Name: 一种中脑动脉闭塞技术在大鼠脑卒中后抑郁中的诱导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 38 s
Description: 了解中脑动脉闭塞技术在大鼠脑卒中后抑郁模型中的应用。该方法通过行为学测试评估抑郁状态，减少实验变异性并降低并发症发生率，为神经科学研究提供可靠的动物模型。

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我们感谢乌克兰第聂伯罗大学生物、生态与医学系生理学教研室的 Olena Severynovska 教授在讨论中给予的支持和有益的贡献。所获得的数据是 R.K. 博士论文的一部分。

以色列内盖夫本-古里安大学动物护理委员会批准了本方案中使用的所有处理和测试程序。
1. 实验操作用大鼠的准备
注意：选择体重为 300–350 g 的成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠。
<ol>
	<li>将大鼠每笼四只饲养于温度22 °C、湿度40%的动物房中，采用12小时颠倒光照周期（上午8:00关灯），并可自由获取食物和饮水。</li>
	<li>将大鼠随机分为两组，即MCAO组（N = 24）和假手术组（Sham组，N = 19）。</li>
</ol>
2. 大鼠手术前准备
<ol>
	<li>为准备大鼠进行改良的MCAO手术，将每只大鼠置于诱导室中，使用异氟烷混合气体（诱导浓度4%，手术期间2%，维持浓度1.3%）与24%氧气（流速2 L/min）麻醉30分钟，并使其自主呼吸29,30。 
	注意：&#160;使用钝头镊子夹捏大鼠脚趾间皮肤和/或脚垫，刺激其足底回缩反射。&#160;当该反射消失时，表明麻醉深度已足够。</li>
	<li>使用加热板将大鼠的核心体温维持在37 °C。</li>
	<li>在开始手术操作前，通过插入大鼠直肠的探头测量所有大鼠的体温。</li>
	<li>保持所有大鼠体温恒定（37 °C），以尽量减少低温对神经功能结局及神经损伤的影响。</li>
	<li>当动物处于准备台时，为其双眼涂抹人工泪液软膏。</li>
	<li>剃除每只大鼠颈部的毛发，并用70%酒精氯己定溶液（70%酒精和0.5%葡萄糖酸氯己定）对皮肤进行消毒。重复消毒步骤共三次。&#160;</li>
	<li>用无菌手术巾覆盖大鼠。</li>
</ol>
3. 手术（大脑中动脉阻塞技术）
注意：按照 Boyko 等人28 描述的方法进行手术，并使用 McGarry 等人29 和 Uluç 等人30 提供的器械。
<ol>
	<li>行腹侧正中切口，并解剖浅筋膜。</li>
	<li>在三个三角形肌肉（胸骨舌骨肌、二腹肌和胸锁乳突肌）之间仔细进行锐性与钝性分离，以辨认颈动脉（颈外动脉、颈内动脉及颈总动脉[CCA]）。</li>
	<li>仔细分离并暴露右侧颈总动脉（CCA）和颈内动脉（ICA）。</li>
	<li>将右侧颈总动脉（CCA）和颈内动脉（ICA）与迷走神经分离。 
	注意：按照步骤3.2所述识别颈动脉后，颈内动脉（ICA）可被确认为颈总动脉（CCA）分叉后的两个分支之一，与颈外动脉（ECA）并列。</li>
	<li>将一根导管（热钝化或硅胶包被的4-0尼龙单丝）直接经颈内动脉（ICA）插入，从右侧颈总动脉（CCA）分叉处起约18.5–19 mm，直至进入大脑动脉环（Willis环），遇到轻微阻力时停止，以阻塞大脑中动脉（MCA）。 
	注意：热钝化单丝和硅胶包被的4-0尼龙单丝作用相同，近年来更受青睐，因其闭塞效果优于普通尼龙线28,30。</li>
	<li>在右侧颈总动脉（CCA）（翼腭动脉）分叉点上方的颈内动脉（ICA）处，用4-0丝线结扎，永久性阻断导丝插入点近端的颈内动脉（ICA），而远端则暂时阻断。</li>
	<li>在颈内动脉（ICA）周围结扎，固定导丝处的丝线结，以防止出血。</li>
	<li>假手术组大鼠接受与大脑中动脉闭塞（MCAO）组相同的外科操作，但插入尼龙线代替28。 
	注意：尼龙线与硅胶包被尼龙线均可闭塞颈内动脉（ICA），但效果不如后者。</li>
	<li>大脑中动脉（MCA）闭塞后，缝合大鼠颈部切口，关闭麻醉，将大鼠置于孵育箱中观察，直至其苏醒。 
	注意：近端结扎的目的是闭塞颈内动脉（ICA），附加的远端结扎则用于减少导丝周围出血并固定导丝位置。此外，大鼠在切口缝合后数分钟内应恢复意识。</li>
</ol>
4. 术后恢复
<ol>
	<li>手术后立即向每只大鼠腹腔注射 5 mL 0.9% 生理盐水溶液，以防止脱水。</li>
	<li>术后第一天无条件给予镇痛治疗；皮下注射美洛昔康 1 mg/kg，每 24 小时一次。&#160;对于术后前 3 天内出现疼痛症状的大鼠，给予稀释的二吡咯烷（0.5 g 溶于 400 mL 饮用水中）。</li>
	<li>对发生癫痫发作的大鼠实施安乐死（癫痫发作由脑水肿或脑出血引起的颅内压升高所致28）。</li>
</ol>
5. 神经系统严重程度评分31
注意：该操作由两名不参与手术过程的观察者执行；他们检测神经功能缺损，并对运动功能缺损进行评分，累积评分为0-4分32。该评分可在不同时间点进行；在本项研究中，分别于术后50分钟、24小时、7天、15天和30天进行评估。以下为NSS评分的评估步骤。尽管在此情况下并非必需，但该评分可用于确认啮齿类动物是否发生脑卒中，从而决定是否给予治疗。
<ol>
	<li>将大鼠置于陶瓷地面上，使其自由活动1分钟。</li>
	<li>轻轻抓住大鼠尾巴向后牵拉，并按以下标准进行评分。
	<ol>
		<li>无神经功能缺损者评分为0分。</li>
		<li>前肢屈曲者评分为1分。</li>
		<li>对侧前肢握力减弱者评分为2分。</li>
		<li>牵拉尾巴时向偏瘫侧转圈者评分为3分。</li>
		<li>出现自发性转圈者评分为4分32。 
		注意：若观察到多种反应，应以评分较高的动作为准。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 梗死体积的测定（组织学检查）
<ol>
	<li>梗死体积的测量 
	注意：按照先前所述方法进行此操作33,34。在再灌注后24小时，使用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法测定脑梗死体积。
	<ol>
		<li>在最后一次NSS后24小时，将每组五只大鼠置于诱导室中，通过过量异氟烷暴露实施安乐死。</li>
		<li>将大鼠断头，并使用小剪刀和镊子迅速分离其脑组织。</li>
		<li>用0.9%生理盐水清洗分离出的脑组织。</li>
		<li>检查脑组织上的出血点，排除在Willis环处发生蛛网膜下腔出血的大鼠。</li>
		<li>将每个脑组织放置在置于-20 °C冰袋上的洁净玻璃载片上，随后放入-20 °C冰箱中5分钟，以便于切片。</li>
		<li>将带有脑组织的玻璃载片从-20 °C冰箱中取出，重新放回-20 °C冰袋上，使用刀片和镊子切除额极和小脑部分。</li>
		<li>用刀片将脑组织水平切成2 mm厚的切片，共获得六片。</li>
		<li>在动物处死前，将1.25 g TTC粉末溶于500 mL生理盐水中，配制成0.05% TTC溶液，转移至用铝箔包裹的24孔板（每孔1 mL），并在4 °C下保存。 
		注意： TTC及其染色组织对光敏感。</li>
		<li>使用镊子将脑切片转移至含有TTC溶液的24孔板中（每孔一片），并在溶液中将切片展平。</li>
		<li>将24孔板置于37 °C水浴中孵育30分钟。</li>
		<li>用移液器吸除孔板中的TTC溶液，用脑组织清洗液洗涤切片，并在室温下继续孵育30分钟。</li>
		<li>将切片按切割顺序排列在实验室玻璃片上，使用扫描仪观察各片段。</li>
		<li>基于视觉识别，使用ImageJ分析软件将梗死面积计算为整个脑切片面积的百分比。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>梗死体积的分析35
	<ol>
		<li>使用标准图像分析软件（ImageJ）定量梗死体积，并将梗死脑体积分析为全脑大小的百分比33。</li>
		<li>将脑切片放置在玻璃显微镜载片上，使用光学扫描仪以高分辨率（1,600 x 1,600 dpi）进行扫描，以供充分分析。</li>
		<li>裁剪图像，并利用扫描图像中包含的公制尺对所有图像进行比例标准化。</li>
		<li>使用ImageJ 1.37v软件中的 Wand（追踪）工具和自由手选工具，测量连续六片2 mm冠状切片中苍白区域的面积36。</li>
		<li>使用以下公式计算间接梗死体积37。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 脑水肿的测量38
注意：在最后一次MCAO后24小时测量脑水肿。若动物出现严重神经功能缺损，导致进食和/或饮水困难持续至少三天，体重减轻超过20%，偏瘫或癫痫发作，应实施安乐死。
<ol>
	<li>通过冠状切片区域的累加，以任意单位（像素）计算左右半球的体积，评估右半球水肿的程度。 
	注意：使用 ImageJ 1.37v 软件进行该计算，光学扫描分辨率为 1,600 × 1,600 dpi。选定感兴趣区域后，使用 分析 菜单中的 测量 功能。本研究中使用了宏命令。</li>
	<li>将脑水肿面积表示为未受累对侧半球标准面积的百分比。</li>
	<li>使用先前建立的公式39计算肿胀程度。</li>
</ol>
8. 行为范式
<ol>
	<li>术后第30至33天，在封闭、安静且光照可控的房间内进行行为学测试。</li>
	<li>指派对所有实验操作均不知情的研究人员，使用 commercially available program（商业可得程序）对所有行为学测试进行录像。</li>
	<li>蔗糖偏好实验40,41
	<ol>
		<li>将大鼠置于单独的笼子中，放置于其日常饲养环境相同的房间内，并在黑暗周期期间进行操作。</li>
		<li>接下来24小时，在每只待测大鼠的笼内放置一瓶100 mL的1% (w/v) 蔗糖溶液，使其适应该溶液。</li>
		<li>24小时后，通过移除水瓶，对大鼠禁食禁水12小时。</li>
		<li>12小时后，在每个笼内放置两瓶液体，持续4小时：一瓶含100 mL自来水，另一瓶含100 mL 1% (w/v) 蔗糖溶液。</li>
		<li>记录大鼠消耗的蔗糖溶液和水的体积（单位：mL），并按如下方式计算蔗糖偏好率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Porsolt强迫游泳实验42 
	注意： Porsolt强迫游泳实验的操作方法参照Zeldetz等40和Boyko等42先前发表的实验方案。该实验的基本原理是：当大鼠被强制置于一个无法逃脱的有限水域中游泳时，最终会进入静止状态，停止任何逃离水体的尝试43,44。本实验在黑暗周期期间于另一房间进行。
	<ol>
		<li>将每只大鼠放入一个垂直的聚甲基丙烯酸甲酯圆柱形容器中（高度：100 cm；直径：40 cm），容器中盛有80 cm深、温度为25 °C的水，适应15分钟。</li>
		<li>取出大鼠，放入加热的隔离箱（32 °C）中干燥15分钟。</li>
		<li>将大鼠放回其原来的笼子中。</li>
		<li>24小时后重复步骤8.4.1，此次用于正式测试，持续5分钟。</li>
		<li>对5分钟测试过程进行录像，并计算该期间内大鼠静止状态的总持续时间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究中所展示的MCAO技术相较于原始MCAO模型更安全的一个方面在于：通过颈内动脉（ICA）阻塞大脑中动脉（MCA）时，颈外动脉（ECA）及其分支（包括枕动脉、终末舌动脉和上颌动脉）的血流未受损害。原始MCAO模型需在远端分离并凝固ECA及其分支46，这会破坏咀嚼肌的血液供应，导致咀嚼功能受损47。肌肉组织的损伤最终可能引发额外的计算流体动力学变化。与原始MCAO技术通过ECA入路到达MCA不同，本文所述技术针对脑卒中模型进行了改良，可避免ECA及其属支发生血流中断。
与原始MCAO模型相比，选择新型MCAO模型的最重要依据在于其能够显著降低脑水肿、梗死体积和体重变化的变异性，并减少与MCAO相关的死亡率。MCAO手术中的死亡率是一个重要因素48；20%的死亡率被认为是可接受的49,50。本研究中的死亡率（原始MCAO为2...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/58875">A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats</a>. The Authors section was updated.
One of the author names was updated from:
Dmitri Frank
to
Dmitry Frank

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/58875">A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats</a>. The Authors section was updated.

Erratum: A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats

脑卒中是美国致死性疾病中的第四大原因1,2,3，同时在发达国家中，它是导致成人残疾的首要原因4，这使得脑卒中成为全球最重大健康问题之一。脑卒中幸存患者恢复正常的极为罕见，约有15%–40%的幸存者会遭受永久性残疾，20%的患者在脑卒中发病后3个月需要机构照护5，约三分之一的6个月幸存者需要他人协助才能维持日常生活6。据报道，脑卒中还导致了国家卫生支出的不断上升7。根据美国心脏协会的估算，2010年美国与脑卒中相关的费用已超过500亿美元8。
卒中不仅会导致个体的长期损害，一些幸存者还常出现情感和行为障碍，如痴呆、疲劳、焦虑、抑郁、谵妄和攻击行为9,10,11,12,13,14。卒中后最常见的心理后遗症是卒中后抑郁（PSD），约40%–50%的幸存者被诊断出患有此症15,16,17。卒中引发的抑郁会增加发病率和死亡率18,19,20,21,22。PSD 的病理生理机制尚未完全明确，但显然由多种因素引起，并与功能障碍、认知损害及病灶部位相关23。
通过大脑中动脉阻塞（MCAO）建立的局灶性脑缺血大鼠模型是目前最广泛使用的脑卒中动物模型24,25,26,27。为展示通过颈内动脉（ICA）阻塞大脑中动脉（MCA）诱导大鼠发生卒中后抑郁（PSD），本研究采用可降低死亡率并减少MCAO模型变异性的技术28。
本方案的主要目的是介绍通过颈内动脉（ICA）阻塞大脑中动脉（MCA）以在大鼠中诱导卒中后抑郁（PSD）的操作步骤，这是一种改良的大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，可降低死亡率并减少结果的变异性28。具体目标包括进行神经功能和组织学检查（测定神经功能缺损评分[NSS]、梗死区域体积和脑水肿），以验证MCAO模型的有效性，并通过行为学测试评估该MCAO操作对情绪障碍（主要是PSD）发生发展的影响。

<table><tbody><tr><td>吸收垫</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>黑色无光泽有机玻璃箱</td><td>-</td><td>-</td><td>（120 cm &amp;times; 60 cm &amp;times; 60 cm），分为25%的中央区域和周围的边缘区域</td></tr><tr><td>瓶子</td><td>Techniplast</td><td>ACBT0262SU</td><td>150 mL 瓶子，装有 100 mL 水和 100 mL 1%（w/v）蔗糖溶液</td></tr><tr><td>电刺激装置</td><td>Heat System Ultasonic Inc.</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Horizon-XL</td><td>Mennen Medical Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>成像系统</td><td>Kodak</td><td>-</td><td>用于成像和定量分析</td></tr><tr><td>单丝纤维</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>纸巾</td><td>药房</td><td>-</td><td>干燥纸巾，用于将大鼠从水中取出后擦干体表</td></tr><tr><td>有机玻璃圆筒</td><td>-</td><td>-</td><td>高100 cm、直径40 cm的圆筒，用于进行强迫游泳实验</td></tr><tr><td>Purina Chow</td><td>Purina</td><td>5001</td><td>啮齿类动物实验室饲料，适用于大鼠、小鼠和仓鼠，是一种生命周期营养配方，已在生物医学研究中使用超过50年。本实验中大鼠可自由摄取</td></tr><tr><td>大鼠笼具</td><td>Techniplast</td><td>2000P</td><td>常规啮齿类动物饲养笼具，本实验全程用于大鼠的饲养</td></tr><tr><td>扫描仪&amp;nbsp;</td><td>Canon CanoScan</td><td>4200F</td><td>-</td></tr><tr><td>摄像机</td><td>ETHO-VISION (Noldus)</td><td>-</td><td>数字摄像机，用于在开放场实验中高清记录大鼠行为</td></tr></tbody></table>

一种用于诱导大鼠卒中后抑郁的中动脉闭塞技术

A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats

卒中后抑郁（PSD）是缺血性卒中所导致的所有精神并发症中最为常见的一种。约60%的缺血性卒中患者会经历PSD，该疾病被认为是与缺血性卒中相关、导致死亡率升高及健康状况恶化的前兆因素。PSD的病理生理机制目前尚不明确。为了进一步研究PSD的发生与发展机制，并探索可能的治疗方法，我们尝试建立一种新的实验方案，即通过颈内动脉（ICA）阻塞大鼠的中动脉（MCA）。本方案描述了一种通过中动脉闭塞（MCAO）在大鼠中诱导PSD的动物模型。实验中还采用了Porsolt强迫游泳实验和蔗糖偏好实验，以确认并评估受试大鼠的抑郁样情绪状态。与原始方法中通过颈外动脉（ECA）插入导管不同，该MCAO技术使单丝线直接经由ICA进入。该MCAO技术数年前被开发，具有降低死亡率和减少实验变异性的优势。目前普遍认为，生物模型的选择应依据既定的标准进行。本方案获得的数据表明，该MCAO模型可用于在大鼠中诱导PSD，有望促进对PSD病理生理机制的理解，并为未来新药及其他神经保护剂的研发提供途径。

组织学结果（表1）显示，与假手术对照组动物相比，MCAO术后脑梗死体积占总脑体积的百分比具有统计学显著性（p &lt; 0.0001）。此外，实验组与假手术对照组相比，脑水肿也具有统计学显著性（p &lt; 0.0003）。
如表2所示，经Mann-Whitney检验，实验组（MCAO）的NSS评分显著低于假手术对照组，神经功能表现更差：50分钟时p &lt; 0.001，24小时时p &lt; 0.05，7天时p &lt; 0.05。
蔗糖偏好评估结果显示，与假手术组大鼠相比，MCAO大鼠摄入的蔗糖量显著减少（p &lt; 0.0001，<strong cl...

本文介绍了一种通过颈内动脉阻塞大脑中动脉以在大鼠中诱导卒中后抑郁的实验方案。我们采用Porsolt强迫游泳实验和蔗糖偏好实验来确认并评估所诱导的抑郁情绪状态。

卒中后抑郁（PSD）是缺血性卒中后最常见的精神系统并发症。大多数患者（约60%）……

本方案提出了一种新的大鼠大脑中动脉阻断技术，旨在帮助研究卒中后抑郁发生机制，并寻找更有效的治疗方法。该技术的主要优势在于能够减少体重变化、脑水肿和梗死体积的变异性，并最大限度地降低与操作相关的死亡率。在确认一只300至350克重的雄性Sprague Dawley大鼠对尾部夹捏刺激无反应后，将动物置于37摄氏度的加热板上，并使用直肠探头监测其核心体温。将药膏涂抹于动物的眼睛，并剃除颈部的毛发。然后，用70%酒精氯己定对暴露的皮肤进行消毒，在执行闭塞操作前，用无菌手术单覆盖大鼠。为获得神经功能缺损评分，将闭塞后的大鼠置于平坦表面，让动物自由活动。一分钟后，轻轻抓住大鼠尾巴将其向后拉，评估动物的步态反应。为测量梗死体积，将制备好的染色脑切片以每英寸1,600 × 1,600点的分辨率进行扫描，并对所有图像进行裁剪并统一标尺。随后，将标准化后的图像导入合适的图像分析软件，使用描记工具测量连续六个2毫米切片中苍白区域的面积，以占整个脑切片面积的百分比来确定梗死大小。术后30至33天，将动物转移至封闭、安静且光照可控的房间，单笼饲养，并在每个笼子中放置含有100毫升1%蔗糖溶液的瓶子，持续24小时。次日，移除瓶子以及食物和饮用水，禁食禁水12小时。剥夺期结束后，在每个笼子中分别放置一瓶100毫升1%蔗糖溶液和一瓶100毫升自来水，持续4小时。然后，记录每只动物消耗的蔗糖溶液和水的体积，以便计算其对蔗糖的偏好程度。在手术后30至33天进行Porsolt强迫游泳实验时，首先将每只大鼠放入一个垂直的有机玻璃圆筒中，圆筒内装有80厘米深、25摄氏度的水，持续15分钟。在适应期结束后，将大鼠转移到32摄氏度的加热环境中干燥15分钟，然后将其放回原饲养笼中。第二天，将大鼠放回圆筒中进行最后五分钟的测试，记录这五分钟的视频，以便计算该时间段内静止不动的总持续时间。组织学分析显示，与假手术对照组动物相比，MCAO术后实验动物的脑梗死体积占总脑体积的百分比具有统计学意义。与假手术对照组相比，实验动物还表现出具有统计学意义的脑水肿。与假手术动物相比，MCAO 动物在术后 50 分钟、24 小时和 7 天时表现出较低的神经功能评分。MCAO 大鼠的蔗糖摄入量也显著减少，并在 Porsalt 强迫游泳实验中表现出更长的不动时间。该模型是行为学卒中研究的重要工具，可用于评估未来疗法，或为治疗性物质的疗效提供关键的临床前数据。

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行为

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在大鼠中通过手术诱导缺血性脑损伤是卒中研究中广泛应用的模型。本文展示了通过阻断大脑中动脉诱导局灶性脑缺血的方法。同时展示了通过组织学染色和磁共振成像对所形成的梗死区域进行可视化。...

大鼠大脑中动脉线栓法内血管闭塞局灶性脑缺血模型

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通过大脑中动脉与颈总动脉阻断在大鼠模型中诱导缺血

来源：Larpthaveesarp, A.，等．P10大鼠新生期卒中短暂性大脑中动脉闭塞模型．J. Vis. Exp.

在幼年大鼠中建立大脑中动脉阻塞以诱导局灶性脑缺血

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在老年大鼠中实施永久性远端大脑中动脉联合颈总动脉闭塞以研究伴有持续性功能障碍的皮层缺血

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采用远端中动脉阻塞技术诱导小鼠急性缺血性脑卒中

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改良四血管阻塞法诱导的脑缺血昏迷模型

本方案描述了通过结合大脑中动脉闭塞（MCAO）与慢性轻度应激、行为束缚及隔离饲养，建立卒中后抑郁（PSD）大鼠模型的方法，并利用行为学测试评估益脑解郁方（YNJYP）的治疗效果。...

益脑解郁方对大脑中动脉阻塞联合行为束缚诱导的大鼠卒中后抑郁的影响

本研究的目的是建立一种可重复的方法，用于在大鼠中实施开颅术，随后进行永久性、选择性大脑中动脉阻塞，以应用于运动和空间记忆缺陷的实验研究。...

大鼠大脑中动脉选择性永久性阻塞：研究运动与空间记忆障碍的实验方法

了解中脑动脉闭塞技术在大鼠脑卒中后抑郁模型中的应用。该方法通过行为学测试评估抑郁状态，减少实验变异性并降低并发症发生率，为神经科学研究提供可靠的动物模型。

一种用于诱导大鼠卒中后抑郁的中动脉闭塞技术

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