通过下一代测序鉴定小鼠和人类抗体库

在本视频中，我们介绍一种简单且高效的方法，用于在全局水平上可视化并分析抗体库。该方法能够描述个体中完整的B细胞受体库及其在免疫刺激下发生的动态变化。此方法可应用于分析新兴病毒感染患者的病理样本，从而获得前所未有的关于感染发病机制的深入数据。

该技术最具前景的应用领域之一是疫苗效果的监测。通过分析接种疫苗个体中全局抗体库的动态变化，可以评估疫苗的有效性。对于初次使用该方法的研究者，可能需要优化PCR反应条件，因为抗体基因扩增的效率取决于起始材料的类型。

Fla-cher 用于鉴定免疫球蛋白扩增子。这些操作步骤的可视化演示非常重要。本次实验操作将由本实验室的技术员山口小百合（Sayuri Yamaguchi）小姐和研究生薛汉兵（Hanbing Xue）先生进行演示。

开始此操作时，从一只八周龄的C57黑六小鼠中解剖获取组织，并用两毫升PBS通过不锈钢滤网研磨，以获得分散的细胞。将细胞悬液转移至一个两毫升的微量离心管中，在4摄氏度下以600 × g离心五分钟。弃去上清液，并向沉淀中加入800微升ACK裂解缓冲液。

将组织置于冰上孵育两分钟，以裂解组织中的红细胞。随后，每次用三毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤组织细胞，共洗涤三次。再次在4°C条件下以600 × g离心五分钟。

弃去上清液，向沉淀中加入800微升苯酚/硫氰酸胍试剂，充分涡旋振荡。在25摄氏度下孵育5分钟。然后加入200微升氯仿，手动振荡15秒。

在25摄氏度下孵育两分钟。在25摄氏度、12,000 ×g条件下离心，以分离各相。将上层水相转移至新的离心管中。

加入一倍体积的70%乙醇。短暂涡旋后，将此混合物加入硅胶离心柱中。用30至100微升水洗脱RNA。

此后，使用荧光计测定初始 RNA 浓度。将纯化的 RNA 在 -80 摄氏度下保存。首先，根据制造商说明书，使用 5'RACE CDS 引物和 SMART-PCR 寡核苷酸，以 2 至 10 微克的总 RNA 模板合成第一条链 cDNA。

对于小鼠免疫球蛋白，使用高保真DNA聚合酶，根据文本方案中所述，采用通用正向引物和免疫球蛋白类别特异性反向引物对cDNA进行PCR扩增。对于人免疫球蛋白，首先使用带有标签序列的通用正向引物和免疫球蛋白类别特异性反向引物进行第一轮PCR扩增，然后在第二轮PCR中使用带有样本索引序列的引物引入各样本的索引序列。

接下来，将任一PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳。在紫外透射仪上观察DNA条带，并切下含有600至800碱基对之间宽条带的凝胶片段。每10毫克凝胶片段加入10微升膜结合溶液。

混合后在50至65摄氏度下孵育，直至凝胶完全溶解。然后将凝胶溶液转移至硅胶膜离心柱中。用洗涤缓冲液洗涤柱子一次，再用50微升无核酸酶的水洗脱DNA。

使用荧光计对纯化的扩增产物进行定量，并将来自每个免疫球蛋白类别的扩增产物等量混合，用于下一代测序（NGS）。随后，采用基于微毛细管的DNA片段分析芯片电泳，测定文库的大小和浓度。将文库在-20摄氏度条件下保存。

首先，根据文本方案生成测序运行的示例电子表格。接着，解冻试剂盒和文库。配制 0.2 N 的氢氧化钠溶液，并将文库稀释至所需的摩尔浓度。

然后，冲洗并干燥流动池，将600 µL稀释并变性的文库溶液加入试剂盒的孔中，并启动测序运行。从小鼠的脾脏、骨髓、淋巴结或血液等细胞或组织中，可以获得小鼠抗体组库的整体图景。此处展示了来自未免疫小鼠脾脏的IgM、IgG1、IgG2c和免疫球蛋白轻链组库的代表性结果。

在通过三维V(D)J图展示的V(D)J重排中，每个球体的大小代表测序读段的相对数量，即代表整个B细胞中抗体mRNA的数量。该三维网格由110个免疫球蛋白重链V基因、12个免疫球蛋白重链D基因和4个免疫球蛋白重链J基因组成，这些基因的排列顺序与其在染色体上的位置相对应。

二维VJ图展示了IGL组库中VJ重排的分布情况。每个条形的长度代表测序读段的相对数量。X轴代表101个免疫球蛋白轻链V-kappa基因和3个免疫球蛋白轻链V-lambda基因，Y轴代表4个免疫球蛋白轻链J-kappa基因和3个免疫球蛋白轻链J-lambda基因。

可以从包括外周血单个核细胞或病理组织在内的多种组织中整体分析人抗体库。此处展示了来自正常外周血单个核细胞的IgM、总IgG、总IgA、IgD、IgE以及IgL库的代表性结果。与小鼠模型类似，V(D)J重排的库谱型显示在三维V(D)J图中，其中每个球体的大小代表相应测序读数的相对数量。

该3D网格包含56个免疫球蛋白重链V基因、27个免疫球蛋白重链D基因和6个免疫球蛋白重链J基因，按其在染色体上的排列顺序进行对齐。IgL组库中VJ重排的分布情况显示在2D VJ图中，其中每个条形的长度代表测序读段的相对数量。X轴代表41个免疫球蛋白轻链V-κ基因和32个免疫球蛋白轻链V-λ基因，Y轴代表5个免疫球蛋白轻链J-κ基因和5个免疫球蛋白轻链J-λ基因。

本方案的研究材料可使用经流式细胞术分选的少量细胞，甚至病理样本的冷冻切片。然而，需要仔细优化PCR条件。由于本方案产生的信息量较大，具备生物信息学知识将有助于解析抗体网络的结构。

这将前所未有地促进对免疫系统的深入理解。