 细胞（图3).</li>
		<li>对于人免疫球蛋白，执行以下操作：1st 使用通用正向引物和免疫球蛋白类别特异性反向引物进行 PCR（表1）并添加标签序列。通过2为每个样本加入索引序列nd 使用含索引序列的引物进行PCR。采用以下PCR条件和Taq DNA聚合酶：94 &#730;C，2 分钟，21 个循环（1st PCR）或 32 个循环（2nd PCR）在 94 &#730;C，30 秒，59 &#730;C，30 秒，72 &#730;C，30 秒。 
		注意：典型的实验会扩增IgM、IgD、IgG（IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）、IgA（IgA1和IgA2）、IgE、Igk和Igl免疫球蛋白类别，以检测所有B细胞群体图4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在琼脂糖凝胶上电泳PCR产物，并使用硅胶膜离心柱纯化600至800 bp的片段。
	<ol>
		<li>将3.2.1或3.2.2步骤中的样品在2%琼脂糖凝胶上进行电泳。</li>
		<li>在紫外透射仪上观察DNA条带，切取包含600至800 bp宽条带的凝胶片段。</li>
		<li>加入10 &#956;每10 mg胶块加入L膜结合溶液，混匀后于50–65℃孵育 &#176;C，直至胶块完全溶解。</li>
		<li>将凝胶溶液转移至硅胶膜离心柱中。用洗涤缓冲液洗涤一次，用50 μL洗脱液洗脱DNA。 &#956;无核酸酶水 L（材料表).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用荧光计对纯化的扩增产物进行定量，并将每个免疫球蛋白类别等量混合用于高通量测序。 
	注意：通常为 2-10 &#956;每个免疫球蛋白类别回收得到 g 扩增子 DNA。将各样品溶液按相等的 DNA 量等比例混合，以获得 50 &#956;含 10-20 ng DNA 的 L 溶液&#956;L.</li>
	<li>使用基于微毛细管电泳的DNA片段分析芯片来确定文库的大小和浓度（材料表). 将文库保存于 -20 &#176;C.</li>
</ol>
4. 文库的高通量测序
<ol>
	<li>为测序运行生成 SampleSheet.cvs 文件，指定样本名称、索引信息，并指示仅生成 .fastq 文件。</li>
	<li>解冻试剂盒（材料表）和文库。</li>
	<li>配制 0.2 N NaOH，并将文库稀释至所需摩尔浓度。</li>
	<li>清洗并干燥流动池。将 600 μL 稀释并变性的文库溶液加入试剂盒的孔中。</li>
	<li>启动测序运行。</li>
</ol>
5. NGS 数据的质量控制
<ol>
	<li>使用以下方法对 FASTQ 数据进行质量控制 &#34;FASTX-Toolkit&#34;16. 
	注意：所用参数设置的一个基本示例如下： 
	fastq_quality_trimmer -v -t 20 -l 200 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq] 
	fastq_quality_filter -v -q 20 -p 80 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq] 
	fastx_reverse_complement -v -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]</li>
	<li>格式化输出文件 &#34;fasta 核酸序列 (.fna)&#34; 通过以下命令： 
	fastq_to_fasta -v -n -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fna]</li>
</ol>
6. 从 .fna 数据中提取和分析免疫球蛋白序列
注意：示例程序在 UNIX 环境中实现。由于性能可能依赖于操作系统和硬件环境，请将其作为示例参考使用。作者不对任何错误或遗漏承担责任。编程语言 Perl17、R18 及所需模块需根据所引用网站的说明进行安装。IgBLAST 程序需根据相应网站的说明进行安装19,20。
<ol>
	<li>从 https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine 下载以下用于免疫组库分析的内部程序示例： 
	03_PipeLine_Mouse.zip；用于小鼠抗体序列分析的一组示例程序。 
	05_PipeLine_Human.zip；用于人源抗体序列分析的一组示例程序。</li>
	<li>从测序数据中提取抗体序列：使用 Perl 程序在序列数据（.fna 文件）中搜索各免疫球蛋白恒定区的特征序列，从而提取每种免疫球蛋白类别（Ig-class）的免疫球蛋白（Ig）序列（表 2）。
	<ol>
		<li>对于小鼠免疫球蛋白重链（IgH）基因，使用以下命令提取序列： 
		&#8203;$ perl 01_KzMFTIgCmgggaNtdVer3_Kz160607.pl [输入文件名] [输出文件名（后缀）]</li>
		<li>对于小鼠免疫球蛋白轻链（IgL）基因，使用以下命令提取序列： 
		&#8203;$ perl 01_KzMFTCkltNtdVer1_170810.pl [输入文件名] [输出文件名（后缀）]</li>
		<li>对于人源免疫球蛋白重链（IgH）基因，使用以下命令提取序列： 
		&#8203;$ perl 01_KzMfHuIgHCmgadeNtdVer1_Kz180312.pl [输入文件名] [输出文件名（后缀）]</li>
		<li>对于人源免疫球蛋白轻链（IgL）基因，使用以下命令提取序列： 
		$ perl 01_KzMfHuIgCkltNtd_180316.pl [输入文件名] [输出文件名（后缀）]</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注释 V(D)J 基因重排并检查其功能性： 
	注意：以下所述方法使用独立版本的 IgBLAST19 对序列中的 V(D)J 基因片段进行注释。请按照文献20 所述设置 V(D)J 基因数据库及 IgBLAST 的参数。
	<ol>
		<li>使用以下命令注释小鼠免疫球蛋白重链（IgH）基因： 
		$ igblastn -germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt -germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIghJ_NtdDb.txt -germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt -organism mouse -domain_system imgt -query ./$InFile -auxiliary_data $IGDATA/optional_file/mouse_gl.aux -show_translation -outfmt 7 >> ./$OutName</li>
		<li>使用以下命令注释小鼠免疫球蛋白轻链（IgL）基因： 
		$ igblastn -germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt -germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt -germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt -organism mouse -domain_system imgt -query ./$InFile -auxiliary_data $IGDATA/optional_file/mouse_gl.aux -show_translation -outfmt 7 >> ./$OutName</li>
		<li>使用以下命令注释人源免疫球蛋白重链（IgH）基因： 
		$ igblastn -germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt -germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIghJ_NtdDb.txt -germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt -organism human -domain_system imgt -query ./$InFile -auxiliary_data $IGDATA/optional_file/Human_gl.aux -show_translation -outfmt 7 >> ./$OutName</li>
		<li>使用以下命令注释人源免疫球蛋白轻链（IgL）基因： 
		$ igblastn -germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt -germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIgkJ_NtdDb.txt -germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt -organism human -domain_system imgt -query ./$InFile -auxiliary_data $IGDATA/optional_file/human_gl.aux -show_translation -outfmt 7 >> ./$OutName</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可视化抗体组库的整体特征。
	<ol>
		<li>使用以下命令可视化小鼠 IgH 组库： 
		$ . 00a1_3DView_MoIgH_Kz180406.sh 
		&#8203;注意：输入文件为 filename.fna（序列数据），建议使用步骤 6.2.1 的输出文件。该文件需放置于名为“filename”的下级目录（文件夹）中。在 shell 脚本的第 50 行，为 Para_4 指定“filename”。</li>
		<li>使用以下命令可视化人源 IgH 组库： 
		$ . 00a1_3DView_HuIgH_Kz180411.sh 
		&#8203;注意：输入文件为 filename.fna 序列数据，建议使用步骤 6.2.3 的输出文件。该文件需放置于名为“filename”的下级目录（文件夹）中。在 shell 脚本的第 46 行，为 Para_4 指定“filename”。</li>
		<li>使用以下命令可视化小鼠 IgL 组库： 
		$ . 00_2DViewS_MoIgL_Kz180406.sh 
		&#8203;注意：在此流程中，Igk 与 Igl 被同时处理。输入文件为 filename.fna（序列数据），建议使用步骤 6.2.2 的输出文件。该文件需放置于名为“filename”的下级目录（文件夹）中。在 shell 脚本的第 53 行，为 Para_4 指定“filename”。输出文件名以“IgKlCount.txtDim2Rpm.txt”结尾，提供二维柱状图的坐标数据（图 3，IgL）。</li>
		<li>使用以下命令可视化人源 IgL 组库： 
		$ . 00_2DView_HuIgL_Kz180319.sh 
		注意：在此流程中，Igk 与 Igl 被同时处理。输入文件为 filename.fna 序列数据，建议使用步骤 6.2.4 的输出文件。该文件需放置于名为“filename”的下级目录（文件夹）中。在 shell 脚本的第 53 行，为 Para_4 指定“filename”。输出文件名以“IgKlCount.txtDim2Rpm.txt”结尾，提供二维柱状图的坐标数据（图 4，IgL）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Schroeder, H. W. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarity+and+divergence+in+the+development+and+expression+of+the+mouse+and+human+antibody+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+%26+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">Similarity and divergence in the development and expression of the mouse and human antibody repertoires.</a> Developmental & Comparative Immunology. 30 (1-2), 119-135 (2006).</li>
<li>Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+generation+of+antibody+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic generation of antibody diversity.</a> Nature. 302 (5909), 575-581 (1983).</li>
<li>Georgiou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+and+challenge+of+high-throughput+sequencing+of+the+antibody+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The promise and challenge of high-throughput sequencing of the antibody repertoire.</a> Nature Biotechnology. 32 (2), 158-168 (2014).</li>
<li>Lees, W. D., Shepherd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+Antibody+Repertoires+with+Next-Generation+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Studying Antibody Repertoires with Next-Generation Sequencing.</a> Methods in Molecular Biology. 1526, 257-270 (2017).</li>
<li>Weinstein, J. A., Jiang, N., White, R. A. 3rd, Fisher, D. S., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+sequencing+of+the+zebrafish+antibody+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-throughput sequencing of the zebrafish antibody repertoire.</a> Science. 324 (5928), 807-810 (2009).</li>
<li>Arnaout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+description+of+antibody+heavy-chain+repertoires+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-resolution description of antibody heavy-chain repertoires in humans.</a> PLoS One. 6 (8), e22365(2011).</li>
<li>Boyd, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+variation+in+the+germline+Ig+gene+repertoire+inferred+from+variable+region+gene+rearrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Individual variation in the germline Ig gene repertoire inferred from variable region gene rearrangements.</a> Journal of Immunology. 184 (12), 6986-6992 (2010).</li>
<li>Kono, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+antigen-responding+antibody+repertoires+by+using+next-generation+sequencing+and+confirming+them+through+antibody-gene+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Deciphering antigen-responding antibody repertoires by using next-generation sequencing and confirming them through antibody-gene synthesis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 487 (2), 300-306 (2017).</li>
<li>Jiang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinism+and+stochasticity+during+maturation+of+the+zebrafish+antibody+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Determinism and stochasticity during maturation of the zebrafish antibody repertoire.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (13), 5348-5353 (2011).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distorted+antibody+repertoire+developed+in+the+absence+of+pre-B+cell+receptor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Distorted antibody repertoire developed in the absence of pre-B cell receptor formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 1411-1417 (2018).</li>
<li>Olivarius, S., Plessy, C., Carninci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+verification+of+transcriptional+starting+sites+by+Deep-RACE%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">High-throughput verification of transcriptional starting sites by Deep-RACE.</a> Biotechniques. 46 (2), 130-132 (2009).</li>
<li>Yeku, O., Frohman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+amplification+of+cDNA+ends+%28RACE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid amplification of cDNA ends (RACE).</a> Methods in Molecular Biology. 703, 107-122 (2011).</li>
<li>Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+template+switching%3A+a+SMART+approach+for+full-length+cDNA+library+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction.</a> Biotechniques. 30 (4), 892-897 (2001).</li>
<li>Vollmers, C., Sit, R. V., Weinstein, J. A., Dekker, C. L., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+measurement+of+memory+B-cell+recall+using+antibody+repertoire+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic measurement of memory B-cell recall using antibody repertoire sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13463-13468 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SMARTer+RACE+5%E2%80%99%2F3%E2%80%99+Kit+User+Manual+%28634858%2C+634859%29%22">SMARTer RACE 5’/3’ Kit User Manual (634858, 634859)</a>. , (2018).</li>
<li>FASTX-Toolkit. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> (2018).</li>
<li>Perl. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://perldoc.perl.org/">https://perldoc.perl.org/</a> (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%22">R: A language and environment for statistical computing</a>. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2016).</li>
<li>Ye, J., Ma, N., Madden, T. L., Ostell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgBLAST%3A+an+immunoglobulin+variable+domain+sequence+analysis+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">IgBLAST: an immunoglobulin variable domain sequence analysis tool.</a> Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W34-W40 (2013).</li>
<li>IgBLAST. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/faq.html">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/faq.html</a> (2018).</li>
<li>Prabakaran, P., Streaker, E., Chen, W., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((454+antibody+sequencing+-+error+characterization+and+correction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">454 antibody sequencing - error characterization and correction.</a> BMC Research Notes. 4, 404(2011).</li>
<li>Lefranc, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMGT%2C+the+international+ImMunoGeneTics+information+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">IMGT, the international ImMunoGeneTics information system.</a> Nucleic Acids Research. 37 (Database issue), D1006-D1012 (2009).</li>
<li>Alamyar, E., Duroux, P., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMGT%28%28R%29%29+tools+for+the+nucleotide+analysis+of+immunoglobulin+%28IG%29+and+T+cell+receptor+%28TR%29+V-%28D%29-J+repertoires%2C+polymorphisms%2C+and+IG+mutations%3A+IMGT%2FV-QUEST+and+IMGT%2FHighV-QUEST+for+NGS%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">IMGT((R)) tools for the nucleotide analysis of immunoglobulin (IG) and T cell receptor (TR) V-(D)-J repertoires, polymorphisms, and IG mutations: IMGT/V-QUEST and IMGT/HighV-QUEST for NGS.</a> Methods in Molecular Biology. 882, 569-604 (2012).</li>
<li>IMGT/HighV-QUEST. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.imgt.org/HighV-QUEST/login.action">http://www.imgt.org/HighV-QUEST/login.action</a> (2018).</li>
<li>Glanville, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+determination+of+the+diversity+of+a+combinatorial+antibody+library+gives+insight+into+the+human+immunoglobulin+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Precise determination of the diversity of a combinatorial antibody library gives insight into the human immunoglobulin repertoire.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (48), 20216-20221 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22rgl%3A+3D+Visualization+Using+OpenGL%22">rgl: 3D Visualization Using OpenGL</a>. , R package version 0.95.1247 (2015).</li>
<li>Hardy, R. R., Wei, C. J., Hayakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+during+development+of+VH11%2B+B+cells%3A+a+model+for+natural+autoantibody-producing+CD5%2B+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Selection during development of VH11+ B cells: a model for natural autoantibody-producing CD5+ B cells.</a> Immunological Reviews. , 60-74 (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方法利用下一代测序技术（NGS）对采用5'-RACE方法扩增的抗体RNA进行分析。与使用简并性5'-VH基因引物的方法相比，该方法使用通用正向引物可均衡地扩增每种抗体类别对应的mRNA。此外，通过使用针对抗体基因恒定区1（CH1）的反向引物，可实现对特定免疫球蛋白类别的库谱分析。这对于解析类别特异性的抗体应答，以及比较未免疫与免疫后抗体库谱具有重要意义8,9。
该方法最可能的缺陷是扩增的免疫球蛋白信息量不足。通过本方案获得的抗体库深度在很大程度上取决于步骤 3.1 和 3.2 中描述的 PCR 扩增。如果未能获得理想的库深度，强烈建议调整步骤 3.2.1 或 3.2.2 中模板 cDNA 与引物的比例。
通常，NGS 产生的抗体序列读段中约有 20% 为模糊序列21。即使采用已建立的&#34;校正方法&#34;，仍有 5–10% 的序列保持模糊3。因此，我们对序列进行了分析，并筛选出含有对应于免疫球蛋白恒定区（CμH1、Cγ1H1、Cγ2cH1 等）特征序列的原始读段。因此，体细胞高频突变的分析需要仔细审慎的评估。
该方法的一个局限性在于无法推断出免疫球蛋白重链和轻链的配对关系，因此通过该方法获得的免疫组库图谱并不完整。然而，可以通过对数据进行统计分析来近似推断出排名靠前的链对10。此外，最近已有研究报道了一种用于测序免疫球蛋白配对链的新方法3,4。
基于免疫球蛋白基因特征序列的存在，从输出的.fna数据中提取了免疫球蛋白序列。随后对V、D和J基因片段进行注释，并评估V(D)J重排的功能性。同时对互补决定区3（CDR3）序列进行了注释。这些对.fna数据中免疫球蛋白序列的系统性分析由IMGT/HighV-QUEST服务器提供支持22,23,24。然而，构建自动化处理流程具有分析大规模实验数据的优势。通过使用独立运行的IgBLAST协议19，可根据不同研究目的定制化建立分析流程。该方法需要具备基本的编程能力，但对免疫球蛋白系统的深入分析极为有用。文中所述流程即为定制化协议的示例（图2）。
抗体序列读段的数量与样本中抗体RNA的含量成正比，反映了特定时间点抗体系统的抗体组成5,8,25。本文所述方法利用R语言程序，对抗体库的V(D)J构成长远概览进行分析8,18,26。
对单个未成熟小鼠IgM抗体库的全局分析显示，其VDJ谱型相较于IgG1或IgG2c具有高度保守性8。据报道，未成熟斑马鱼的VDJ组合具有高度刻板性9。相比之下，人类的VDJ组合则被报道为高度偏倚6。未成熟B细胞中这种高度保守且具有确定性的VDJ谱型，可能由偏倚的VDJ重排或体内自身抗原介导的阴性选择所产生。例如，IGHV11-2在胎儿IgM抗体库中优先表达27，这种优势表达被认为与其对衰老红细胞的自身反应性有关27。有趣的是，在我们先前发表的未成熟IgM分析中，IGHV11-2同样是出现频率最高的主要抗体库成分8。
本文所述方法通过全面分析个体体内产生的抗体库空间，有助于解析抗原响应性抗体库，避免关键抗体库的意外遗漏8,10。该方法还可用于研究抗体网络的精细动态变化，从而加速发现针对新出现病原体的保护性抗体。

抗体系统是获得性免疫系统的基本组成部分之一。由于其具有高度的多样性、精确的抗原识别特异性以及抗原特异性B细胞的克隆扩增能力，该系统对入侵病原体具有强大的防御作用。单个个体中能够产生抗体的B细胞库估计超过1015种1。这种巨大的多样性是由免疫球蛋白基因位点中的VDJ基因重排所介导产生的2。因此，全面描述B细胞库的组成及其在抗原免疫刺激下的动态变化，虽然具有挑战性，但对于深入理解机体针对入侵病原体的抗体应答机制至关重要。
由于B细胞受体库具有极高的多样性，长期以来被视为一个“黑箱”；然而，随着高通量测序（NGS）技术的出现，人们得以深入理解其复杂性并取得突破性进展3,4。完整的抗体受体库已成功实现分析，最初在斑马鱼中完成5，随后在小鼠6和人类中也相继实现6,7。尽管NGS现已成为研究适应性免疫应答的有力工具，但针对个体动物之间抗体受体库共性与差异的基础性分析仍显不足。
据报道，在小鼠中，个体间的IgM抗体库几乎完全相同，而IgG1和IgG2c的抗体库在不同个体之间则存在显著差异8。除了V基因的使用谱型外， naive 外周B细胞中VDJ谱型的出现频率在不同个体之间也高度相似8。对VDJ区氨基酸序列的分析还显示，不同小鼠中出现相同连接序列的频率远高于此前预期8。这些结果表明，抗体库的形成机制可能是确定性的，而非随机的5,8,9。此外，小鼠抗体库发育过程也已成功通过高通量测序（NGS）进行了分析，进一步凸显了NGS在深入解析抗体免疫系统方面的潜力10。
在本报告中，我们描述了一种简单且高效的方法，用于在全局水平上可视化和分析抗体组库。

<table><tbody><tr><td>0.2 mL 离心管条</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0452</td><td>120 条</td></tr><tr><td>100 bp DNA Marker</td><td>TOYOBO</td><td>DNA-035</td><td>0.5 mL</td></tr><tr><td>2100 生物分析仪系统</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939BA /2100</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Wako</td><td>017-00256</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>琼脂糖，NuSieve GTG</td><td>Lonza</td><td>50084</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Wako</td><td>017-02995</td><td>500 g</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Wako</td><td>038-02606</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (-)&amp;ldquo;Nissui&amp;rdquo;</td><td>NISSUI&amp;nbsp;</td><td>08192</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（2NA）</td><td>Wako</td><td>345-01865</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Falcon 40 &amp;micro;m 细胞滤网</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>每箱 50 个</td></tr><tr><td>ling lock 管 1.7 mL</td><td>BM EQUIPMENT</td><td>BM-15</td><td></td></tr><tr><td>ling lock 管 2.0 mL</td><td>BM EQUIPMENT</td><td>BM-20</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 试剂盒 v2</td><td>illumina</td><td>MS-102-2003</td><td>500 个循环</td></tr><tr><td>MiSeq 系统</td><td>illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c 分光光度计&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钾</td><td>Wako</td><td>166-03275</td><td>500 g</td></tr><tr><td>PureLink RNA 小量提取试剂盒</td><td>life technologies</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 荧光计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td>500 次检测</td></tr><tr><td>SMARTer RACE 5&amp;rsquo;/3&amp;rsquo; 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Clontech&amp;nbsp;</td><td>634858</td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq Hot Start 版本&amp;nbsp;</td><td>Takara Bio Inc.&amp;nbsp;</td><td>RR006A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 碱基</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>AmbionThermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>超透明 qPCR 封口膜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0866</td><td>120 条</td></tr><tr><td>UltraPure 溴化乙锭</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV 凝胶与 PCR 产物纯化系统&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>A9282</td><td></td></tr></tbody></table>

通过下一代测序鉴定小鼠和人类抗体库

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

抗体对抗原识别的巨大适应性是获得性免疫系统的基础。尽管我们已经了解获得性免疫系统产生大量抗体库的分子机制，但至今仍无法全面掌握完整的抗体库整体图景。特别是B细胞库，由于其抗体克隆数量极为庞大，一直被视为一个“黑箱”。然而，新一代测序技术正在推动突破性进展，使我们对B细胞库的理解不断深入。本文中，我们描述了一种简单且高效的方法，用于可视化和分析单个小鼠及人类的完整抗体库。从小鼠的免疫器官（代表性地取自脾脏）和人类的外周血单个核细胞中提取总RNA，经逆转录后，采用5'-RACE方法进行扩增。利用通用的正向引物和针对抗体类别特异性恒定区的反义引物，使抗体mRNA得以均匀扩增，其比例反映了它们在抗体群体中的实际频率。扩增产物通过新一代测序（NGS）进行测序，每个免疫学样本可获得超过105条抗体序列。我们还介绍了抗体序列分析的相关方案，包括V(D)J基因片段注释、抗体库的宏观视图以及我们的计算分析方法。

小鼠的抗体组库
从小鼠的脾脏、骨髓、淋巴结或血液等细胞或组织中，可以获得小鼠抗体组库的整体图景。图3展示了来自未免疫小鼠脾脏的IgM、IgG1、IgG2c和免疫球蛋白轻链（IgL）组库的代表性结果。读段数量的汇总见表3。例如，在475,144条读段中，有166,175条包含IgM特异性标签序列（表2），其中133,371条被IgBLAST19推断为VDJ功能性产物。
图3展示了通过3D-VDJ图谱呈现的VDJ重排库谱型，其中每个球体的大小代表测序读段的相对数量，即全B细胞中抗体mRNA的数量。该三维网格由110个IGHV、12个IGHD和4个IGHJ基因构成，其排列方式反映了它们在染色体上的实际顺序。此外，由IgBLAST无法明确分配的基因序列被分别归入每个IGHV、IGHD和IGHJ基因行的末尾位置，从而在立方体结构中形成了7,215个节点。
此外，图3 展示了一个二维VJ图，显示了IgL组库中VJ重排的分布情况。图中每个条形的长度代表测序读段的相对数量。x轴代表101个IGLVκ基因和3个IGLVλ基因，y轴代表4个IGLJκ基因和3个IGLJλ基因。未注释的V基因和J基因显示在右侧边框处。
这些有效读段中负责形成大多数抗原结合特异性的互补决定区3（CDR3）序列，可在IgBLAST输出结果中获得。CDR3序列可进行统计学分析，包括生物学或技术重复样本的分析，具体方法如先前所述8,10。
人类抗体库
可以从包括外周血单个核细胞（PBMCs）或病理组织在内的多种组织中整体分析人源抗体库。图4展示了来自正常PBMCs的IgM、总IgG（IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）、总IgA（IgA1和IgA2）、IgD、IgE以及IgL库的代表性结果。表3汇总了测序读段数量。例如，在1,582,754条读段中，有90,238条包含IgM特异性特征序列，其中67,896条为VDJ功能性读段。
VDJ重排的序列库谱型显示在三维VDJ图中，其中每个球体的大小代表测序读段的相对数量，即来自全部外周血单个核细胞（PBMC）的抗体mRNA数量（图4）。该三维网格由56个IGHV、27个IGHD和6个IGHJ基因构成，按照它们在染色体上的排列顺序进行排列。此外，IgBLAST无法明确分配的基因分别在每个IGHV、IGHD和IGHJ基因行的末尾单独表示，从而在立方体中形成11,172个节点。
IgL组库中VJ重排的分布情况以二维VJ图展示，其中每个条形的长度代表测序读段的相对数量（图4）。横轴表示41个IGLVκ和32个IGLVλ基因，纵轴表示5个IGLJκ和5个IGLJλ基因。未注释的V基因和J基因显示在右侧边界处。
人类CDR3序列由IgBLAST输出提供，可按照先前所述方法进行统计分析8,10.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>免疫球蛋白类别</td>
			<td>上游引物</td>
			<td>下游引物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">小鼠免疫球蛋白重链（C57BL/6）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM</td>
			<td>AGTCAGTCCTTCCCAAATGTC</td>
			<td>GACATTTGGGAAGGACTGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG1</td>
			<td>AAAACGACACCCCCATCTGTC</td>
			<td>GACAGATGGGGGTGTCGTTTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(IgG1 变体)</td>
			<td>AAAACAACACCCCCATCAGTC</td>
			<td>GACTGATGGGGGTGTTGTTTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG2c</td>
			<td>AAAACAACAGCCCCATCGGTC</td>
			<td>GACCGATGGGGCTGTTGTTTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG3</td>
			<td>GTGATCCCGTGATAATCGGCT</td>
			<td>AGCCGATTATCACGGGATCAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgA</td>
			<td>TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG</td>
			<td>TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">小鼠免疫球蛋白轻链（C57BL/6）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igκ</td>
			<td>CTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGC</td>
			<td>GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igλ1</td>
			<td>TGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAG</td>
			<td>CTCGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGAAACA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igλ2</td>
			<td>TGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAG</td>
			<td>CTTGAGCTCCTCAGAGGAAGGTGGAAACA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igλ3</td>
			<td>TGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAG</td>
			<td>CTGGAGCTCCTCAGGGGAAGGTGGAAACA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igλ4</td>
			<td>TGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAG</td>
			<td>CTTGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGGAACA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">人免疫球蛋白重链</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM</td>
			<td>GGGAGTGCATCCGCCCCAAC</td>
			<td>GTTGGGGCGGATGCACTCCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG</td>
			<td>GCTTCCACCAAGGGCCCATC</td>
			<td>GATGGGCCCTTGGTGGAAGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgA</td>
			<td>GCATCCCCGACCAGCCCCAA</td>
			<td>GACCGATGGGGCTGTTGTTTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgD</td>
			<td>GCACCCACCAAGGCTCCGGA</td>
			<td>TCCGGAGCCTTGGTGGGTGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgE</td>
			<td>GCCTCCACACAGAGCCCATC</td>
			<td>GATGGGCTCTGTGTGGAGGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">人免疫球蛋白轻链</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igκ</td>
			<td>ACTGTGGCTGCACCATCTGC</td>
			<td>GCAGATGGTGCAGCCACAGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igλ1,2,6</td>
			<td>GTCACTCTGTTCCCGCCCTC</td>
			<td>GAGGGCGGGAACAGAGTGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igλ3,7</td>
			<td>GTCACTCTGTTCCCACCCTC</td>
			<td>GAGGGTGGGAACAGAGTGAC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：免疫球蛋白特征序列汇总

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>小鼠 IgH</td>
			<td>总读数</td>
			<td>IgM</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>IgG2c</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>输入</td>
			<td>475,144</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>含 IgC</td>
			<td></td>
			<td>166,175</td>
			<td>229,671</td>
			<td>36,628</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDJ 有效</td>
			<td></td>
			<td>133,371</td>
			<td>196,583</td>
			<td>31,446</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>小鼠 IgL</td>
			<td>总读数</td>
			<td>IgKappa</td>
			<td>IgLambda</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>输入</td>
			<td>527,668</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>含 IgC</td>
			<td></td>
			<td>178,948</td>
			<td>21,446</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VJ 有效</td>
			<td></td>
			<td>160,924</td>
			<td>16,988</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>人 IgH</td>
			<td>总读数</td>
			<td>IgM</td>
			<td>IgG</td>
			<td>IgA</td>
			<td>IgD</td>
			<td>IgE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>输入</td>
			<td>1,582,754</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>含 IgC</td>
			<td></td>
			<td>90,238</td>
			<td>5,298</td>
			<td>94,061</td>
			<td>75,549</td>
			<td>2,932</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDJ 有效</td>
			<td></td>
			<td>67,896</td>
			<td>2,775</td>
			<td>78,203</td>
			<td>56,495</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>人 IgL</td>
			<td>总读数</td>
			<td>IgKappa</td>
			<td>IgLambda</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>输入</td>
			<td>1,582,754</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>含 IgC</td>
			<td></td>
			<td>120,316</td>
			<td>64,148</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VJ 有效</td>
			<td></td>
			<td>97,169</td>
			<td>52,324</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：实验中读段数量的汇总
<img alt="基因表达分析流程；mRNA测序、PCR方法、NGS；实验示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58804/58804fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：分析单只小鼠抗体库的测序策略示意图。（A）使用通用正向引物和免疫球蛋白类别特异性反向引物，对免疫细胞或组织中的总RNA进行逆转录并进行PCR扩增。将来自每种免疫球蛋白类别的扩增产物混合后进行高通量测序。（B） 生物学重复样本（如C57BL/6小鼠的脾脏）处理如下：从脾脏样本中纯化总RNA，通过5'-RACE法使用通用引物和抗体类别特异性引物扩增cDNA，随后使用针对单只小鼠的标记引物进行高通量测序。图中部分内容经许可改编自8。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58804/58804fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="抗体测序工作流程示意图：NGS扩增子、Ig序列、VDJ、突变分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58804/58804fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：分析单只小鼠抗体库的数据处理流程示意图。 经高通量测序获得扩增子读长后，按以下步骤进行处理：（1）检查读长序列中是否存在抗体类别特异性的特征序列；（2）使用IMGT/HighV-Quest和/或IgBLAST对序列中的V、D和J基因片段进行鉴定；（3）收集包含功能性VDJ连接的序列；（4）利用这些序列对抗体库整体特征、CDR3等进行分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58804/58804fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="免疫球蛋白基因使用情况的三维散点图；IgM、IgG1、IgG2c、IgL；数据可视化图示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58804/58804fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：小鼠抗体库的全局数据可视化。 各抗体类别整体库谱通过三维VDJ图（3D-VDJ-plot）进行可视化展示。x轴表示染色体上排列顺序的110个IGHV基因，y轴和z轴分别表示12个IGHD基因和4个IGHJ基因。每个节点上球体的体积代表测序读段数量。红色球体表示未注释的V、D和J基因。IgL读段分布显示在二维VJ图（2D-VJ-plot）中，每根条形的长度代表相对读段数。x轴表示101个IGLVκ基因和3个IGLVλ基因，y轴表示4个IGLJκ基因和3个IGLJλ基因。未注释的V和J基因显示在右侧边框处。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58804/58804fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="抗体基因使用图谱；IGH 和 IGL 基因表达的三维图表；免疫球蛋白类型。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58804/58804fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：人类抗体库的全局数据可视化。 每个抗体类别总体库谱型通过三维 VDJ 图（3D-VDJ-plot）进行可视化展示。x 轴表示染色体上排列顺序的 56 个 IGHV 基因，y 轴和 z 轴分别表示 27 个 IGHD 和 6 个 IGHJ 基因。每个节点上球体的体积代表测序读段数量。红色球体：未注释的 V、D 和 J 基因。IgL 测序读段在二维 VJ 图（2D-VJ-plot）中排列展示，每条柱状图的长度代表读段的相对数量。x 轴表示 41 个 IGLVκ 和 32 个 IGLVλ 基因，y 轴表示 5 个 IGLJκ 和 5 个 IGLJλ 基因。未注释的 V 和 J 基因显示在右侧边框处。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58804/58804fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了针对完整抗体库结构与组成的分析及可视化方法。该方法涉及利用高通量测序技术获取大量抗体RNA序列。

抗体对抗原识别的巨大适应性是获得性免疫系统的基础。尽管我们对分子……

在本视频中，我们介绍一种简单且高效的方法，用于在全局水平上可视化并分析抗体库。该方法能够描述个体中完整的B细胞受体库及其在免疫刺激下发生的动态变化。此方法可应用于分析新兴病毒感染患者的病理样本，从而获得前所未有的关于感染发病机制的深入数据。该技术最具前景的应用领域之一是疫苗效果的监测。通过分析接种疫苗个体中全局抗体库的动态变化，可以评估疫苗的有效性。对于初次使用该方法的研究者，可能需要优化PCR反应条件，因为抗体基因扩增的效率取决于起始材料的类型。Fla-cher 用于鉴定免疫球蛋白扩增子。这些操作步骤的可视化演示非常重要。本次实验操作将由本实验室的技术员山口小百合（Sayuri Yamaguchi）小姐和研究生薛汉兵（Hanbing Xue）先生进行演示。开始此操作时，从一只八周龄的C57黑六小鼠中解剖获取组织，并用两毫升PBS通过不锈钢滤网研磨，以获得分散的细胞。将细胞悬液转移至一个两毫升的微量离心管中，在4摄氏度下以600 × g离心五分钟。弃去上清液，并向沉淀中加入800微升ACK裂解缓冲液。将组织置于冰上孵育两分钟，以裂解组织中的红细胞。随后，每次用三毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤组织细胞，共洗涤三次。再次在4°C条件下以600 × g离心五分钟。弃去上清液，向沉淀中加入800微升苯酚/硫氰酸胍试剂，充分涡旋振荡。在25摄氏度下孵育5分钟。然后加入200微升氯仿，手动振荡15秒。在25摄氏度下孵育两分钟。在25摄氏度、12,000 ×g条件下离心，以分离各相。将上层水相转移至新的离心管中。加入一倍体积的70%乙醇。短暂涡旋后，将此混合物加入硅胶离心柱中。用30至100微升水洗脱RNA。此后，使用荧光计测定初始 RNA 浓度。将纯化的 RNA 在 -80 摄氏度下保存。首先，根据制造商说明书，使用 5'RACE CDS 引物和 SMART-PCR 寡核苷酸，以 2 至 10 微克的总 RNA 模板合成第一条链 cDNA。对于小鼠免疫球蛋白，使用高保真DNA聚合酶，根据文本方案中所述，采用通用正向引物和免疫球蛋白类别特异性反向引物对cDNA进行PCR扩增。对于人免疫球蛋白，首先使用带有标签序列的通用正向引物和免疫球蛋白类别特异性反向引物进行第一轮PCR扩增，然后在第二轮PCR中使用带有样本索引序列的引物引入各样本的索引序列。接下来，将任一PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳。在紫外透射仪上观察DNA条带，并切下含有600至800碱基对之间宽条带的凝胶片段。每10毫克凝胶片段加入10微升膜结合溶液。混合后在50至65摄氏度下孵育，直至凝胶完全溶解。然后将凝胶溶液转移至硅胶膜离心柱中。用洗涤缓冲液洗涤柱子一次，再用50微升无核酸酶的水洗脱DNA。使用荧光计对纯化的扩增产物进行定量，并将来自每个免疫球蛋白类别的扩增产物等量混合，用于下一代测序（NGS）。随后，采用基于微毛细管的DNA片段分析芯片电泳，测定文库的大小和浓度。将文库在-20摄氏度条件下保存。首先，根据文本方案生成测序运行的示例电子表格。接着，解冻试剂盒和文库。配制 0.2 N 的氢氧化钠溶液，并将文库稀释至所需的摩尔浓度。然后，冲洗并干燥流动池，将600 µL稀释并变性的文库溶液加入试剂盒的孔中，并启动测序运行。从小鼠的脾脏、骨髓、淋巴结或血液等细胞或组织中，可以获得小鼠抗体组库的整体图景。此处展示了来自未免疫小鼠脾脏的IgM、IgG1、IgG2c和免疫球蛋白轻链组库的代表性结果。在通过三维V(D)J图展示的V(D)J重排中，每个球体的大小代表测序读段的相对数量，即代表整个B细胞中抗体mRNA的数量。该三维网格由110个免疫球蛋白重链V基因、12个免疫球蛋白重链D基因和4个免疫球蛋白重链J基因组成，这些基因的排列顺序与其在染色体上的位置相对应。二维VJ图展示了IGL组库中VJ重排的分布情况。每个条形的长度代表测序读段的相对数量。X轴代表101个免疫球蛋白轻链V-kappa基因和3个免疫球蛋白轻链V-lambda基因，Y轴代表4个免疫球蛋白轻链J-kappa基因和3个免疫球蛋白轻链J-lambda基因。可以从包括外周血单个核细胞或病理组织在内的多种组织中整体分析人抗体库。此处展示了来自正常外周血单个核细胞的IgM、总IgG、总IgA、IgD、IgE以及IgL库的代表性结果。与小鼠模型类似，V(D)J重排的库谱型显示在三维V(D)J图中，其中每个球体的大小代表相应测序读数的相对数量。该3D网格包含56个免疫球蛋白重链V基因、27个免疫球蛋白重链D基因和6个免疫球蛋白重链J基因，按其在染色体上的排列顺序进行对齐。IgL组库中VJ重排的分布情况显示在2D VJ图中，其中每个条形的长度代表测序读段的相对数量。X轴代表41个免疫球蛋白轻链V-κ基因和32个免疫球蛋白轻链V-λ基因，Y轴代表5个免疫球蛋白轻链J-κ基因和5个免疫球蛋白轻链J-λ基因。本方案的研究材料可使用经流式细胞术分选的少量细胞，甚至病理样本的冷冻切片。然而，需要仔细优化PCR条件。由于本方案产生的信息量较大，具备生物信息学知识将有助于解析抗体网络的结构。这将前所未有地促进对免疫系统的深入理解。

identification-mouse-human-antibody-repertoires-next-generation

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

近一代测序鉴定小鼠与人体抗体的分泌

本研究中，我们描述了一种改进的多重高通量抗体微阵列结合凝集素检测方法的实验方案，可用于特定蛋白质的糖基化谱分析。该方案采用了新的可靠试剂，与先前方法相比，显著缩短了实验时间，降低了成本，并减少了对实验室设备的需求。...

用于复杂样本中特定蛋白质糖基化多重高通量分析的化学封闭抗体微阵列

本文介绍一种可生成定制化抗原微阵列的方法，可用于同时检测人和小鼠血清中的IgG和IgM自身抗体。该阵列可实现针对任何目标抗原或表位的抗体高通量、定量检测。...

同时检测IgG和IgM自身抗体的双色抗原微阵列的制备

本文介绍了一种基于杂交瘤技术制备单克隆抗体的优化方案。通过免疫偶联物对小鼠进行免疫，随后利用聚乙二醇（PEG）和电脉冲将脾细胞与永生化骨髓瘤细胞进行融合。通过HAT选择培养基及抗原特异性的ELISA筛选，获得能够产生抗体的杂交瘤细胞。...

利用杂交瘤技术制备小鼠单克隆抗体

表观遗传因素可与遗传程序相互作用，从而调控基因表达并调节B细胞功能。通过结合 体外...

全基因组分析 HDAC 抑制剂对诱导 B 细胞发生类别转换 DNA 重组及浆细胞分化过程中 microRNA 和 mRNA 的调控作用

我们介绍一种从人体血液中循环的稀有B细胞出发，制备针对特定抗原的人源抗体的方法。该方法能够高效、快速地产生天然抗体，所获得的抗体可区分高度相似的抗原。...

从血液中稀有的抗原特异性B细胞高效制备具有区分能力的人源单克隆抗体

本文介绍了一种利用酶联免疫吸附试验（ELISA）在小鼠中表征T细胞依赖性和非T细胞依赖性免疫球蛋白（Ig）同种型应答的实验方案。该方法可单独使用，也可与流式细胞术联合应用，有助于研究人员鉴定小鼠在接受T细胞依赖性和非T细胞依赖性抗原免疫后，B细胞介导的Ig同种型应答的差异。...

利用酶联免疫吸附测定法表征小鼠胸腺依赖性和非胸腺依赖性免疫球蛋白同种型应答

本文介绍了一种在化学成分明确的条件下将人诱导性多能干细胞分化为每种体节衍生物（肌节、生骨节、生皮节和生腱节）的实验方案，该方法在未来骨科手术的疾病建模和细胞治疗中具有应用价值。...

由人诱导性多能干细胞体外生成体节衍生物

通过流式细胞术结合单细胞PCR与克隆技术，BSelex方法可用于从人外周血单个核细胞中鉴定并回收特异性抗原抗体。...

从富集的人类记忆B细胞群体中筛选和回收具有理想特异性的抗体的单细胞筛选方法

本文介绍了一种多重化的单细胞mRNA测序方法，用于分析小鼠胚胎组织中的基因表达。基于微滴的单细胞mRNA测序（scRNA-Seq）方法结合多重化策略，可同时对来自多个样本的单细胞进行分析，显著降低了试剂成本，并最大限度地减少了实验批次效应。...

小鼠胚胎细胞多重单细胞mRNA测序分析

本方案描述了从血液样本和肠道活检组织中提取DNA，构建用于高通量测序的TCRβ和IGH...

使用下一代测序技术进行T细胞和B细胞受体免疫组库分析

本文介绍了一种从小鼠和人类细胞系中纯化MHC...

免疫肽组学：小鼠和人类MHC I类和II类相关肽段的分离及其质谱分析

了解利用下一代测序技术分析小鼠与人体抗体库的方法。该方法通过可视化V(D)J重排模式，帮助研究人员评估疫苗效果并深入理解免疫应答机制。

通过下一代测序鉴定小鼠和人类抗体库

探索更多视频